LINC00221通過激活ERK信號通路促進肝細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲

張玉萍 宋蕾 李春艷 程曉磊 孫國鋒

肝細胞癌(HCC)的發生和發展的分子機制仍不清楚[1]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)通過表觀遺傳發揮基因的轉錄調控功能，其異常表達與癌癥發展中多種病理過程密切相關[2]。長間隔非編碼RNA 00221(long intergenic non-coding RNA 00221，LINC00221)是一種新發現的LncRNA，其表達上調與肌層浸潤性膀胱癌進展相關，增強非小細胞肺癌的順鉑耐藥性，影響治療和預后[3]。有學者通過整合分析發現,LINC00221與HCC病人生存期密切相關，是HCC的預后生物標志物[4]。本研究探討干擾LINC00221表達對HCC細胞增殖、遷移和侵襲生物學行為的影響。

材料與方法

一、試驗試劑

肝上皮細胞LO2和HCC細胞株HCCLM6、Hep3B、MHCC-97H、Huh-7、MHCC-LM3均由本院實驗中心凍存。干擾片段siRNA-LINC00221和陰性對照siRNA-NC購自上海吉瑪制藥技術有限公司；轉染試劑Lipofectamine? 3000購自美國Thermo Fisher公司；RPIM1640培養基、PBS和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；ERK信號激動劑C16-PAF購自美國MCE公司。LINC00221干擾序列1：F：AGAAUCAUAUGCAAACAGCCU；R：GCUGUUUGCAUAUGAUUCUUC。LINC00221干擾序列2：F：AGAAGAAUCAUAUGCAAACAG；R：GUUUGCAUAUGAUUCUUCUAA。

二、方法

1.細胞處理：向細胞中加入含有10%胎牛血清及1%雙抗的RPIM1640培養基于37 ℃，5% CO2恒溫培養箱培養，待細胞長滿后用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。使用Lipofectamine? 3000分別將siRNA-LINC00221和siRNA-NC轉染到MHCC-LM3細胞，實驗分組為空白對照組、陰性對照組、LINC00221干擾組(轉染siRNA-LINC00221)、LINC00221干擾+ERK激動劑組(轉染siRNA-LINC00221+C16-PAF)。

2.CCK-8實驗：轉染處理的第0小時、24小時、48小時、72小時，向細胞中加入5 μl的CCK-8溶液孵育4小時，通過酶標儀測定450 nm波長下OD值，計算MHCC-LM3細胞活力。

3.細胞劃痕實驗：細胞長滿后，使用10 μl槍頭向單層細胞劃線，寬度控制在500 μm左右，顯微鏡拍照并記為0小時結果。繼續培養24小時后用顯微鏡拍照，計算MHCC-LM3細胞24 h內劃痕愈合率。

4.Transwell實驗：Transwell小室底部基底膜加入100 μl基質膠稀釋液，風干后加入100 μl的培養基。小室外加入含10%胎牛血清培養液900 μl，重懸MHCC-LM3細胞至濃度1×105/ml，接種細胞到小室內并孵育24小時。取出小室，用4%濃度多聚甲醛固定30分鐘以上；結晶紫工作染液染色30分鐘以上，光學顯微鏡照相，統計分析MHCC-LM3細胞穿膜數量。

5.qRT-PCR實驗：去除培養基后，加入800 μl的Trizol試劑充分裂解細胞，加入200 μl氯仿4 ℃離心提取細胞總RNA。取1 μg RNA，逆轉錄合成cDNA，并以cDNA為模板定量PCR檢測。GAPDH作為內參，2-ΔΔCt法計算LINC00221的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

6.Western blot檢測：轉染處理48小時后向細胞中加入200 μl蛋白裂解液冰上裂解30分鐘，12 000 g冷凍離心提取細胞總蛋白。取蛋白樣本加入4 SDS上樣緩沖液，混勻后煮沸變性10分鐘，進行SDS-PAGE電泳，經過轉膜后置于5%的BSA封閉1～2小時，4 ℃過夜孵育一抗，室溫1小時孵育二抗，ECL避光顯影、拍照。以GAPDH為內參分析目標分子蛋白相對表達量，p-ERK1/2表達為p-ERK1/2與ERK1/2光密度比值。

三、統計學方法

結果

1.LINC00221在HCC細胞中表達上調：LINC00221在HCC細胞HCCLM6(1.383±0.074)、Hep3B(1.432±0.100)、MHCC-97H(1.632±0.055)、Huh-7(1.640±0.106)、MHCC-LM3(1.982±0.096)中表達水平高于正常肝上皮細胞LO2(1.000±0.058),差異有統計學意義(P<0.05)。

2.HCC細胞中LINC00221的表達：空白對照組(1.000±0.057)和陰性對照組(0.964±0.048)中LINC00221相對表達水平差異無統計學意義；轉染LINC00221干擾序列1組(0.398±0.010，P<0.01)以及LINC00221干擾序列2組(0.285±0.025，P<0.01)LINC00221相對表達水平低于陰性對照組。說明siRNA-LINC00221轉染成功，后續體外功能驗證試驗將轉染LINC00221干擾序列2處理MHCC-LM3細胞。

3.LINC00221介導ERK信號通路對HCC細胞增殖的影響：空白對照組和陰性對照組MHCC-LM3細胞活力差異無統計學意義。LINC00221干擾組MHCC-LM3細胞活力低于陰性對照組，(P<0.01)；LINC00221干擾+ERK信號激動劑組MHCC-LM3細胞活力高于LINC00221干擾組(P<0.01)，見圖1。

