煙草浸提液對番茄早疫病誘導抗性的研究

王 蕊，劉 娜，劉杰才，云興福

（內蒙古農業大學園藝與植物保護學院 呼和浩特 010019）

番茄早疫病，又稱番茄輪紋病、番茄夏疫病，是由茄鏈格孢菌（Alternaria solani）侵染番茄引發的一種真菌病害，發病處有明顯的同心輪紋。一般病情下，番茄產量損失在10%～30%，病害嚴重時產量損失可達到50%[1]。為控制番茄早疫病危害程度，學者們將科研成果與生產實際相結合，利用種子消毒、培育無病毒苗、噴施化學農藥等手段減輕或有效控制番茄早疫病發生，目前，農藥是最直接有效的手段[2]。然而，農藥的大量使用不僅導致農業環境污染日益嚴重，而且農藥殘留也對人體生命健康造成威脅。植物誘導抗性是病害防控的新思路，可以有效減少化學農藥的使用頻率，有利于植物的綠色發展[3]。

人們在植物誘導抗性方面已開展了許多研究工作[4]。郭嘉華等[5]利用西芹腐根丙酮2 次層析物對黃瓜幼苗進行2 次誘導處理，通過轉錄組學分析篩選出了對黃瓜枯萎病產生顯著誘導抗性效果的最佳誘導處理。古鑫[6]利用22 種植物甲醇浸提液3次誘導橡膠幼苗（莖干涂抹法），探究22 種植物甲醇提取物對橡膠樹抗炭疽菌的誘導作用，結果表明，黃蟬、扶桑的甲醇提取液誘導效果與空白對照差異極顯著。陳年來等[7]通過測定側柏葉提取液誘導處理后甜瓜幼苗的酶活性，確定了側柏葉提取液對甜瓜防御性酶活性有誘導增強作用。王樹桐等[8]利用知母提取液誘導馬鈴薯幼苗，通過對誘導后的馬鈴薯葉片的PAL 活性測定，表明知母提取液可能誘導了馬鈴薯葉片對晚疫病菌的抗性。陳桂華等[9]在水稻3 葉1 心幼苗期利用前胡提取物進行誘導，表明前胡提取物可以誘導水稻幼苗對稻瘟病的抗性。

目前，有關植物提取物對番茄早疫病誘導抗性的研究鮮見報道。筆者以煙草根、莖、葉的乙醇、丙酮浸提液對番茄幼苗進行誘導處理，結合自然病原激發病害試驗和人工接種病原激發病害試驗，研究煙草浸提液對番茄早疫病的誘導抗性效果，為未來番茄早疫病的綠色防控奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試煙草購買于內蒙古赤峰市，品種為吉林紅；供試番茄為粉紅918，購自內蒙古農牧業科學院蔬菜種子門市部；番茄早疫病菌購自中國農業科學院蔬菜花卉研究所植物病理研究室。

1.2 方法

1.2.1 浸提液的制備 取自然風干的煙草，用自來水沖刷、蒸餾水潤洗以清除表面的雜質（灰塵、土塊、塑料及其他雜質），在避光通風處晾干備用。將晾干后的不同部位樣品（根、莖、葉）切成1 cm 見方備用。通過預試驗，確定以40%乙醇和60%丙酮為浸提溶劑來浸提煙草不同部位。按照煙草不同部位樣品和浸提劑溶液體積比為1∶12 放入錐形瓶，置于搖床上進行震蕩（25 ℃，240 r·min-1）浸提24 h；取出后經定性濾紙（除濾渣）和0.22μm 細菌過濾器（除菌）2 次過濾，過濾后得到6 種煙草浸提液，4 ℃冰箱儲存備用，6 種浸提液分別為煙草根、莖、葉的40%乙醇浸提液處理和煙草根、莖、葉的60%丙酮浸提液處理（以下簡稱乙根、乙莖、乙葉、丙根、丙莖、丙葉）。

1.2.2 試驗設計 以乙根、乙莖、乙葉、丙根、丙莖、丙葉為處理組，以40%乙醇、60%丙酮為各自對照（以下簡稱乙CK、丙CK），以蒸餾水為總對照（以下簡稱總CK），乙CK、丙CK、總CK 為一組對照組。

