基于GC-MS的良惡性腹水患者代謝組學差異分析*

唐 杰，殷晨燕，許尤琪△

1.江蘇省第二中醫院/南京中醫藥大學第二附屬醫院腫瘤科，江蘇南京 210017；2.江蘇省中醫院藥劑科，江蘇南京 210029

腹水的病因復雜，可分為良性和惡性，主要表現為胸悶、憋氣或腹脹等，但臨床上對腹水的病因診斷存在較大的難度，如何準確有效鑒別腹水性質對臨床診治具有重要的意義[1]。代謝組學是一種新型組學技術，可檢測代謝物的轉化與水平變化，有利于發現疾病相關的代謝通路及潛在靶標、作用位點，從而為臨床診治提供重要的依據[2]。而氣-液相質譜(GC-MS)是代謝組學常用的檢測方法，可發現腫瘤組織及癌旁組織間的代謝差異，有利于了解腫瘤發生、發展情況，為臨床診治尋找潛在靶點，但目前關于良惡性腹水代謝組學差異的研究較少[3]。本研究通過GC-MS檢測良惡性腹水患者代謝情況，尋找二者的代謝組學差異，以期為臨床診治提供依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年6月至2021年6月江蘇省第二中醫院收治的58例惡性腹水患者作為惡性組，其中男30例，女28例；年齡20～74歲，平均(47.62±7.85)歲；體質量指數17.65～28.98 kg/m2，平均(22.71±2.68)kg/m2；腹水病因：肝癌28例，胃癌14例，腸癌10例，膽管癌6例。另選取同期收治的58例良性腹水患者作為良性組，其中男34例，女24例；年齡21～73歲，平均(46.92±7.67)歲；體質量指數17.82～28.65 kg/m2，平均(22.53±2.59)kg/m2；腹水病因：肝硬化28例，胃腸道疾病18例了，結核性腹膜炎12例。納入標準：(1)均經臨床癥狀、病史、實驗室、病理學等檢查確定腹水的良惡性；(2)年齡>18歲，無精神病病史；(3)所有患者均簽署知情同意書。排除標準：(1)有糖尿病等原發性代謝性疾病；(2)孕產婦或哺乳期；(3)檢查前3個月內有免疫、激素、放化療等治療史。兩組性別、年齡、體質量指數差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經江蘇省第二中醫院倫理學委員會批準。

1.2方法

1.2.1主要儀器與試劑 Agilent 6890/5975B氣相色譜-質譜聯用儀、DB-5 MS氣相毛細管色譜柱、Milli-Q Gradient超純水系統購自美國Agilent科技有限公司，低溫冷凍冰箱、樣品濃縮儀購自英國Stuart公司，微型漩渦混合器、高速冷凍離心機購自美國Millipore中國有限公司，數控超聲儀、箱式電阻爐、烘箱購自上海福瑪實驗設備有限公司。甲氧胺、N-O-雙(三甲硅基)三氟乙酰胺、L-2-氯苯丙氨酸、十七酸購自美國Sigma-Aldrich 公司，甲醇、氯仿購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2.2標本采集及處理 治療前對患者行腹腔穿刺，抽取10 mL腹水并置入已編號的凍存管，迅速投入液氮罐內低溫保存、備用。檢測前統一解凍處理腹水標本，加入3倍量生理鹽水勻漿，加500 μL甲醇渦旋1 min，置-20 ℃冰箱沉淀蛋白后離心10 min(12 000 r/min，4 ℃)；取200 μL上清液氮氣吹干，加入15 mg/mL甲氧胺80 μL振蕩30 s，搖床(250 r/min，30 ℃)中行甲氧胺對羰基的封閉反應1.5 h，再加80 μL的雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺振蕩30 s，70 ℃烘箱中放置1 h，室溫中放置1 h后待用。

1.2.3GC-MS檢測 取1 μL標本行GC-MS分析，設質譜參數[電子碰撞電離電壓70 eV，四級桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，溶劑延遲5 min，質譜全掃描范圍30～600質荷比(m/z)，方式為全掃描]，設液相色譜參數(色譜柱DB-5MS毛細管柱，進樣量1.0 μL，進樣口溫度270 ℃，接口溫度260 ℃，載氣99.999%純氦，流速1.0 mL/min，進樣方式為不分流)，色譜柱程序升溫檢測。

