兩和輔心飲通過NRG1-ErbB2 通路對心肌細胞損傷的干預研究

秦 琦,王有雪,左 芳,王東海

心肌梗死(MI)是在冠狀動脈粥樣硬化的基礎上,因斑塊破裂導致急性血供中斷,造成心肌缺血壞死的一種疾病,是致死率最高的疾病之一,嚴重威脅人類健康。近年來,該疾病的發病率急劇上升,而且呈現年輕化趨勢,造成病人的生活質量嚴重下降[1]。近年來在藥物治療缺血性心肌損傷方面有了最新進展,神經調節蛋白1(NRG1)/erb-b2 受體酪氨酸激酶(ErbB)2 通路成了國內外最新研究熱點,有研究表明,NRG1-ErbB2 通路可以減少心肌細胞的缺血損傷、凋亡,抑制心肌細胞增殖及平滑肌過度增生[2]。Polizzotti 等[3]研究應用局部冷凍的方法損傷新生小鼠的心肌細胞,應用NRG1 治療后心肌細胞功能明顯保留,而且依然保持了心肌細胞的再生能力。有研究推測NRG1 療法有可能是通過刺激新生血管來保護心肌免于損傷[4]。而且有研究表明缺氧可以增高內質網壓力,并誘導心肌凋亡,而NRG1 療法可以減少其導致的心肌細胞損傷從而保護心臟[5]。然而大量補充NRG1 存在副作用,如心功能損傷及致癌風險等,因此,合理的劑量及應用療程成了目前研究的熱點。中醫學在冠心病治療上具有安全有效、副作用小等獨特的優勢。前期臨床研究表明,兩和輔心飲具有理氣和血、寧心安神之功效,能有效改善冠心病病人疼痛及活動后氣短等臨床癥狀。另外,還發現部分病人服用兩和輔心飲后復查心臟彩超梗死面積較前縮小,但具體作用機制尚不清楚。因此,進一步研究其作用機制是本課題組下一步擬進行的工作。結合前期預實驗結果,本研究旨在尋找兩和輔心飲與心肌代謝通路NRG1-ErbB2 的關系,并探討其對心肌細胞損傷的修復作用,以期為冠心病的治療以及該方劑的進一步臨床應用提供科研數據支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組與取材

1.1.1 實驗動物與分組 3～6 月齡無特定病原體(SPF)級Wistar 雄性大鼠80 只,體質量(200±20)g,實驗動物均由遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供,動物許可證號:SCXK(遼)2018-0001。適應性喂養1 周。按隨機數字表法隨機分為5 組:假手術組(Sham 組)、模型組(MIRI 組)、低劑量組、中劑量組、高劑量組,每組16 只。

1.1.2 動物造模方法 參照楊建業等改進的造模方法,制造液氮冷凍大鼠心肌梗死模型[6]。取Wistar 大鼠,按照250 mg/kg 劑量腹腔注射10%水合氯醛,待其麻醉成功后氣管切開、插管,應用動物呼吸機正壓輔助通氣。胸部去毛,消毒,沿左鎖骨中線縱行切開皮膚2～3 cm,分別剝離深淺筋膜,在第4 肋間或第5 肋間鈍性分離肌層,撕開心包,用棉簽推開胸腺,暴露心臟,在主動脈根部約1/3 處找到左冠狀動脈,用圓柱形鋼釘頭部(頭直徑0.2 cm)迅速置于該區域并冷凍約10 s。此時觀察心電圖動態變化,如發現兩個及以上導聯出現ST 段上抬＞0.2 mV 且肉眼可見被冷凍的區域心肌逐漸變灰白,結霜,繼而呈紅色腫脹,即可判斷手術成功。術后常規應用青霉素3 d(每只每天10×104U)以預防感染,加強營養支持1 周。

