PCSK9 基因E670G 位點多態性與冠心病及血脂水平的相關性研究

曾圓圓,趙 靜,沈曉旭

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是指冠狀動脈發生粥樣硬化引起管腔狹窄或閉塞,導致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病,簡稱冠心病(coronary heart disease,CHD)。冠心病的發病機制復雜,目前尚未完全研究清楚。流行病學調查結果顯示,在冠心病眾多危險因素中,脂質代謝紊亂是冠心病發生和發展的重要一環[1]。人枯草溶菌素轉化酶(PCSK)9 基因功能獲得性突變會導致機體血脂代謝紊亂,血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平升高,增加冠心病風險[2]。本研究探討PCSK9 最常見的功能獲得性突變位點E670G 位點的多態性與冠心病和血脂水平的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究以北京中醫藥大學東直門醫院心血管一區和冠心病監護病房(CCU)為病例來源地。選取2021 年1 月—2022 年2 月住院病人99 例,其中,經冠狀動脈造影或既往病史可明確診斷為冠心病者作為病例組,選取同期住院病人,經冠狀動脈造影或既往病史明確不符合冠心病診斷標準者作為對照組。冠心病診斷參考《冠心病合理用藥指南(第二版)》中對于冠心病的診斷標準[3]。并根據《冠心病痰瘀互結證宏觀診斷標準研究》[4]對病例組病人進行辨證,分為痰瘀互結證和非痰瘀互結證。排除標準:有惡性腫瘤、血液系統疾病或者有免疫功能缺陷者;合并能夠引起體內激素變化的疾病,如垂體瘤、甲狀腺功能障礙、腎上腺素瘤、庫欣綜合征等;肝腎功能嚴重異常者;妊娠或哺乳期婦女。最終納入病例組71 例(男47 例,女24 例)、對照組28 例(男20 例,女8 例)。病人具體納入流程見圖1。本研究向所有入選病人告知參與本研究所需要承擔的風險及獲益情況,并通過北京中醫藥大學東直門醫院倫理審查委員會審查批準。

圖1 技術路線圖

1.2 臨床資料收集及血清采集 所有病人利用病例記錄表(Case Record Form,CRF)記錄病人的基本信息以備后續分析使用。在病人空腹8 h 后晨起抽取靜脈血5 mL 置于EDTA 抗凝管中,混勻后置于-80 ℃冰箱保存以備后續提取DNA。

1.3 外周血PCSK9基因E670G位點基因型檢測 首先利用組織DNA 提取試劑盒(D Neasy Blood & Tissue Kit)提取DNA。再利用大連寶生物技術有限公司合成PCSK9基因E670G 位點引物(E670G-F GAGATACACGGTTGTGTCCCAA;E670G-RT GAGAGAGGGACAAGTCGGAA)進行基因組PCR 擴增。具體PCR 反應條件為:94 ℃預變性5 min,然后進行35 個循環(94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s),然后再進行72 ℃延伸7 min。反應完成后的PCR 產物用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒回收。最后取純化后的 PCR 產物,使用測序儀ABI3730-XL 進行DNA 測序。

1.4 血脂指標檢測 血脂指標為病人入院常規檢查項目,檢測由東直門醫院檢驗科生化室完成,利用CRF 表記錄病人的血脂信息。

1.5 統計學處理

1.5.1 一般資料分析 采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據處理,符合正態分布的定量資料以均數±標準差(±s)表示,兩組間比較方差齊者采用t檢驗,方差不齊者采用校正t檢驗。不符合正態分布的定量資料則以中位數和四分位數[M(P25,P75)]表示,兩組間比較采用非參數檢驗(Mann-WhitneyU檢驗)。定性資料以百分比(%)表示,兩組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