1.3統計學處理 (1)數據處理。所有原始數據經自帶Agilent MSD工作站轉化為Net CDF后導入R軟件行XCMS工具箱處理，最終形成由標本名稱、峰指數(保留時間-質荷比)、峰面積組成的三維矩陣表。(2)模式識別。三維矩陣表導入SIMCA-P11.5(Umetrics,Umea,Sweden)行主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判別分析法(PLS-DA)處理，采用正交偏最小二乘法判別分析法(OPLS-DA)來尋找差異變量，以變量對模型的重要性(VIP，VIP值越大說明貢獻越大)>1.0選擇多維統計上的差異變量進行驗證。采用7次交叉驗證和影響排列檢驗(RPT)對所得差異性代謝物的多維統計結果進行驗證，以VIP>1.0和P<0.05，結合錯誤發現率檢驗的q<0.05確定最終差異性代謝物。(3)代謝通路分析。依據多維統計給出的差異變量檢索美國國家標準與技術研究院(NIST)數據庫得到對應的化合物，用標準品鑒定差異表達代謝物，最后檢索京都基因與基因組百科全書(KEGG)庫和人類代謝組數據庫(HMDB)得到對應的代謝通路，并通過基礎代謝庫確定[4-5]。

2 結 果

2.1兩組腹水代謝物檢測結果比較 離子流色譜圖顯示惡性組和良性組腹水中均檢測到多種代謝物(每個峰代表≥1個代謝物)，見圖1。

注：A為惡性組腹水離子流色譜圖；B為良性組離子流色譜圖。圖1 兩組腹水患者離子流色譜圖比較

2.2兩組代謝模式比較 PCA圖(圖2A)顯示良性組和惡性組質控標本集中、穩定性好、可靠性高，兩組標本多位于95%置信區間的橢圓范圍內，顯示兩組代謝差異顯著并區分明顯；OPLS-DA圖(圖2B)顯示，良性組和惡性組代謝差異顯著分離(升高)；OPLS-DA載荷圖(圖2C)顯示，兩組均有大量代表代謝物的圓點且靠近兩邊三角形，即兩組間有大量差異性代謝物且差異顯著；7次交叉驗證結果顯示，兩組OPLS-DA模型中，R2X=0.28，R2Y=0.96，Q2=0.92，說明模型具有較好的穩定性和可靠性；OPLS-DA的RPT圖(圖2D)顯示，兩組OPLS-DA模型經200次隨機排列計算后，顯示右側的點均高于左側相同形狀的點，累積Q2=0.39，模型穩定可靠。

注：A為PCA圖；B為OPLS-DA圖；C為OPLS-DA載荷圖；D為OPLS-DA的RPT圖。圖2 兩組腹水患者代謝模式比較

2.3兩組差異性代謝物分析 OPLS-DA濾除噪音后，以第一主成分的VIP值(閾值>1)、P值及其校正的q值確定非差異性代謝物有13個，差異性代謝物有34個(q<0.05)，見表1。

表1 兩組代謝物分析

續表1 兩組代謝物分析

2.4兩組差異性代謝物的代謝通路篩選 將差異性代謝物通過KEGG庫映射獲得與之相關的代謝通路，經超幾何分布統計，其中谷氨酸和谷氨酰胺(L-谷氨酸、L-谷氨酰胺)、半乳糖(D-果糖、D-半乳糖、甘露糖、葡萄糖、D-半乳糖酸)、磷酸戊糖(葡萄糖酸內酯、葡萄糖、核糖、氨基葡萄糖)及谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸(L-天冬氨酸、L-谷氨酸、N-乙酰-L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺)4條代謝通路的代謝物在兩組間差異有統計學意義(P=1.35×10-3、3.86×10-3、2.06×10-2、1.29×10-3)，見表2。

表2 兩組代謝物的代謝通路分析

3 討 論

與良性腹水比較，惡性腹水因癌細胞已失去正常細胞的生理功能，其異常快速生長的特性會引起機體多項生命活動異常[6-7]。據相關研究報道，癌細胞會導致糖代謝、脂肪代謝、嘌呤嘧啶代謝等代謝異常的發生[8-9]，如Warburg效應，即正常細胞會借助線粒體產生的腺苷三磷酸來獲取能量，癌細胞則靠糖酵解作用為自身提供能量及生長所需的代謝物，癌組織糖酵解率可達正常組織的200倍，提示了解相關代謝途徑有助于深入了解癌癥發生、發展機制，并可促進新的診治方法出現[10-11]。

