膽管刷檢細胞學及K-Ras基因突變檢測在惡性膽管梗阻早期定性診斷中的價值

許穎穎，王倩倩，秦耿，房龍*

（1.中日友好醫(yī)院 消化內(nèi)科，北京 100029；2.北京大學醫(yī)學部 中日友好臨床醫(yī)學院，北京 100029）

膽管梗阻是消化內(nèi)科常見的疾病，惡性梗阻根治性手術切除率低，預后差，因此，盡早對膽管梗阻良惡性鑒別診斷至關重要，尤其對于有根治機會的早期惡性梗阻患者，而對于良性梗阻患者，也可以避免不必要的手術或藥物干預[1]。然而，血液生化檢查、無創(chuàng)性腹部影像學檢查往往無法做出準確診斷，易導致漏診或誤診，延誤最佳治療時機，最終的確診仍有賴于病理學證據(jù)。目前，內(nèi)鏡下逆行性胰膽管造影（endoscopic retrograde cholangiopancreatography，ERCP）膽管刷檢仍是獲取病理學證據(jù)的主要手段，貼近病變刷檢獲取病理的同時，又可以避免膽管活檢造成膽道出血、穿孔等風險[2]。而當細胞學診斷依據(jù)不充分時，隨著分子生物學技術的發(fā)展，膽管刷檢細胞學與KRas 基因突變聯(lián)合檢測是否可提高對惡性膽管梗阻的診斷效果，尚需要臨床進一步驗證。本研究對膽管梗阻患者進行膽管刷檢、K-Ras 基因突變檢測，對兩種診斷方法單獨及聯(lián)合檢測診斷惡性膽管梗阻的靈敏度、特異度、準確率進行評價和比較，評估膽管刷檢細胞學、K-Ras 基因突變檢測在惡性膽管梗阻早期定性診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

以2021 年1 月—12 月因膽管梗阻在中日友好醫(yī)院消化科住院治療的患者為研究對象。入選標準：（1）年齡及性別不限；（2）腹部B 超、CT 或核磁證實肝內(nèi)外膽管梗阻；（3）進行ERCP 手術的患者。排除標準：（1）全身一般情況差，不能耐受胃鏡檢查及ERCP 膽管刷檢；（2）凝血功能障礙，無法耐受有創(chuàng)性操作；（3）除肝膽胰外的其他臟器惡性腫瘤伴肝臟轉(zhuǎn)移導致肝內(nèi)外膽管受累；（4）任何原因?qū)е碌氖彻芪傅嘴o脈重度曲張者。

良惡性膽管梗阻診斷標準：病理學未見明確惡性腫瘤證據(jù)，包括膽管活檢病理、追加手術后病理、膽管刷檢、膽汁細胞學等，或臨床隨訪半年以上仍未發(fā)現(xiàn)惡性征象且患者生存良好者，最終診斷為良性膽管梗阻；病理學證實存在惡性腫瘤，或臨床隨訪證實為惡性病程者，最終診斷為惡性膽管梗阻。

1.2 研究方法

1.2.1 膽管刷檢：患者俯臥或側(cè)臥于手術床，全身靜脈麻醉后，常規(guī)ERCP 操作，首先采用電子十二指腸鏡（日本Olympus TgF）進鏡至十二指腸降段乳頭開頭處，插入黃斑馬導絲，體外X線透視確認導絲進入到膽管內(nèi)，隨后碘伏醇造影明確膽管梗阻部位，沿導絲插入細胞刷（美國Boston Scientific RX Cytology Brush），在膽管梗阻部位刷檢2次，每次在膽管梗阻部位往復移動大約10 次，刷檢細胞全部置入液基細胞瓶（中國廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司Non-GYN 型），半小時內(nèi)送至病理科，1 份進行細胞學檢測，1 份進行KRas基因突變檢測。

