基于數據挖掘和網絡藥理學探究治療跌打損傷的用藥規律及其作用機制

鄒福賢，周曉蘭，溫秀萍

(1.福建中醫藥大學附屬泉州市正骨醫院，福建 泉州 362000；2.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350000)

唐代《外臺秘要》將損傷分為兩種，一者外損，一者內傷；其中外損屬于中醫“傷筋”范疇，現代稱之為軟組織損傷，主要指人體關節周圍組織、肌肉遭受外來暴力撞擊、強力扭轉或牽拉等因素引起[1]。西醫治療軟組織損傷主要依靠一些抗炎藥，起到抗炎止痛的作用，但是其副作用比較明顯，如可能合成類固醇，影響人體正常激素水平。中醫在治療外損方面具有較多的相關文獻記載，雖然近年來也有部分學者對某一著作，如《跌打大全》[2]、《四部醫典》[3]、《中國藥典》[4]以及少數民族醫藥[5]等進行跌打損傷用藥規律分析，這些研究對于各代名醫的傳承無疑具有重要意義，但是現有研究尚缺乏對歷代所有方劑中治療跌打損傷用藥規律的綜合研究，也尚未有對內服藥和外用藥進行比對的研究，并且關于軟組織損傷治療機制的研究也較少，有待深入挖掘。《中醫方劑大辭典》是對所有從古至今名方的匯總，收方約10萬首，內容全面，因此為深入分析古人治療跌打損傷的用藥規律，探討治療跌打損傷的新思路和方法，本研究采用古今醫案云平臺(V2.3.5)從中藥組成、中藥性味、歸經、四氣五味等角度進行統計分析、關聯分析、復雜網絡分析，探究《中醫方劑大辭典》中治療外損的用藥規律，并結合網絡藥理學闡明其作用機制，為臨床治療提供數據支撐。

1 資料與方法

1.1 資料來源與納入標準

以“軟組織”“跌損”“跌仆”“跌撲”“跌打”“閃跌”“傷損”“損傷”“撲損”“仆損”“打撲”“打仆”“傷筋”“挫傷”“挫閃”“閃挫”“扭傷”和“折傷”等為關鍵詞，對《中醫方劑大辭典》中所有方劑的功效主治進行篩選，并將該方劑導入到跌打損傷數據庫。

1.2 排除標準

①排除方劑的主治中包含上述關鍵詞，但并非治療跌打損傷的方劑，如五臟虛勞損傷、產前產后傷損、眼目傷損等；②排除僅有功效主治但無中藥組成的方劑；③排除藥物組成相同的方劑。

1.3 數據規范化

參考《中國藥典(2020版)》和《中藥大辭典》中的藥材名，對部分異名進行規范化訂正，如樸硝修改為芒硝、西黃改為牛黃、當門子改為麝香等；其中難以考證者，保留其原名。采用雙人單獨數據規范化修訂，并比較兩人修訂的異同，然后進一步修訂。

1.4 數據錄入和分析

將修訂后的數據導入古今醫案云平臺中，通過數據挖掘模塊進行藥物頻次統計、藥性分析、規則關聯分析。

2 結果

2.1 處方納入情況

通過篩選，初步篩選出1 254首方劑，比對排除標準，逐一檢查后，剩余1 027首用于治療跌打損傷的方劑，其中涉及藥物976味。

2.2 處方出處分析

對1 027首方劑的出處進行統計，所涉及古今醫書209本，主要來自明、宋、清三個時期編撰的醫學古籍。收載最多的為《普濟方》，《普濟方》全書有6萬余首方劑，是我國現存最大的古代方書，其中跌打損傷相關方劑76首；《圣濟總錄》收載方劑近2萬首，為北宋時期搜方較多的醫學全書，其中跌打損傷相關方劑60首。見表1。

表1 跌打損傷方劑主要出處

2.3 處方劑型分析

跌打損傷為外傷，其治療方式主要有外用和內服兩種，涉及用藥劑型主要有散劑、膏劑、湯劑、丹、丸劑、酒劑以及其他劑型，如酊劑、片劑和貼劑等。內服藥占整個跌打損傷藥的61%，主要為散劑、湯劑和丹劑，而外用藥主要為膏劑和散劑。見表2。

