探究人參敗毒散對肺炎小鼠干預(yù)調(diào)控以及線粒體自噬蛋白表達(dá)的影響

王 柯，樊建設(shè)，樊佳佳，孫力超，楊道文，張洪波*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 中醫(yī)肺病科，北京 100029；3.中日友好醫(yī)院 急診科，北京 100029）

肺炎是臨床常見疾病，細(xì)菌是最常見的致病誘因[1]。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，肺炎的研究獲得了長足的進(jìn)步，但由于抗生素的大量使用，導(dǎo)致獲得性多重耐藥的出現(xiàn)，因此肺炎的病死率仍較高[2]。長久以來，人參敗毒散被廣泛應(yīng)用于感冒、咳嗽、肺炎等呼吸系統(tǒng)疾病的治療，并取得了較好的療效。其出自于《太平惠民和劑局方》[3]，記載原文為：“治傷寒時(shí)氣，頭痛項(xiàng)強(qiáng)，壯熱惡寒，身體煩疼，及寒壅咳嗽，鼻鼾聲重，風(fēng)痰頭痛，嘔噦寒熱，并皆治之”。而人參敗毒散是通過何種途徑來干預(yù)調(diào)控肺炎過程以及其是否與自噬通路相關(guān)，目前仍尚不明確。本研究旨在揭示人參敗毒散與肺炎的炎癥反應(yīng)有何相關(guān)性，以及自噬在肺炎中的作用，進(jìn)一步探究人參敗毒散是否能通過調(diào)節(jié)肺炎小鼠模型的自噬水平以減輕器官損傷。

1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)別8～10周的ICR雄性小鼠24 只，體重25±2g。飼養(yǎng)條件為6 只/籠。照明條件：明暗交替各12h。動(dòng)物飼養(yǎng)室：北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室（溫度23℃，濕度45.4%）。

人參敗毒散，由中日友好醫(yī)院中藥房煎制（柴胡9g，前胡9g，川芎6g，枳殼9g，羌活6g，獨(dú)活6g，茯苓9g，炒桔梗6g，人參6g，甘草5g，生姜2 片，薄荷2g，濃煎100ml）。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS 和3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）均為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)。

高效組織裂解液（solarbio 公司，中國）；BCA法蛋白定量試劑盒（solarbio 公司，中國）；IL-1β，IL-6，TNF-α 的ELISA 試劑盒（上海森雄，中國）；P62，LC3B，β-actin 抗體（Sigma 公司，美國）；HRP標(biāo)記二抗（北京中杉金橋有限公司，中國）。

主要儀器設(shè)備：電子顯微鏡（日本JEM-1400Plus）；電子天平（諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司）；移液器（德國Eppendorf）；舒式切片機(jī)（公司：櫻花病理儀器株式會(huì)社）；組織包埋機(jī)（櫻花病理儀器株式會(huì)社，日本）；BIO-RAD 酶標(biāo)儀（美國產(chǎn)，721BR16681）；BIO-RAD 電泳儀（美國產(chǎn)，042BR03674）；旋轉(zhuǎn)式組織脫水機(jī)（櫻花病理儀器株式會(huì)社）；石蠟溶蠟箱（櫻花病理儀器株式會(huì)社）；冰凍切片機(jī)（LEICA CM 1950）；多功能酶標(biāo)儀（美國MD公司）。

2 方法

2.1 肺炎小鼠模型建造

通過LPS 誘導(dǎo)的急性肺炎動(dòng)物模型，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于肺炎小鼠模型的構(gòu)建[4，5]。預(yù)實(shí)驗(yàn)我們以10μg/只的LPS 劑量進(jìn)行肺炎小鼠模型的構(gòu)建，陰性對照組（Ctrl）小鼠采用同體積的0.9%氯化鈉注射液滴鼻。分別在LPS 處理的3h、6h 和12h 處死小鼠，取其肺臟和肺泡灌洗液進(jìn)行肺臟組織病理切片、肺臟炎癥因子及肺泡灌洗液炎性細(xì)胞的觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著LPS處理時(shí)間的延長，小鼠肺損傷越來越嚴(yán)重，表明我們成功構(gòu)建了LPS誘導(dǎo)肺炎小鼠模型。

2.2 分組、給藥與取材

采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其平均分為4 個(gè)實(shí)驗(yàn)小組，即假手術(shù)組（Ctrl）、肺炎模型對照組（NC）、人參敗毒散治療組（Ginseng）和自噬抑制劑干預(yù)組（Ginseng+3-MA）。分組給藥見表1。4 個(gè)實(shí)驗(yàn)小組均于術(shù)后6h處死取材肺臟。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)措施

3 觀察及檢測指標(biāo)

3.1 肺組織病理學(xué)觀察

取肺部組織，常規(guī)進(jìn)行固定、石蠟包埋、切片以及脫蠟處理，通過HE 染色及脫水，于光鏡下觀察相關(guān)組織病理改變。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進(jìn)行肺泡灌洗液檢測

取出小鼠肺泡灌洗液，按ELISA 試劑盒相關(guān)說明，檢測肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6 以及TNF-α含量。