1.1.3 給藥方案及取材 按“動物與人體的每千克體重劑量折算系數表”確定低、中、高劑量,折合大鼠生藥量為0.96 g/100 g,1.92 g/100 g,3.84 g/100 g;按10 mL/kg 給藥體積及大鼠體質量計算給藥量,灌胃給藥,假手術組及模型組給予等量蒸餾水。兩和輔心飲由遼寧中醫藥大學附屬第二醫院制劑中心提供。每日灌胃給藥2次,連續給藥21 d。實驗結束后禁食不禁水12 h,予10%水合氯醛麻醉,沿著左鎖骨中線用剪刀剪開皮膚,以鈍器分離組織,暴露心臟,取左心室前壁壞死區及周圍的心肌組織,一部分予10%甲醛溶液固定;另一部分心肌組織存于EP 管中,置于-70 ℃冰箱備用。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑與耗材 蘇木素-伊紅(HE)染液試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司,KGA224);蘇木素染色液(南京建成公司,D005);二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司,1330-20-7);中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司,10004160);磷酸鹽緩沖液(PBS)(KGB5001)、檸檬酸鈉緩沖液(KGB5001)、免疫組化筆(KGSP10)、全蛋白抽提試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白含量檢測試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒(KGP113)、預染蛋白分子量(KGP441)、5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(KGP101)、1 × Tris-甘 氨 酸 蛋 白 電 泳 緩 沖 液(KGP103X)、蛋白質免疫印跡(Western Blot)法檢測試劑盒,均購自江蘇凱基生物技術股份有限公司;NC膜(USA PALL 66485);TRIzol(美國Invitrogen 15596-026);氯仿、異丙醇(南京化學試劑500 mL);70%乙醇[焦碳酸二乙脂(DEPC)處理]、0.1% DEPC Water(江蘇凱基生物技術股份有限公司,KGDN4500);cDNA 第一鏈合成試劑盒(日本TaKaRa RR036B);One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ(SYBR Green,日本TaKaRa RR086B)。

1.2.2 儀器與設備 電熱扶風干燥箱(上海圣欣科學儀器有限公司101AS-3);生物熒光顯微鏡(日本Olympus,BX43);臺式恒溫振蕩器(中國上海精宏實驗設備有限公司,THZ-312);電泳儀(美國Bio-rad Power Supplies Basic);Trans-Blot Turbo 全能型蛋白轉印系統(美國Bio-rad,170-4150);凝膠成像系統(英國SYNGENE G:BOXChemiXR5);臺式恒溫振蕩器(上海精宏實驗設備有限公司,THZ-312);脫色搖床(江蘇正基儀器有限公司);渦旋振蕩器(海門其林貝爾,XW-80A);高速冷凍離心機(美國Thermo Sorvall ST,16R);多功能酶標儀(美國 MD Spectramac,M3);pH 計(美國OHAUS STARTER,2C);立式壓力鍋(上海博訊醫療生物儀器股份有限公司,YXQ-LS-50);電熱鼓風干燥箱(上海圣欣科學儀器股份有限公司,101AS-3);分析天平(德國Sartorius,BL310/BL21S);超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司,SW-CJ-1FD);臺式低速離心機(上海醫療器械有限公司);紫外光度儀(日本SHIMADZU,UV-2450);普通梯度聚合酶鏈式反應(PCR)儀(美國ABI Veriti 96 well Thermal cycler);熒光定量PCR 循環儀(美國ABI Step one plus Real time-PCR system)。

1.3 HE 染色 按常規方法進行脫蠟,水合,將切片用二甲苯浸泡5 min,更換二甲苯后再浸泡5 min;分別于無水乙醇中浸泡5 min;在95%、85%、70%的乙醇中分別浸泡5 min,PBS 浸洗3 min×3 次;浸入試劑盒中試劑一核染液染缸內染色3～5 min,水洗30～60 s;浸入試劑盒中試劑二分色液Ⅰ中約20 s,水洗30～60 s;浸入試劑盒中試劑三分色液Ⅱ中40 s,水洗30～60 s;置于試劑盒中試劑死漿染液中染色2 min,再用試劑五增色液洗去多余染液,洗2 次,濾紙吸干,封片鏡檢。用光學顯微鏡400 倍視野下觀察心肌組織病理情況。

1.4 Western Blot 檢測 蛋白提取定量,進行SDSPAGE,而后使用半干轉移系統轉膜,完成后按比例依次加入一抗、二抗進行孵育,孵育最佳時間后進行化學發光、顯影、定影、拍照并晾干。用掃描儀掃描圖片后結果進行灰度分析(Gel-Pro32 軟件)。