圖1 干擾LINC00221對MHCC-LM3細胞增殖能力的影響

4.LINC00221介導ERK信號通路對HCC細胞遷移的影響：空白對照組(62.070±1.711)和陰性對照組(65.610±1.884)細胞劃痕愈合率差異無統計學意義；LINC00221干擾組MHCC-LM3細胞劃痕愈合率低于陰性對照組(38.790±2.899)；LINC00221干擾+ERK信號激動劑組MHCC-LM3細胞劃痕愈合率高于LINC00221干擾組(66.387±2.799，差異有統計學意義P<0.01)。見圖2。

圖2 干擾LINC00221對MHCC-LM3細胞遷移能力的影響(放大倍數100倍)

5.LINC00221介導ERK信號通路對HCC細胞侵襲的影響：空白對照組(171.667±3.283)和陰性對照組(183.333±8.413)穿膜細胞數量比較差異無統計學意義；LINC00221干擾組穿膜細胞數量低于陰性對照組(97.000±4.726)；LINC00221干擾+ERK信號激動劑組穿膜細胞數量高于LINC00221干擾組(162.667±4.485)，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 干擾LINC00221對MHCC-LM3細胞侵襲能力的影響(放大倍數100倍)

6.LINC00221對HCC細胞中ERK信號通路的影響：空白對照組和陰性對照組MHCC-LM3細胞中MEK1/2和p-ERK1/2表達差異均無統計學意義；LINC00221干擾組MHCC-LM3細胞中MEK1/2和p-ERK1/2表達水平低于陰性對照組；LINC00221干擾+ERK信號激動劑組MHCC-LM3細胞中MEK1/2和p-ERK1/2表達水平高于LINC00221干擾組，差異有統計學意義P<0.05(P<0.01)。見圖4。

討論

有研究顯示，lncRNA調控腫瘤細胞的多種惡性行為[2]。如在HCC中發現DLX6-AS1通過靶向調節miR-513c/Cul4A/ANXA10軸促進HCC生長[5]。HCC中低表達的NBR2提示HCC病人預后更差、惡性程度更高，可以通過ERK和JNK通路抑制Beclin 1依賴的細胞保護性自噬發生，抑制HCC細胞增殖[6]。lncRNA-POIR通過分泌miR-182-5p促進細胞上皮間質轉化，抑制索拉非尼敏感性[7]。

有研究發現，LINC00221在乳腺癌組織中表達是正常乳腺組織的2.1倍，與6種miRNAs存在靶向調控關系，介導下游靶mRNA差異表達[8]；另外LINC00221還與胃癌預后不良有關[9]。有研究團隊分析TCGA數據發現HCC組織中LINC00221過度表達，其高表達病人術后生存期更短，并可能與Hsa-miR-182和hsa-miR-96競爭作用[4,10]。然而，尚不清楚LINC00221表達失調是HCC誘發因素或僅是HCC預后標志。本研究首先檢測正常肝上皮細胞和HCC細胞株中LINC00221的表達，結果顯示，LINC00221在HCC細胞表達異常上調。我們在MHCC-LM3細胞轉染si-LINC00221干擾序列，檢測差異表達LINC00221對MHCC-LM3細胞增殖、遷移和侵襲過程的影響，在細胞水平進行功能驗證。結果顯示，干擾LINC00221表達MHCC-LM3細胞增殖活力降低，同時細胞的遷移侵襲能力均明顯減弱。以上結果提示，在HCC細胞中高表達的LINC00221可能通過促進細胞增殖、遷移和侵襲，加速HCC惡性發展，但其作用機制尚不清楚。

aP<0.01；1代表空白對照組、2代表陰性對照組、3代表LINC00221干擾組、4代表LINC00221干擾+ERK信號激動劑組圖4 LINC00221對MHCC-LM3細胞中MEK1/2和p-ERK1/2表達的影響

ERK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為一種信號轉導蛋白可傳遞有絲分裂原信號，定位于細胞質。激活的ERK被轉移到細胞核，調節轉錄因子活性并產生細胞效應。ERK家族包括5個亞家族ERK1～5，其中ERK1和ERK2參與調節不同的細胞生理過程[11]。激活的ERK信號通路促進了多種癌癥的發生和發展，參與細胞增殖、分化、凋亡、轉移和耐藥調控[12]。在HCC中，多種lncRNAs通過ERK信號影響癌癥進程。HOXD-AS1激活MEK/ERK信號加速HCC細胞周期進程[13]。ZFAS1通過miR-624/MDK/ERK/JNK/P38信號通路影響HCC發展[14]。本研究發現，干擾LINC00221表達后MHCC-LM3細胞中MEK1/2和p-ERK1/2表達減少，因此推測，LINC00221影響HCC細胞表型可能與ERK信號通路有關。我們干擾LINC00221同時加入ERK信號激動劑，發現ERK信號激動劑處理明顯逆轉了LINC00221干擾對MHCC-LM3細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，說明LINC00221通過激活ERK信號，促進HCC細胞增殖、遷移和侵襲生物學過程，發揮癌基因作用。ERK信號調控網絡十分復雜，LINC00221如何通過間接或直接作用機制誘導ERK活化尚不清楚。我們將進一步研究LINC00221是否能夠通過ceRNA等機制調控ERK信號軸，影響HCC惡性病變進展。