3.3 RNA 提取與細(xì)胞因子（IL-1β，IL-6 和TNFα）熒光定量PCR

對取出的肺組織，采用Trizol 法提取總RNA，并檢測總RNA 的濃度。參照RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明完成逆轉(zhuǎn)錄，并合成cDNA。IL-1β 引物序列為上游：CATGGGATAACGAGGCTTATGT，下游：CATATGGACCAGACATCACCAA。IL-6引物序列為上游：CACTCACCTCTTCAGAACGAT；下游：GCTGCTTTCACACATGTTACTC。TNF-α 引物序列為上游：CCAGGGACCTCTCTCTAATCA；下游：TCAGCTTGAGGGTTTGCTAC。β-actin 引物序列為上游：GGACCTGACTGACTACCTCAT；下游：CGTAGCACAGCTTCTCCTTAAT。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃2min；95℃2min；（95℃15s；60℃30s）×40。反應(yīng)結(jié)束后，用儀器自帶軟件分析樣本Ct值，并參照相對定量法進(jìn)行計(jì)算，得出相關(guān)mRNA的相對表達(dá)量。

3.4 血球計(jì)數(shù)板法及Wright-Giemsa 染色法觀察肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞含量

先以血球計(jì)數(shù)板方法計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)，再以Giemsa 染色計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的數(shù)目。

3.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測肺部組織內(nèi)LC3蛋白表達(dá)

低溫剪碎小鼠肺組織，每20mg 組織混入200μl 裂解液。使用勻漿器勻漿，冰上靜置1h 使組織完全裂解。在12000r/min 的條件下，使用高速離心機(jī)對配制好的組織勻漿液進(jìn)行分離，取上清液放入溫度為-80℃的冰箱中冷凍保存。BCA法測定樣本蛋白濃度。根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量制作不同濃度的凝膠，并進(jìn)行上樣、電泳。采用半干法轉(zhuǎn)PVDF 膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉2h。根據(jù)說明書操作添加一抗，4℃孵育過夜，TBST 洗滌5min，添加二抗，室溫孵育1h，TBST 洗滌5min。在條帶上滴加適量顯色液，用BIO-RAD 凝膠成像儀軟件Image lab 5.2曝光并拍照，分析灰度值。

3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS26.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將所獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來進(jìn)行對比。多個(gè)組別間比較，采用單因素方差相關(guān)分析。

4 結(jié)果

4.1 各組小鼠肺組織形態(tài)

NC 組經(jīng)過LPS 處理后，在小鼠肺組織細(xì)支氣管管壁周邊可以觀察到明顯的炎性細(xì)胞浸潤（圖1，見封三）。人參敗毒散（400μl/只）干預(yù)后，Ginseng組肺部損傷情況得到明顯減輕（圖1，見封三）。抑制劑組添加3-MA處理后，肺組織的炎性細(xì)胞浸潤明顯增多（圖1，見封三）。

圖1 各組小鼠的肺組織（HE×200）

4.2 肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 水平

與LPS 對照組（NC）相比，人參敗毒散干預(yù)組的IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 水平明顯下降，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。自噬抑制劑組中IL-1β、IL-6、TNF-α 的mRNA 水平較人參敗毒散組明顯提高，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2A、2B、2C）。

圖2 各組小鼠肺組織中細(xì)胞因子的表達(dá)水平

4.3 肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白水平

與LPS 對照組（NC）相比，人參敗毒散干預(yù)組的IL-1β、IL-6、TNF-α 的蛋白水平明顯下降，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。自噬抑制劑組中IL-1β、IL-6、TNF-α 的蛋白水平較人參敗毒散組明顯提高，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2D、2E、2F）。

4.4 肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞含量

經(jīng)人參敗毒散處理后，炎癥細(xì)胞的數(shù)量減少；而經(jīng)自噬抑制劑3-MA 處理，炎癥細(xì)胞數(shù)量如白細(xì)胞（圖3A）、巨噬細(xì)胞（圖3B）、中性粒細(xì)胞（圖3C）和淋巴細(xì)胞（圖3D）都出現(xiàn)了不同程度的增加（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠的肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞含量

4.5 肺部組織內(nèi)LC3蛋白表達(dá)

LPS 誘導(dǎo)的小鼠肺炎時(shí)，引起肺組織內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的降低；經(jīng)人參敗毒散干預(yù)后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高（P＜0.01）（圖4、5）。與此同時(shí)，使用p62追蹤選擇性自噬過程，結(jié)果顯示10μg LPS 處理小鼠6h 后，P62 蛋白水平呈升高趨勢；與肺炎對照組相比，人參敗毒散組P62蛋白水平顯著下降。

圖4 WB蛋白條帶

5 討論

肺炎典型癥狀為發(fā)熱、咳嗽、咳痰、痰中帶血、呼吸困難等臨床表現(xiàn)[6，7]，歸屬于中醫(yī)“咳嗽”和“肺癰”等病范疇。《中醫(yī)內(nèi)科疾病診療常規(guī)》[8]認(rèn)為本病病因多由風(fēng)熱疫毒之邪自口鼻而入，首先犯肺，或肺本有伏熱，復(fù)感外邪而發(fā)。