表2 跌打損傷方劑劑型頻數

2.4 藥物頻次統計

對藥物頻次進行分析后，發現近一半的方劑中都含有當歸，其次超過1/3的方劑含有乳香和沒藥，其他藥物如白芷、川芎、甘草、赤芍、大黃、紅花、血竭等頻次均超過15%，見表3和圖1。內服藥和外用藥之間的藥物頻次存在一定的差異，兩種治療方法中出現頻次均較高的有當歸、乳香、沒藥、赤芍和白芷，其中內服方劑中當歸出現的頻次遠遠高于其他藥物，而在外用方劑中的頻次略高于其他藥物，另外白芷在外用方劑中出現的頻次較內服方劑有顯著提升。不同之處在于內服方劑中還高頻率使用了甘草以及川芎、紅花、血竭、自然銅等活血化瘀藥物；而外用方劑則高頻率使用了大黃以及草烏、川烏、防風、羌活等祛風止痛藥物。

表3 跌打損傷內服方劑和外用方劑藥物頻次

2.5 藥物四氣、五味統計

在所有的藥物組成中，四氣統計將大熱歸屬于熱，大寒、微寒均歸屬于寒，微溫歸屬于溫，結果發現溫性藥和平性藥占絕大多數；在五味統計中，澀味歸屬于酸，淡味歸屬于甘，據此統計出辛、苦味藥物最多，而酸、咸味藥物最少。見表4。

圖1 跌打損傷方劑的藥物頻次

表4 跌打損傷方劑中所有藥物的四氣五味頻次

2.6 藥物性味歸經統計

對所有藥物的歸經進行統計，發現內服藥和外用藥在歸經上并無太大差異，所有藥物大多數入肝經，其次為入脾經和心經。見表5。

表5 跌打損傷方劑中所有藥物的歸經頻

2.7 藥物關聯度分析

對方劑中含有的藥物組合出現的頻次進行分析，以發現藥物之間的關系。篩選出置信度(同時包含兩種藥的方劑在所有包含其中一種藥物的方劑中的占比)超過0.8的，其對應的提升度均大于1，說明藥物之間正相關性越強。乳香-沒藥、乳香-血竭、沒藥-血竭、當歸-赤芍、當歸-川芎和當歸-羌活藥對無論在內服方劑還是在外用方劑中關聯性都非常高，在內服方劑中，當歸與紅花、桃仁、生地、肉桂的關聯性較高，而在外用方劑中當歸還與獨活和續斷的關聯度較高，另一個較大的差異是外用方劑中川烏-草烏、荊芥-防風常配伍使用，見表6、表7和圖2。因此內服方劑核心藥組為當歸、川芎、羌活、紅花、赤芍、生地、桃仁、肉桂、乳香、沒藥和血竭；外用方劑核心藥組為當歸、川芎、羌活、赤芍、獨續斷、乳香、沒藥、血竭、川烏、草烏、荊芥和防風。

表6 內服方劑中藥物關聯性分析

表7 外用方劑中藥物關聯性分析

2.8 聚類分析

采用歐式距離法篩選前20個藥物進行聚類分析，見圖3。可將內服方劑核心藥物組分為三類：第一類為當歸；第二類為乳香、沒藥、血竭、自然銅和骨碎補等，剩余的甘草、大黃、蘇木、紅花等14中藥為第三類。外用方劑同樣可分為三類：第一類為血竭、乳香和沒藥；第二類為當歸和白芷；第三類為木鱉子、白及、赤芍、肉桂和大黃等15味中藥。