1.5.2 Hardy-Weinberg 平衡檢驗 應用Pearsonχ2檢驗分析PCSK9 E670G 基因型以及等位基因頻率的分布是否滿足Hardy-Weinberg 平衡定律,以P＞0.05表示樣本具備群體代表性。

2 結 果

2.1 病例組與對照組臨床資料比較 病例組與對照組性別分布差異無統計學意義(P＞0.05);兩組年齡比較差異有統計學意義(P＜0.001);兩組吸煙史、飲酒史、糖尿病比較差異均無統計學意義(P＞0.05),但病例組高血壓比例高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05);病例組冠心病家族史比例高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 病例組與對照組臨床資料比較

2.2 病例組與對照組PCSK9 基因E670G 位點基因型與等位基因頻率分布

2.2.1 兩組PCSK9 基因E670G 位點多態性及測序結果 E670G 位點A 等位基因為野生型,G 等位基因為突變型。經過基因測序發現,本研究中的99 例血樣本中PCSK9 基因E670G 位點有AA、AG 兩種基因類型。其序列峰圖見圖2、圖3。

圖2 PCSK9 基因E670G 位點AG 型多態性序列

圖3 PCSK9 基因E670G 位點AA 型多態性序列

2.2.2 Hardy-Weinberg 平衡檢驗 經過Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗,兩組PCSK9 基因E670G 位點基因型的分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡(P＞0.05),表明所有參與研究人員來自同一孟德爾人群,群體代表性良好。詳見表2。

表2 PCSK9 基因E670G Hardy-Weinberg遺傳規律檢驗結果 單位:例(%)

2.2.3 兩組PCSK9 基因E670G 位點基因型與等位基因頻率分布 基因測序發現PCSK9 基因E670G 位點有AA、AG 兩種基因類型,兩種基因型及等位基因在病例組與對照組的分布情況見表3。病例組基因型AA、AG 的例數依次為60 例(84.5%)、11 例(15.5%);對照組基因型AA、AG 的例數依次為22 例(78.6%)、6例(21.4%)。經檢驗病例組和對照組PCSK9 基因E670G 位點的AA、AG 基因型頻率分布差異無統計學意義(P＞0.05)。病例組等位基因A、G 的例數依次為131 例(92.3%)、11 例(7.7%);對照組等位基因A、G的例數依次為50 例(89.3%)、6 例(10.7%)。經檢驗兩組A、G等位基因頻率分布差異無統計學意義(P＞0.05)。

表3 PCSK9 基因E670G 基因型及等位基因頻率分布情況 單位:例(%)

2.3 病例組E670G 位點不同基因型血脂水平比較AA 型和AG 型病人總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、LDL-C 水平方面差異均有統計學意義(P＜0.05)。其中,AA 型病人HDL-C 中位數為1.15 mmol/L,高于AG 型病人(0.98 mmol/L),但AG 型 病 人TC、TG、LDL-C水 平均高于AA 型 病 人,差異均有統計學意義(P＜0.05)。詳見表4。

表4 病例組PCSK9 E670G 位點不同基因型血脂水平比較 單位:mmol/L

2.4 對照組E670G 位點不同基因型血脂水平比較對照組AA 型和AG 型之間TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平比較,差異均無統計學意義(P＞0.05)。詳見表5。

表5 對照組PCSK9 E670G 位點不同基因型血脂水平比較 單位:mmol/L

2.5 病例組痰瘀互結證與非痰瘀互結證血脂水平比較 痰瘀互結證組與非痰瘀互結證組TC、TG、LDL-C水平比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。但兩組HDL-C 水平比較差異有統計學意義(P＜0.05)。其中,痰瘀互結證病人HDL-C 水平中位數為0.98 mmol/L,低于非痰瘀互結證病人(1.18 mmol/L)。詳見表6。

表6 病例組不同證型血脂水平比較 單位:mmol/L

2.6 病例組不同證型PCSK9 基因E670G 位點基因型比較 基于以上結果可知,痰瘀互結證和非痰瘀互結證病人HDL-C 水平差異有統計學意義,而病例組HDL-C 水平在PCSK9 基因E670G 位點AA 型和AG型之間差異也有統計學意義,為了進一步探索冠心病證型與E670G 位點基因型之間的關系,經χ2檢驗,兩種證型基因型分布差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表7。

表7 病例組不同證型PCSK9 基因E670G 位點基因型比較 單位:例(%)