細胞學陽性判斷標準[3]為：（1）細胞大小不等，排列紊亂；（2）細胞核增大，核外形不規(guī)則，染色質(zhì)增粗，核深染；（3）核漿比例（核質(zhì)比）增大。中日友好醫(yī)院病理科將細胞學診斷劃分為：癌細胞、高度可疑癌細胞、可疑癌細胞、核異質(zhì)細胞、未見癌細胞。癌細胞、高度可疑癌細胞、可疑癌細胞或核異質(zhì)細胞提示病理學存在惡性腫瘤證據(jù)。

1.2.2 K-Ras 基因突變檢測：留取1 份膽管刷檢細胞液，進行K-Ras 基因第2、3、4 外顯子突變檢測，結(jié)果分為突變型及野生型，存在K-Ras基因突變者提示惡性膽管梗阻。

1.2.3 膽管刷檢聯(lián)合K-Ras 基因突變檢測：采用膽管刷檢聯(lián)合K-Ras 基因突變進行診斷時，其中任何一種方法陽性，即可診斷為惡性膽管梗阻。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS24.0 進行統(tǒng)計學分析。以病理學及臨床隨訪結(jié)局作為金標準，比較膽管刷檢、KRas 基因突變及膽管刷檢聯(lián)合K-Ras 基因突變對惡性膽管梗阻定性診斷的靈敏度、特異度、準確率等指標。率的比較采用χ2檢驗進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 患者納入及最終診斷

2021 年1 月—12 月，本研究共納入93 例膽管梗阻患者，其中2 例患者退出，要求轉(zhuǎn)外院治療或返家，1例胃癌伴肝臟轉(zhuǎn)移，1例食管胃底靜脈重度曲張。結(jié)合病理學及半年的臨床隨訪，確診良性膽管梗阻32 例，惡性膽管梗阻57 例，其中有原發(fā)性膽管惡性腫瘤46例，胰腺惡性腫瘤11例（圖1）。

圖1 患者納排流程圖

2.2 膽管刷檢及K-Ras基因突變的診斷價值

2.2.1 膽管刷檢診斷結(jié)果

表1 示細胞學陽性率，惡性膽管梗阻患者為52.6%（30/57），良性膽管梗阻患者為3.1%（1/32）。膽管刷檢細胞學診斷惡性膽管梗阻的靈敏度為52.6%（30/57），特異度為96.9%（31/32）。

表1 膽管刷檢對膽管梗阻的定性診斷

2.2.2 K-Ras基因突變診斷結(jié)果

表2 示K-Ras 基因突變率，惡性膽管梗阻患者為60.8%（31/51），良性膽管梗阻患者0（0/32）。K-Ras 基因突變對惡性膽管梗阻定性診斷的靈敏度為60.8%（31/51），特異度為100%（32/32）。

表2 K-Ras基因突變對膽管梗阻的定性診斷

2.2.3 膽管刷檢與K-Ras基因突變診斷結(jié)果的交叉對比

表3 示，在57 例惡性膽管梗阻中，30 例膽管刷檢細胞學呈陽性，其中15 例可見明確癌細胞，4例高度可疑/可疑癌細胞，11 例可見核異質(zhì)細胞，K-Ras 基因突變率相應為86.7%（13/15）、75.0%（3/4）、72.7%（8/11）。在15 例可見明確癌細胞的患者中，K-Ras 基因突變率也未能達到100%，仍有2例患者K-Ras 基因為野生型。27例細胞學陰性患者中，7 例發(fā)生K-Ras 基因突變，表明在惡性膽管梗阻中，膽管刷檢細胞學陰性而K-Ras 基因發(fā)生突變者達25.9%（7/27）。因此，需將膽管刷檢細胞與K-Ras基因突變進行聯(lián)合檢測。

表3 膽管刷檢與K-Ras基因突變診斷結(jié)果的交叉對比

2.2.4 聯(lián)合檢測診斷結(jié)果

表4 示，膽管刷檢聯(lián)合K-Ras 基因突變診斷惡性膽管梗阻的靈敏度為72.5%（37/51），特異度為96.9%（31/32）。

表4 膽管刷檢聯(lián)合K-Ras基因突變檢測對膽管梗阻的定性診斷

2.2.5 3種檢測方法的診斷結(jié)果比較

表5 示，膽管刷檢聯(lián)合K-Ras 基因突變檢測可提高對惡性膽管梗阻診斷的靈敏度，增加診斷的準確率，與膽管刷檢細胞學檢測比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），同時降低誤診率。