2.9 內服方劑作用機制分析

2.9.1 內服方劑核心藥組-有效成分-靶點網絡 采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TC-FMSP)獲取核心藥組的化學成分和相應的作用靶點。根據化學成分的藥動學參數按口服生物利用度OB≥30%且類藥性DL≥0.18為篩選有效成分的條件；然后檢索TCMSP數據庫有效成分的作用靶點，并利用Uniprot數據庫將靶點名稱標準化。疾病的靶點在GeneCards數據庫和CTD數據庫中以關鍵詞“Soft Tissue Injury”進行查找，并與有效成分對應的靶點取交集。結果除血竭和肉桂外檢索到9味中藥中符合上述條件的共有137個有效成分，并獲取到65個作用靶點(其中43個成分未檢索到靶點)。利用Cytoscape 3.2.1軟件構建“核心藥組-有效成分-靶點網絡圖”，見圖4。中藥中自由度較高的為沒藥、乳香、桃仁、紅花和羌活，當歸和生地的自由度較低；有效成分的平均自由度為4.3，自由度超過2倍平均值的有效成分有21個，見表8；靶點的平均自由度為6.6，自由度超過2倍平均值的靶點分別為PTGS2、NOCA2、PGR、HSP90AA1、NR3C2和GABRA1。

注：橙色：內服方劑；藍色：外用方劑；線上數值：共現度。

圖3 內服方劑(A)及外用方劑(B)排名前20的藥物聚類

注：圓形代表中藥；菱形代表有效成分；“V”形代表靶點。

表8 內服方劑核心藥組有效成分

2.9.2 GO富集分析和KEGG通路分析 將“2.9.1”項下獲取的靶點，應用R語言軟件中的BiocManager包進行GO富集分析和KEGG通路分析。以GO富集條目中的FDR<0.05為篩選顯著富集的GO條目條件，結果生物過程(BP)具有986條，細胞成分(CC)有40條，分子功能(MF)有103條，每個項目排名前10的條目，見圖5；其中BP包括對類固醇激素的反應(response to steroid hormone)、循環系統中的血管過程(vascular process in circulatory system)和細胞對藥物的反應(cellular response to drug)等；CC主要與突觸膜有關，如integral component of postsynaptic membrane、intrinsic component of postsynaptic membrane和integral component of synaptic membrane等；MF包括G蛋白偶聯胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)和兒茶酚胺結合(catecholamine binding)等。KEGG通路富集分析同樣以FDR<0.05為篩選條件，獲得105條具有顯著富集的通路，排名較前的通路主要為脂質和動脈粥樣硬化(Lipid and atherosclerosis)、神經活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)和化學致癌作用-受體激活(Chemical carcinogenesis-receptor)等，見圖6。

3 討論

《傷科補要》記載：“夫跌打損傷，墜墮磕之證，專從血論。或有瘀血停積，或為亡血過多，然后施治……先逐其瘀，而后和營止痛，自無不效。”此外《內經》云∶“形傷則痛，氣傷則腫。”又曰∶“先腫而后痛者，形傷氣也；先痛而后腫者，氣傷形也。凡打撲閃錯……致氣血凝結者，宜活血順氣之法。”因此跌打損傷的治法以活血止痛行氣為主，并要進行及時治療。本研究通過對1 027首方劑的藥物組成進行分析，發現活血類藥物當歸、乳香、沒藥、白芷、川芎、甘草、赤芍、大黃、紅花和血竭等使用頻次較高；而李彥民等[2]對《跌打大全》中的81首治療跌打損傷的方劑進行分析，排序在前10位的藥物分別是沒藥、乳香、生地、甘草、當歸、赤芍、紅花、防風、三七、木香；《鄒伯奇家傳手抄本》中94首治療跌打損傷方劑中使用頻率較高的有當歸、乳香、沒藥、紅花、地黃、桃仁、大黃、血竭、三七和赤芍等[6]；2015版《中國藥典》用于跌打損傷的29首方劑中主要使用的藥物有乳香、沒藥、冰片、當歸、紅花、大黃、土鱉蟲、血竭、三七和白芷等[4]。綜上分析，小樣本的方劑研究與本研究結果類似，治療跌打損傷的藥物以活血止痛為主，主要有沒藥、乳香、當歸、紅花、血竭、赤芍、大黃和三七等，這與中醫古籍記載的理論相符合。

