顱腦損傷患者miR-124水平變化及其對預后的預測價值分析*

王上橋，孫占玉，吳運橋，梁定興

海南西部中心醫院神經外科，海南儋州 571700

目前顱腦損傷(TBI)已成全球公共衛生問題之一，其病情危急、致殘及致死率高，其中致殘率、致死率位居各類創傷首位，是人類第三大致死病因[1]。臨床上主要通過磁共振及擴展格拉斯哥結局量表(GOS-E)[2]評估TBI病情，但前者僅可評價病情無法直觀描述病情進展，而GOS-E存在一定主觀性，亦無法提供客觀評估依據。盡管當前也有較多研究從血清學層面入手評估TBI患者病情轉歸，但鑒于此疾病轉歸機制復雜，仍無有效預測機制。因此，積極探索TBI患者損傷程度及預后評估機制仍是臨床研究重點、熱點之一。微小RNA(miRNA)是廣泛分布在機體內的一種非編碼微小核糖核酸，其不僅參與機體代謝、細胞增殖分化等多種生物過程，且具有相對穩定性及組織特異性等特征[3]。miR-124是一種神經系統特異性miRNA，約占大腦皮質總miRNA的25%～48%[4]。研究證實，腦損傷大鼠血miR-124水平增加，提示其可能參與損傷后神經修復等生理病理過程[5]。但TBI患者miR-124水平及其對預后的預測價值如何尚無定論，本研究擬為臨床完善相關預警機制提供參考。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年5月至2021年8月本院收治的108例TBI患者作為研究對象，其中72例作為訓練組，36例作為驗證組。另選取同期36例健康體檢者作為對照組。納入標準：(1)訓練組及驗證組有明確頭部外傷史，符合TBI診斷標準[6]；(2)訓練組及驗證組傷后入院時間不足12 h；(3)訓練組及驗證組傷前營養狀況良好；(4)對照組身體健康，無創傷史及臟器病變。排除標準：(1)傷前存在感染者；(2)有既往顱腦損傷史；(3)腫瘤患者；(4)存在嚴重心、肝、腎等系統疾病者。本研究經醫學倫理委員會審批通過(批號：20190424145)。所有研究對象知情研究內容，并簽署同意書。

訓練組中男42例，女30例；年齡28～57歲，平均(41.89±5.78)歲；體質量指數18～26 kg/m2，平均(22.26±1.33)kg/m2；合并高血壓11例，合并糖尿病6例，合并高脂血癥12例。驗證組中男20例，女16例；年齡25～58歲，平均(40.77±5.91)歲；體質量指數18～26 kg/m2，平均(22.12±1.25)kg/m2；合并高血壓7例，合并糖尿病4例，合并高脂血癥7例。對照組中男21例，女15例；年齡24～58歲，平均(41.23±6.01)歲；體質量指數18～26 kg/m2，平均(21.92±1.30)kg/m2；合并高血壓8例，合并糖尿病5例，合并高脂血癥6例。3組研究對象性別、年齡、體質量指數、慢性疾病史比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1TBI治療方法 參照《顱腦創傷臨床救治指南》[7]，TBI患者入院后均予以積極治療，治療措施包括監護病情，維持呼吸道暢通，降顱壓，治療腦水腫，防范呼吸、心腦及消化道等并發癥。若存在手術指征則積極手術治療。患者出院后通過進行電話、門診隨訪，了解患者康復情況，并通知患者出院后3個月時到院進行預后恢復狀態評估。

1.2.2檢測方法 于TBI患者入院時、出院前1 d及對照組體檢當日，采用非抗凝真空管采集肘靜脈血4 mL，在4 ℃下，以轉速3 000 r/min、半徑8 cm離心15 min，收集血清，液氮保存。采用賽默飛Paris試劑盒提取總RNA，檢測RNA純度、濃度。采用賽默飛反轉錄試劑盒測定miR-124水平。miR-124正向引物：5′-GCTAAG-GCACGCGGTG-3′，反向引物：5′-GTGCAGGTC-CGAGGT-3′。U6正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。反應體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，0.8 μL上游引物，2 μL cDNA，雙蒸水加至20 μL。反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算miR-124水平。