1.5 實時熒光定量PCR(RT-PCR) ①RNA 提取:將心肌組織切碎放入研缽中,加入1 mL 預冷的TRIzol,研磨至無明顯的顆粒,將樣品倒入1.5 mL 離心管中,室溫下放置5 min 后;加入氯仿,蓋緊管蓋后,將其上下振蕩約15 s,在室溫下再靜置3 min;然后以1 200 r/min、4 ℃離心15 min;小心吸取上清至空白離心管,并加入等體積的異丙醇,其后再慢慢混勻,常溫靜置約10 min;再次以1 200 r/min、4 ℃離心10 min;去除上清,并沿管壁加入70%乙醇1 mL,搖勻;1 200 r/min、4 ℃離心10 min;在室溫下干燥沉淀5 min,加入無RNase 水30～50 μL溶解RNA 沉淀,于-70 ℃條件下保存。②cDNA 第一鏈合成(20μL 體系):混勻,2 000 r/min 條件下離心20 s;取0.2 mL PCR 管,加 入 RNA(2 μg)2 μL,5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL,無核酸酶的雙蒸水至總體積10μL;輕輕混勻后,然后以2 000 r/min 離心20 s,37 ℃保溫15 min,85 ℃保溫5 s,然后置于冰上5 min;立即進行下一步的PCR 反應。RT-PCR 正式實驗:每個樣本基因做3 個復孔,在0.1 mL PCR 管依次加入如下組分:2× RT-PCR Master Mix(SYBR Green)10μL;模板(cDNA 稀釋10 倍)1 μL;引物MIX(F/R 各10 μmol/L)2 μL;0.1% DEPC 水7 μL;Total volume 20μL。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0 軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料用均數±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HE 染色觀察心肌組織病理變化 Sham 組:心肌細胞排列整齊,界限清楚,無變性,未見間質充血,未見炎性細胞浸潤。MIRI 組:心肌細胞紊亂,界限不清,心肌細胞腫脹明顯,無變性,部分間質充血,可見炎性細胞浸潤。低劑量組:心肌細胞紊亂,界限不清,心肌細胞腫脹有所減輕,無變性,部分間質充血,可見炎性細胞浸潤。中劑量組:心肌細胞紊亂,界限不清,心肌細胞腫脹有所減輕,無變性,部分間質充血,可見炎性細胞浸潤。高劑量組:心肌細胞排列整齊,界限清楚,部分心肌細胞腫脹,無變性,部分間質充血,可見炎性細胞浸潤。詳見圖1。可見,經過兩和輔心飲治療后,低劑量組、中劑量組、高劑量組心肌細胞排列逐漸整齊,心肌細胞腫脹明顯減輕,間質充血減輕,炎性細胞浸潤有所緩解。

圖1 各組大鼠心肌組織HE 染色結果

2.2 各組NRG1、ErbB2 蛋白表達情況比較 以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參,與Sham 組比較,MIRI 組NRG1、ErbB2 蛋白表達均降低,差異有統計學意義(P＜0.05);低劑量組、中劑量組、高劑量組NRG1及ErbB2 蛋白表達隨著藥物濃度的增加而升高,呈劑量依賴性,差異均有統計學意義(P＜0.05)。另外,蛋白相對表達水平(經內參GAPDH 校正后以NRG1/GAPDH、ErbB2/GAPDH)灰度分析顯示:與MIRI 組比較,各給藥組NRG1/GAPDH 表達水平明顯升高,ErbB2/GAPDH 表達水平也升高,并呈劑量依賴性,差異均有統計學意義(P＜0.05)。詳見圖2、表1。

圖2 Western Blot 法檢測各組大鼠心肌細胞蛋白表達條帶圖

表1 各組GAPDH 校正值灰度分析(±s)

表1 各組GAPDH 校正值灰度分析(±s)

MIRI 組與Sham 組比較,①P ＜0.05;與MIRI 組比較,②P ＜0.05。

組別 只數 NRG1/GAPDH ErbB2/GAPDH Sham 組 16 0.62±0.03 0.59±0.07 MIRI 組 16 0.22±0.02① 0.10±0.01①低劑量組 16 0.30±0.01② 0.17±0.01②中劑量組 16 0.46±0.01② 0.35±0.01②高劑量組 16 0.52±0.01② 0.43±0.01②

2.3 各組NRG1、ErbB2 mRNA 表達情況比較 采用RT-PCR 法檢測各組NRG1、ErbB2 mRNA 表達情況,與Sham 組相比,MIRI 組NRG1、ErbB2 的mRNA 表達水平明顯降低(P＜0.05)。表明隨著心肌缺血缺氧的發生,NRG1、ErbB2 在心肌中的含量降低。低劑量組、中劑量組、高劑量組NRG1、ErbB2 mRNA 表達水平較MIRI 組明顯升高(P＜0.05),且劑量越高其mRNA 表達越接近于Sham 組,呈劑量依賴性。詳見表2。

表2 各組NRG1、ErbB2 mRNA表達水平比較(±s)

表2 各組NRG1、ErbB2 mRNA表達水平比較(±s)