代謝組學通過以高分辨率分析儀和多維統計的方法分析細胞、組織或體內的代謝物全局性來揭示生命活動，可反映生物機體在受到外界干擾時機體的應答反應，從而了解疾病發生機制和藥物作用機制[12-13]。有研究報道，GC-MS是代謝組學中應用較廣的技術，可對組織、大便、體液等樣品中的小分子物質進行分離、檢測和定量，從而發現生理狀況下的代謝物的變化情況[14-15]。本研究PCA顯示，惡性組和良性組的代謝輪廓有顯著性差異，表明良惡性腹水患者存在代謝差異，這與王淑鳳等[16]研究顯示良惡性疾病(肝硬化和肝細胞癌)患者有代謝差異的結論相似。這可能是由于細胞癌變過程中，癌組織可能會引起機體代謝異常，尤其是會促使機體產生大量的能量和物質，以維持癌組織的異常快速生長；同時相關研究認為能量和物質的大量異常產生也是細胞癌變的根本原因[17-18]。

本研究進一步分析良惡性腹水患者代謝產物及通路的差異，OPLS-DA顯示惡性組和良性組有34個差異性代謝產物；經KEGG庫和HMDB映射顯示，與之相關且在良惡性腹水中差異有統計學意義的代謝通路有4條，分別為谷氨酸和谷氨酰胺(L-谷氨酸、L-谷氨酰胺)、半乳糖(D-果糖、D-半乳糖、甘露糖、葡萄糖、D-半乳糖酸)、磷酸戊糖(葡萄糖酸內酯、葡萄糖、核糖、氨基葡萄糖)及谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸(L-天冬氨酸、L-谷氨酸、N-乙酰-L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺)通路，表明與良性腹水比較，惡性腹水主要存在糖代謝、氨基酸代謝差異，其相關代謝通路可能與惡性腹水病程進展密切相關。

谷氨酸和谷氨酰胺代謝通路：谷氨酸和谷氨酰胺參與人體內多種代謝，其在癌組織中的主要作用是促進上皮-間質轉化來提高癌細胞的運動性[19-20]。故本研究推測惡性腹水中谷氨酸和谷氨酰胺代謝異常，可能是為了維持癌組織的活動，如促使癌細胞侵襲、脫落、轉移等。

磷酸戊糖代謝通路：磷酸戊糖來源于葡萄糖的氧化分解，也是核酸的主要成分之一，癌細胞快速增殖需要大量復制DNA[2-3]。故本研究推測惡性腹水中磷酸戊糖代謝異常，可能是為了用于癌細胞合成大量DNA。

半乳糖代謝通路：半乳糖可轉化為葡萄糖分解供能，一般在腸道中由13-乳糖酶分解乳糖產生，而代謝中的半乳糖則主要從尿苷二磷酸葡萄糖生成，同時癌組織的能量主要由葡萄糖直接酵解提供，無需再將半乳糖轉化為葡萄糖[12-13]。故本研究推測惡性腹水中半乳糖代謝異常，可能是為了獲得癌細胞快速增殖所需的物質。

谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸代謝通路：相關研究顯示，癌組織中的谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸與糖代謝、氨基酸代謝有關，谷氨酸經天門冬氨酸氨基轉移酶催化可生成天冬氨酸，天冬氨酸可為嘌呤和嘧啶的合成提供底物，使癌細胞快速大量復制其增殖所需DNA；同時丙氨酸進入血液后被運往肝臟，在肝臟中丙氨酸通過聯合脫氨基作用釋放氨基生成丙酮酸，丙酮酸經糖異生途徑生成葡萄糖，為癌細胞快速增殖提供能量[14-15]；故本研究推測惡性腹水中谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸代謝異常，可能是為了給癌細胞增殖提供物質及能量供應。

綜上所述，與良性腹水比較，惡性腹水主要存在糖代謝、氨基酸代謝改變，能量通路中的有關Warburg效應的代謝途徑變化明顯，這些代謝通路改變可能與惡性腹水病程進展密切相關，為失調的癌細胞提供生長和生存所需的各種條件，通過GC-MS等代謝組學檢測方法檢測相關代謝物及代謝通路有望成為惡性腹水新的診治方向。