1.2.3觀察指標 (1)比較對照組及訓練組入院時、出院前1 d miR-124水平。(2)分析入院時miR-124水平與訓練組損傷程度的關系。采用格拉斯哥昏迷量表(GCS)評分[8]評估損傷程度，13～15分為輕度，9～12分為中度，3～8分為重度。(3)評估訓練組出院后3個月時的GOS-E評分，5～8分為預后良好，1～4分為預后不良，比較不同預后TBI患者資料。(4)采用Cox回歸模型分析TBI患者預后影響因素。(5)采用受試者工作特征(ROC)曲線分析miR-124對TBI患者預后的預測價值。(6)檢測驗證組miR-124水平進行組外驗證。

2 結 果

2.1訓練組與對照組及訓練組治療前后miR-124水平比較 訓練組入院時miR-124水平為2.58±0.61，出院前1 d為1.43±0.40，對照組為1.06±0.27。訓練組入院時、出院前1 d miR-124水平均高于對照組(t=14.244、5.004，P<0.05)，訓練組出院前1 d miR-124水平低于入院時(t=13.401，P<0.05)。

2.2訓練組入院時miR-124水平與損傷程度的關系 72例患者中輕度20例、中度35例、重度17例，輕、中、重度TBI患者miR-124水平分別為2.21±0.49、2.57±0.58、3.04±0.70。不同損傷程度TBI患者miR-124水平比較，差異均有統計學意義(F=9.173，P<0.05)；隨著患者損傷程度加重，miR-124水平呈升高趨勢(P<0.05)。訓練組入院時miR-124水平與損傷程度呈正相關(r=0.628，P<0.05)。見圖1。

圖1 訓練組入院時miR-124水平與損傷程度的關系

2.3訓練組預后影響因素的單因素分析 訓練組72例患者隨訪3個月，失訪2例，有效隨訪70例，其中預后良好52例，預后不良例18例。單因素分析結果顯示，損傷程度、中線移位>5 mm、合并腦疝、瞳孔對光反應比例及腦血腫體積、入院時及出院前1 d miR-124水平在預后良好與預后不良患者間差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 訓練組預后影響因素的單因素分析或n(%)]

續表1 訓練組預后影響因素的單因素分析或n(%)]

表2 變量賦值

2.4訓練組預后影響因素的多因素Cox回歸模型分析 將結果2.3中P<0.05的因素進行多重共線性檢驗，發現入院時miR-124水平、損傷程度存在共線性(VIF>5)，故手動移除損傷程度、入院時miR-124。將預后情況作為因變量，中線移位>5 mm、合并腦疝、瞳孔對光反應比例、腦血腫體積、出院前1 d miR-124作為自變量，具體賦值見表2。采用多因素Cox回歸模型進行分析，結果顯示，校正合并腦疝、中線移位>5mm、瞳孔對光反應、腦血腫體積后，出院前1 d miR-124水平是預后的獨立影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 訓練組預后影響因素的多因素Cox回歸模型分析

2.5出院前1 d miR-124對預后的預測價值 將預后不良患者數據作為陽性數據，預后良好患者數據作為陰性數據繪制ROC曲線，結果顯示，出院前1 d miR-124預測TBI患者預后不良的AUC為0.784(95%CI：0.669～0.873，P<0.05)，Youden指數最高值為0.487，預測的cut off值為1.41，靈敏度為83.33%，特異度為75.38%。見圖2。

圖2 出院前1 d miR-124預測TBI患者預后的ROC曲線

2.6組外驗證 以出院前1 d miR-124≤1.41為預后不良的判斷標準對驗證組36例患者進行組外驗證，結果顯示，出院前1 d miR-124預測TBI患者預后不良的靈敏度為80.00%，特異度為80.77%，準確度為80.56%。見表5。

表5 組外驗證的預測結果(n)