圖5 內服方劑核心藥組的GO富集分析

圖6 KEGG通路分析氣泡圖

通過對跌打損傷方劑中藥物歸經分析，發現主要入肝、脾和心經，而2015版《中國藥典》關于跌打損傷的方劑同樣表明此結論[4]。《傷科補要》載：“跌打損傷之證，惡血留內，則不分何經，皆以肝為主。”肝藏血，心行之，人動則血運于諸經、人靜則血歸于肝臟，五臟六腑之血全賴脾氣統攝，這三個臟腑與血液的化生、運行具有較大的關系；此外治療跌打損傷的藥物多性辛、溫，味苦、辛能散能行，能夠發散、行血行氣，具有活血化瘀的功效，使血液流暢。運用網絡藥理學構建“藥性組合-中藥作用靶標-生物網絡模塊-功效”網絡圖，發現辛溫藥物與化瘀散結的功效相關，而苦味與炎癥相關，體現了苦可宣泄瘀散的功效，其藥物主要通過調節不同靶點參與血小板脫粒、血液凝固、血小板活化等過程，從而發揮活血化瘀的功效[7-8]。

通過關聯分析可以找出治療跌打損傷的常用藥對，無論內服還是外用，乳香-沒藥的支持度和置信度均較高，在《跌打大全》中同樣如此[2]。現代藥理學研究表明，乳香、沒藥具有抗炎[9]、鎮痛[10]等作用，此外乳香、沒藥的揮發油可能增加皮膚血流量促進川芎等藥物的滲透[11]，說明乳香、沒藥作為外用藥時具有重要的作用，并且蔡煜林等通過對文獻報道中的140個治療扭傷外用膏劑處方進行分析，發現其核心藥物為乳香、沒藥、大黃[12]，因此乳香-沒藥是治療跌打損傷不可或缺的一組藥對。此外，其他關聯度較高的藥對基本與當歸有關，這與其他小樣本數據研究結果基本一致[2，4，6]，如當歸-川芎、當歸-赤芍、當歸-生地等。軟組織損傷的主要病機是氣血瘀滯不通，而當歸能行血中之氣，使血各歸其經，藥理研究表明其具有改善外周循環、減少血管阻力、減少血栓、增加血紅蛋白等作用[13]。當歸∶川芎的比例為4∶1～2∶1時，其養血補血效果隨著劑量的增加而增加[14]，該藥對還具有抗血栓、降低全血黏度、提升血紅細胞數等作用[15]。在外用方劑中，川烏-草烏、荊芥-防風藥對的使用頻次也較高，雖然川烏-草烏兩者均具有較大毒性，但在外用時，其安全性得到一定的保證，并且其改善血液循環、抗炎止痛的效果也較為顯著[16-17]，配伍荊芥-防風能夠逐風邪、散寒濕。

關于治療軟組織損傷的作用機制研究目前大多數集中在TLR2/NF-κB信號通路中，與腫瘤壞死因子TNF、白細胞介素IL和前列腺素PGE等有關[18-19]。王偉軍等[20]和楊威等[21]分別開展的桃紅四物湯和701跌打鎮痛膏治療軟組織損傷的研究也對此進行了驗證，發現其主要通過降低CASP3、NFKB1和PTGS2的蛋白表達發揮抗炎、抗氧化應激作用，從而收到治療效果。上述研究結果與本研究核心藥組預測的靶點和KEGG富集的通路基本一致，少數差異可能是由于藥物組成不同導致的，或者存在新的治療軟組織損傷的作用靶點和通路，有待進一步實驗驗證。

本研究運用古今醫案云平臺，對《方劑大辭典》中1 027首治療跌打損傷的方劑進行數據挖掘，發現內服方劑核心藥組和外用方劑核心藥組，并結合網絡藥理學分析闡明內服方劑的核心藥組潛在的作用機制——以多種有效成分通過PTGS2、NCOA2、PGR等靶點作用于脂質和動脈粥樣硬化、IL-17、神經活性配體-受體相互作用等多條通路，從而發揮治療作用，但其具體機制還需進一步實驗驗證。本研究可為治療軟組織損傷機制研究提供一定的理論依據，為臨床治療跌打損傷提供參考。