3 討 論

冠心病的發病機制復雜,現有研究認為,冠心病是個人遺傳因素、生活行為方式和環境因素相互作用而引起的復雜性遺傳性疾病。本研究中,冠心病病人冠心病家族史比例高于對照組,這也證實了遺傳因素與冠心病的發病密切相關。PCSK9 由Seidah 等[5]于2003 年首次在小腦和端腦腦細胞中發現,為前蛋白轉化酶(proprotein convertase,PC)家族的第9 個成員。PCSK9 基因突變可以導致其編碼蛋白的功能發生改變,不同的突變類型導致血液中的膽固醇水平呈現完全相反的變化,與冠心病的發生密切相關。其中,E670G 是目前已知的功能獲得性突變位點之一,也是目前在PCSK9 基因多態性與血脂水平相關性中研究最多的位點,諸多研究也證實了PCSK9 基因E670G與冠心病不同程度相關[2,6-9]。本研究證實,病例組AA基因型病人HDL-C 水平高于AG 基因型病人,但AG基因型病人TC、TG、LDL-C 水平高于AA 基因型病人。王梅等[10]也認為PCSK9 與LDL-C、載脂蛋白B(ApoB)水平呈正相關。單雪峰等[11]針對新疆維吾爾族人的研究表明,冠心病病人PCSK9 基因E670G 多態性與TC、LDL-C 水平升高相關。深入到機制層面,可能與E670G 位點的突變能夠增加PCSK9 的功能,血清PCSK9 水平異常增高相關。PCSK9 基因編碼一種酶,該酶已經被證明參與降解細胞溶酶體中的低密度脂蛋白膽固醇受體(LDL-R),并阻止其循環到肝細胞表面。因此,PCSK9 的功能獲得性突變會導致LDL-R降解增加,細胞表面受體數量減少,進而導致機體血脂代謝紊亂,血清LDL-C 水平升高,而高水平的LDL-C和冠心病風險增加有關。另有研究表明PCSK9 也可以不通過血脂直接作用于血管內皮,促進動脈粥樣硬化的發生[12]。其機制可能與泡沫細胞形成[13]、誘發血管炎癥[14]、誘導血管內皮細胞和巨噬細胞凋亡[15]、促進血管平滑肌細胞分化[16]等相關。這些新機制的發現為PCSK9抑制劑防治動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)提供了理論依據,也是目前降脂治療的新方向。

關于PCSK9 基因多態性與心血管疾病的相關性研究也有很多,本研究中病例組和對照組基因型及等位基因分布差異均無統計學意義,這與其他相關研究的結果[11]并不一致,張楠等[17]采用Logistic 回歸分析校正了性別、年齡、體質指數等危險因素后發現G 等位基因的個體發生冠心病的風險高于A 等位基因個體。楊文艷等[2]也證實老年冠心病病人PCSK9 基因E670G 位點存在A 向G 的基因突變,AG 和GG 突變基因型是冠心病的危險基因型。但也有與本研究相似結論認為PCSK9 基因E670G 多態性與冠心病發病無關[8]。或許一項綜合多個研究、樣本量較大的Meta 分析[18]結果更能說明問題:無論是在亞洲人群還是高加索人群中,PCSK9 基因E670G 多態性均與冠心病相關,漏斗圖未發現明顯的發表性偏倚。不同的研究呈現完全相反的結果,考慮可能與PCSK9 基因的遺傳規律相關,有研究表明PCSK9 基因的突變受到性別[19]、種族[20-21]甚至地區[22]等因素的影響。因此,PCSK9 基因多態性與冠心病關系仍需要大樣本的臨床研究來驗證。

PCSK9 基因多態性與冠心病中醫證型之間的相關性鮮見報道。本研究結果顯示,AA、AG 基因型在冠心病痰瘀互結證和非痰瘀互結證之間的分布差異無統計學意義,但兩證型之間HDL-C 水平存在差異,也許能夠為痰瘀互結證的識別提供微觀依據,具體機制仍有待進一步探討。