表5 3種定性診斷方法的比較

3 討論

為評估膽管刷檢、K-Ras 基因突變及兩者聯(lián)合檢測這3 種檢測方法對惡性膽管梗阻定性診斷的價值，本研究最終納入89 例膽管梗阻患者，其中57例惡性膽管梗阻，32例良性膽管梗阻。膽管刷檢診斷惡性膽管梗阻的靈敏度、特異度、準確率分別為52.6%、96.9%、68.5%，K-Ras 基因突變的診斷結(jié)果為60.8%、100%、75.9%，膽管刷檢與KRas 基因突變聯(lián)合檢測的靈敏度可提高至72.5%（37/51），準確率可提高至81.9%（68/83），與膽管刷檢細胞學檢測比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），可推薦作為惡性膽管梗阻定性診斷的常規(guī)檢測手段。

3.1 惡性膽管梗阻早期定性診斷的臨床意義

膽管癌是繼肝細胞癌之后第二大常見的肝臟惡性腫瘤[4]。在解剖學上，膽管癌可劃分為肝內(nèi)、肝門區(qū)和肝外膽管癌，其中以肝內(nèi)膽管癌最為常見。肝炎病毒感染、炎癥、吸煙飲酒、肥胖、糖尿病等均認為是膽管癌的危險因素[5]。最新的全球癌癥流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在過去的幾十年中，膽管癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈逐步上升趨勢[6]。手術切除是唯一的根治方法，然而，膽管癌惡性程度高，很少能在早期確診，大多數(shù)患者確診時已發(fā)展至不能手術切除的晚期階段，即使存在手術機會，在完全手術切除后，也存在術后短期內(nèi)復發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移的風險，預后極差，據(jù)文獻報道，確診后患者生存期＜12 個月，5 年生存率僅為5%～15%[4，7]。因此，對于可能治愈的早期膽管癌，早期準確診斷至關重要。

3.2 膽管刷檢細胞學對惡性膽管梗阻的定性診斷價值及影響因素

早期鑒別良性和惡性膽管梗阻是非常困難的，盡管在過去的數(shù)十年里已經(jīng)發(fā)展了多探測器計算機斷層掃描、核磁共振胰膽管造影及超聲內(nèi)鏡等檢查，但單純影像學檢查對惡性膽管梗阻的診斷效果仍然有限。隨著內(nèi)鏡技術的發(fā)展，ERCP被廣泛用于獲取不明性質(zhì)膽管梗阻的病理學證據(jù)，包括膽管活檢、膽管刷檢等，理論上，膽管活檢可以獲取更大的組織樣本并做出更準確的病理學診斷，但由于技術難度大，膽道出血、穿孔手術風險高，手術操作時間長，在很大程度上限制了膽管活檢在臨床中的廣泛應用[8]。因此，ERCP 膽管刷檢仍然是目前膽管癌的主要診斷方法，因為它在技術上易于實施，手術時間短，并發(fā)癥發(fā)生率低，但其靈敏度和特異度比較有限，還存在很大的改進空間[2，9]。比如最近一項研究表明，在55例已明確診斷為惡性膽管梗阻患者中，單純膽管刷檢細胞學的靈敏度僅為47.1%[9]。與之相似，日本學者進行的一項研究表明，膽管刷檢對惡性膽管梗阻定性診斷的靈敏度、特異度、準確率分別為36.1%、100%、50.0%。而在本研究中，膽管刷檢的靈敏度為52.6%，靈敏度為中等水平，與既往研究結(jié)果不完全一致，但符合文獻研究中的靈敏度波動范圍。