3 討 論

TBI主要包括兩個層面，一是原發性機械腦損傷，二是傷后出現的一系列病理生理變化所致神經退行性改變[9]。近年來隨著醫療技術的快速發展，TBI病死率得到顯著控制，但由于此類患者腦神經組織損傷嚴重，預后多數存在不同程度殘疾，而早期評估其預后積極完善干預治療方案是改善預后的關鍵環節。

近年有關TBI預后的研究較多，如：孫國章等[10]提出，首診GCS評分是此類患者預后的獨立相關因素；郭異之等[11]研究表明，白細胞介素-6等炎癥因子水平升高是重度TBI患者近期預后的危險因素，可為臨床評估預后提供參考。但從TBI病情轉歸的病理生理相關機制角度分析不難發現，其預后轉歸涉及炎癥反應、神經組織損傷修復等多個過程，而此過程中神經修復相關調控機制如何變化尚無定論。miR-124屬神經系統特異性miRNA，其能憑借5′端種子序列與3′端非編碼區不完全或完全配對結合實現對蛋白質的合成及功能的調控，繼而控制、調節各項生理功能[12-14]。研究證實，miR-124基因缺失鼠存在大腦體積減小、軸突發育缺陷、神經細胞死亡等發育表型變化[15]。據此推測miR-124可能在神經系統發育中負責促進神經元分化及軸突再生修復等重要生理過程，或可為臨床評估TBI病情提供新視角。本研究結果顯示，TBI患者入院時miR-124水平明顯升高，而出院前1 d降至較低水平，反映出miR-124水平降低與病情康復有關。可能原因：TBI發生后主要由神經干細胞遷移并整合進入損傷腦神經組織中，并對TBI引起的神經結構損傷及功能損毀進行修復，而miR-124作為促神經細胞增殖、分化的重要活性物質，TBI發生后出現的一系列生理病理反應能激活miR-124大量表達以滿足腦神經損傷修復的需求，且損傷越嚴重，可能其水平越高以滿足神經損傷修復的需求，同時隨病情康復，此需求量逐漸減少，故表現為外周血miR-124水平降低[16-18]。由此上述推測得以證實。

此外，本研究還發現，預后良好患者miR-124水平較高，與部分動物實驗研究[19-20]的結論相符。經Cox回歸模型分析發現，miR-124水平升高是TBI患者預后不良的獨立保護因素，此特征和miR-124水平與損傷程度呈正相關的結論相悖，但深入分析主要是因TBI病理機制復雜，可能會損傷促miR-124表達的功能結構模塊，致miR-124表達相對不足或實際情況下miR-124表達能力有限，無法滿足TBI所致神經結構及功能損害修復所需，因此，當miR-124水平較低時患者預后不良，miR-124仍保持較高水平時可能更利于促進神經損傷修復[21]。這與臨床案例中重度TBI患者也可恢復最佳臨床狀態，而中度TBI患者反而恢復不佳的實例相符。但也有研究顯示，miR-124可能在神經損傷中具有雙重作用，如在急性腦梗死患者中miR-124水平越高梗死體積越小，但過高水平可促進炎癥反應，反而不利于預后恢復[22]，其具體的水平梯度尚未明確。但本研究未發現此特征，分析可能與病例選取不同有關，TBI的損傷程度決定因素更側重于外界暴力作用情況，而腦梗死體積受自身內部影響較大，miR-124在TBI患者中是否具有類似的水平梯度仍需繼續探討。ROC曲線分析結果顯示，出院前1 d miR-124預測TBI患者預后不良的AUC為0.784，并以出院前1 d miR-124≤1.41為預后不良的判斷標準進行組外驗證，結果顯示，miR-124預測TBI患者預后不良的靈敏度為80.00%，特異度為80.76%，準確度為80.56%，證實miR-124在預測TBI患者預后中具有重要價值。

綜上所述，TBI患者入院時外周血miR-124水平明顯升高，且與損傷程度呈正相關，其是TBI患者預后的獨立影響因素，可為臨床預后評估提供參考。