人參敗毒散不僅是治療虛人外感的經(jīng)典名方，在我國古代亦被稱為“治疫第一方”[9]，當(dāng)今多認(rèn)為肺炎病因與風(fēng)熱疫毒之邪相關(guān)[8]。《素問·評(píng)熱病論》中記載：“邪之所湊，其氣必虛”。故方中人參扶助正氣，鼓邪外出，為全方最為精妙之處，《張氏醫(yī)通》[10]言其：“全在人參一味，力致開闔，始則鼓舞羌、獨(dú)、柴、前各走其經(jīng)，而與熱毒分解之門，繼而調(diào)御津精血?dú)飧魇仄溧l(xiāng)，以斷邪氣復(fù)入之路”；羌活與獨(dú)活一上一下，合而驅(qū)散一身之邪；柴胡味辛而發(fā)散，既有疏散退熱之功，又有升舉陽氣之力；川芎與柴胡配伍，治風(fēng)兼以調(diào)血，正所謂“治風(fēng)先治血，血行風(fēng)自滅”；桔梗宣肺開肺，枳殼降氣止咳，升降相依，調(diào)暢人體氣機(jī)；前胡化痰，茯苓化濕，生姜、薄荷解表散邪，國老益氣和中，調(diào)和方中藥性。君臣佐使各守其位，驅(qū)邪而不傷正，《增訂葉評(píng)傷暑全書》稱其為“調(diào)和之宗也”。臨床上，劉立昌[11]應(yīng)用人參敗毒散治療風(fēng)咳、感冒等，十分有效；林磊[12]等人在一項(xiàng)關(guān)于人參敗毒散與上呼吸道感染的報(bào)道指出，人參敗毒散在治療上呼吸道感染方面有重要作用，值得臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用；在《新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）經(jīng)方防治推薦方案（國際第1 版）》[13]中，人參敗毒散被推薦為群體性治療用方。另有報(bào)道[13，14]，人參敗毒散及其變方在新冠肺炎的防治上取得較好的療效。

圖5 WB條帶灰度分析

基于現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)告，自噬被廣泛理解為保守的細(xì)胞內(nèi)的降解途徑，即可通過雙層膜將本身受損的細(xì)胞器、錯(cuò)誤蛋白質(zhì)以及入侵的病原菌運(yùn)至溶酶體降解，具有維持胞內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)定的作用[15，16]。LC3 是參與自噬小體形成的主要蛋白，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，胞質(zhì)型LC3（LC3Ⅰ）被激活，轉(zhuǎn)變成膜型LC3（LC3Ⅱ）并附著于自噬體膜上，故LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可評(píng)估自噬水平的高低[17]。LC3Ⅱ被認(rèn)為是自噬的生物學(xué)標(biāo)志[18]，其表達(dá)水平與自噬呈正相關(guān)[19]。p62/SQSTM1 是自噬底物連接蛋白，含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，可結(jié)合待降解蛋白將其運(yùn)輸至自噬體中，最終在溶酶體中降解[20]。因此，p62與細(xì)胞自噬呈負(fù)相關(guān)。在肺部的炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展中，自噬反應(yīng)具有雙重作用，細(xì)胞自噬一方面可能有利于病原菌的清除，另一方面，激活的自噬效應(yīng)能增強(qiáng)肺部的炎癥反應(yīng)從而加重肺部損傷[21，22]。

本實(shí)驗(yàn)通過鼻腔滴注LPS 建立肺炎小鼠模型，我們發(fā)現(xiàn)在LPS（10μg/只）處理6h的小鼠肺組織中自噬相關(guān)蛋白LC3 的表達(dá)呈輕微降低趨勢，而P62 呈明顯上升趨勢，提示LPS 處理6h 后可抑制自噬的形成。該結(jié)果揭露自噬在LPS建立的肺炎小鼠模型中可能有重要調(diào)控功能。我們進(jìn)一步通過肺泡灌洗液測得了炎性細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示LPS 處理后炎性細(xì)胞的數(shù)目明顯增多。原理可能是自噬激活可促進(jìn)中性粒細(xì)胞形成NETs，對外來性細(xì)菌發(fā)揮清除作用[23]。然而以10μg/只LPS 處理小鼠，極有可能是誘導(dǎo)了小鼠的急性肺損傷，進(jìn)而造成了自噬的形成受阻，無法清除壞死的肺臟細(xì)胞。人參敗毒散干預(yù)后，可將受阻的自噬重新激活，從而達(dá)到了減輕肺部炎性反應(yīng)的效果，進(jìn)而減輕了肺部損傷程度。予以3-MA（自噬抑制劑）處理后，LC3Ⅰ/LC3Ⅱ比值增加，P62 上升，使細(xì)胞自噬的程度減弱，肺部損傷的程度加劇。這揭示了自噬在減輕肺部炎癥上具有重要的調(diào)節(jié)作用。