細胞學診斷的靈敏度會受到諸多因素影響，可能的因素包括：刷檢細胞量[1]、重復刷檢頻率、內(nèi)鏡醫(yī)師的技術、細胞學病理醫(yī)師的經(jīng)驗、總膽紅素水平、患者年齡、腫塊＞1cm[10]、梗阻長度＞1cm[11]，上述因素均可能影響膽管刷檢細胞學的陽性率。細胞量獲取不足被認為是細胞學靈敏度低下的主要原因，提示在臨床實踐中，應在膽管梗阻部位重復多次刷檢，以盡可能提高膽管刷檢細胞學的陽性率[1]。既往一項研究的單因素聯(lián)合多因素邏輯回歸分析發(fā)現(xiàn)，年齡增長、總膽紅素水平升高及腫塊大小是細胞學陽性的獨立預測因素[10]。而另一項研究的多元邏輯回歸分析表明，總膽紅素水平＞4mg/dl 是膽管刷檢細胞學陽性的獨立預測因素，這表明總膽紅素水平可能影響膽管刷檢細胞學的診斷效果[8，10]。據(jù)文獻報道，受上述多因素的影響，膽管刷檢細胞學靈敏度波動于20%～50%，單純細胞學檢測無法滿足臨床實際需求，需聯(lián)合其他診斷方法進一步提高診斷的靈敏度。

3.3 K-Ras 基因突變對惡性膽管梗阻的定性診斷價值

隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，對膽管癌生物學行為、潛在發(fā)生發(fā)展機制、靶向治療藥物及預后標志物的探索均已進入分子時代。例如Morita 等[4]指出經(jīng)過數(shù)十年對膽管癌基因組的探索，基于基因組學特征，已成功開發(fā)出針對膽管癌的臨床分子靶向藥物，如成纖維細胞生長因子受體抑制劑（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）和異檸檬酸脫氫酶抑制劑（isocitrate dehydrogenase，IDH）。再如Kinjo 等[7]通過對膽管癌患者進行預后生存分析，發(fā)現(xiàn)SUOX 和GLUT1 可作為膽管癌的新型預后生物標志物。然而，總體預后差，藥物治療效果欠滿意，促使研究者們重新聚焦于膽管癌的早期診斷。有研究發(fā)現(xiàn)，與膽管癌相關的幾種潛在驅(qū)動突變包括K-Ras、p53、IDH1 和PTEN 等[10]，其中又以K-Ras 和p53 研究較為廣泛[12]。K-Ras 為RAS 基因家族的一名重要成員，含有4個編碼外顯子和1個非編碼外顯子，共同編碼KRAS 蛋白，又稱為p21 蛋白，在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，以及細胞增殖、侵襲遷移等細胞生物學過程中發(fā)揮重要作用[13]。研究表明，K-Ras 基因的功能增益突變?yōu)槟懝馨┲凶畛Ｒ姷淖兓唬罨腒-Ras 基因突變導致Ras/Raf/MEK/ERK 通路發(fā)生級聯(lián)反應和過度活化，腫瘤細胞過度增殖而凋亡減少，從而導致膽管癌的發(fā)生發(fā)展[14，15]。鑒于KRas 基因突變在膽管癌發(fā)生發(fā)展中的核心地位，國內(nèi)曾有研究評估了K-Ras基因突變對膽管癌定性的診斷價值，結(jié)果顯示在膽管癌患者中，K-Ras基因突變率為30.0%～43.75%，定性診斷膽管癌的靈敏度、特異度、準確率分別為38.46%、100%、61.9%[1]。而另一項研究的研究結(jié)論與之相反，膽管癌患者的K-Ras 基因突變率高達77.19%[16]，這與我們的研究結(jié)果較為接近。

綜上，在惡性膽管梗阻的定性診斷中，單一的診斷方法各有優(yōu)劣、很難得出最終診斷結(jié)論，將多種診斷方法結(jié)合起來可能更有助于做出準確的診斷。因此，膽管刷檢細胞學與K-Ras 基因突變聯(lián)合檢測的診斷效果優(yōu)于單一方法檢測，聯(lián)合檢測有助于惡性膽管梗阻的早期定性診斷，建議廣泛應用。當然，本研究的局限之處在于單中心、小樣本，還需在前瞻性、多中心的大規(guī)模研究中進一步驗證。