MIRI 組與Sham 組比較,①P ＜0.05;與MIRI 組比較,②P ＜0.05。

組別 只數 NRG1 ErbB2 Sham 組 16 1.00±0.04 1.00±0.06 MIRI 組 16 0.26±0.02① 0.33±0.02①低劑量組 16 0.42±0.02② 0.52±0.01②中劑量組 16 0.70±0.01② 0.74±0.04②高劑量組 16 0.87±0.03② 0.83±0.03②

3 討 論

冠心病以冠狀動脈粥樣硬化為基礎病理改變,其發生發展機制與炎癥反應、氧化應激及細胞損傷等相關。NRG1 作為表皮生長因子家族成員之一,在心血管系統含量最多[6-7],通過激活ErbB2 參與心肌細胞的生長繁殖,具有維持心肌細胞結構及功能的重要作用[8]。NRG1 可激活多重下游信號通路,進而維持心肌細胞的正常功能[9]。酪氨酸激酶受體(ErbBs)分為4 個亞型,其中,分布在心肌細胞的為ErbB2、ErbB4。ErbB2 作為表皮生長因子家族中的一員,有研究發現在單核細胞、巨噬細胞等細胞類型中表達,據報道,其出現在動脈粥樣硬化性損傷處,且由配體受體相互作用被激活后參與調節細胞增殖和凋亡的多條信號通路[10-11]。有研究表明,NRG1-ErbB2 通路在心力衰竭心臟修復及心肌再生中起到了很重要的調節作用[12]。還有研究顯示,冠心病急性心肌梗死導致心肌肥厚,通過補充重組NRG1 可改善其癥狀及心肌細胞存活,表明NRG1-ErbB2 信號通路參與心肌細胞生長繁殖并對維持心肌細胞結構和功能發揮重要作用[13-14]。因此,研究中藥湯劑對該通路的影響可能提示該藥對心肌細胞損傷有修復作用。目前國內研究中藥對此通路干預的文獻較少,具有很好的研究價值。冠心病屬中醫學“胸痹”“心痛”范疇,“陽微陰弦”是對“胸痹”“心痛”病機的高度概括,“陽微”意指上焦陽氣不足,“陰弦”指下焦陰寒氣盛,由于上焦陽氣不振,陰寒之邪乘虛而犯,痹阻胸陽,胸陽失展,則發胸痹而痛,乃本虛標實之證。胸痹心痛虛多實少,乃“心氣不足,營氣不周”,根據“損其心者,調其營衛”的原則,以補為本,以通為用。本研究選用具有益氣活血通絡功效的兩和輔心飲,由黨參、丹參、雞血藤、郁金、石菖蒲、沒藥、香附、遠志、茯神、砂仁、檀香、三七組成。方中以黨參一味為君藥,大補心氣;丹參、雞血藤為臣藥,養血活血;三七為佐藥,化瘀止痛;遠志、菖蒲、香附子、茯神4 味為使藥,化痰開竅、調氣安神,這4 味藥又暗合《千金要方》定志丸、《雜病源流犀燭》交感丹在內,共同交通心腎,定志寧心。雞血藤為養血活血藥,郁金活血而不傷正氣,石菖蒲具有止痛、運中、強心作用,本方目的是“助心氣”,意在以補心氣則推動血行,合丹參飲活血化瘀,行氣止痛,血行通暢,則痰瘀可化解于無形。現代藥理研究表明,作為黨參主要成分之一的黨參蒼術內脂Ⅲ具有明顯的抗炎作用[15]。另外,丹參還能夠擴張動脈,尤其是對于冠狀動脈和肢體動脈,擴張作用顯著[16]。

本課題組前期臨床研究表明該方能明顯減少梗死后心絞痛病人的發作次數,但該方的作用機制尚不明確。本研究結果顯示,經過兩和輔心飲治療后,大鼠心肌細胞排列逐漸整齊,心肌細胞的腫脹程度明顯減輕,間質充血減輕,炎性細胞浸潤有所緩解,體現其對心肌細胞具有一定保護作用。應用兩和輔心飲能明顯提高大鼠心肌細胞NRG1-ErbB2 的蛋白表達,并呈劑量依賴性;另外RT-PCR 結果也表明,應用兩和輔心飲后,NRG1-ErbB2 的mRNA 表達上調。提示兩和輔心飲對該通路的表達確實存在上調作用。因此,推斷兩和輔心飲可以通過上調NRG1-ErbB2 通路改善心肌細胞損傷。另外,該方是否對心肌損傷的其他機制存在影響,需要進行下一步研究。

綜上所述,兩和輔心飲可以上調NRG1-ErbB2 代謝通路,并推斷其修復心肌細胞損傷作用可能是通過調節該通路實現的。