1.2.3 自然病原激發病害試驗 試驗于2021 年5-9 月在內蒙古農業大學實驗室與農業生產基地進行。番茄種子在實驗室浸種催芽后，播種于裝有混合基質的32 孔穴盤中，將穴盤放置溫室內，一組處理組和一組對照組為1 次重復，隨機排列，共3次重復，重復數按順序排列，進行常規管理。在番茄幼苗2 葉1 心時進行第1 次誘導，3 d 后進行第2次誘導（強化誘導），誘導處理均在傍晚時分進行，按照排列順序將處理組和對照組用喉頭噴霧器對番茄幼苗進行誘導處理，重點噴施番茄幼苗葉片正、背面（均勻為準），以減少浸提液的蒸發，避免隨機誤差，誘導處理后進行常規管理。2021 年5 月16 日定植，定植后各處理組均26 株，3 次重復，且處理隨機排列，重復數按順序排列，小區面積為1.3 m×5.5 m。在第1 次發病時開始數據收集，測定樣本數為10株（每個處理隨機抽取10 株苗進行測定，每次測定隨機抽取），每5 d 測1 次，共測8 次。

1.2.4 人工接種病原激發病害試驗 孢子懸浮液的配制：番茄早疫病病菌接種于PDA 培養基（馬鈴薯200 g，瓊脂16 g，蔗糖20 g，定容至1000 mL）上，放置于光照培養箱中，28 ℃暗培養5 d，取新培養的番茄早疫病病菌，在顯微鏡下調整孢子懸浮液的濃度，配制濃度為5.12×105個分生孢子·mL-1的孢子懸浮液待用，利用血球計數板法[10]進行統計。

試驗于2021 年7-9 月在內蒙古農業大學實驗室與農業生產基地進行。浸提液的制備、誘導方法均與自然病原激發病害試驗相同。在強化誘導3 d 后進行人工接種番茄早疫病菌，于傍晚時分將孢子懸浮液用噴霧器噴到番茄幼苗的子葉及真葉上，控制小環境的適宜濕度，利于發病。各處理與對照均20 株，3 次重復，試驗小區的排布方式與重復數的排列方式以及測定樣本數均與自然病原激發病害試驗保持一致。從第1 次發病開始時收集數據，測定樣本數為10 株（每個處理隨機抽取10株苗進行測定，每次測定隨機抽取），每4 d 測1 次，共測8 次。

1.3 早疫病病情調查

發病后進行病株率、病葉率的第1 次測定，調查方法參照張子君等[11]的。番茄早疫病分級標準按照病害嚴重度分為4 級，病情分級標準如下：1 級，病斑面積占羽狀葉面積的1/4 以下；2 級，病斑面積占羽狀葉面積的1/4～1/2；3 級，病斑面積占羽狀葉面積的＞1/2～3/4，近1/2 小葉枯死；4 級，病斑面積占羽狀葉面積的3/4 以上，一半以上或全部小葉枯死；根據以上標準，調查病株率、病葉率、病情指數，分析誘導抗性效果。

病株率/%=（病株數/總株數）×100（植株上只要有一個病葉就是病株）；

病葉率/%=（病葉數/總葉數）×100（葉片上只要有一個病斑就是病葉）；

病情指數=（∑（各級病葉數×各級代表值）/（調查總葉數×最高級別代表）×100；

誘導抗性效果/%=（CK 的病情指數-處理的病情指數）/CK 的病情指數×100。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2003、SPSS 17.0 軟件、SAS 9.4 軟件進行方差分析與數據處理。

2 結果及分析

2.1 自然病原激發病害試驗

2.1.1 誘導處理后的病株率 由表1 可以看出，番茄發病后，隨著病情的發展，所有處理病株率逐漸升高。根據末次調查可知，乙根、乙莖、乙葉處理病株率分別比乙CK 降低了4.18%、0.00%、12.50%，且均與乙CK 差異不顯著；丙根、丙莖、丙葉處理病株率分別比丙CK 降低了36.38%、13.64%、13.64%，丙根處理與丙CK 差異極顯著，丙莖、丙葉處理與丙CK 差異不顯著。乙根、乙莖、乙葉、丙根、丙莖、丙

表1 自然病原激發病害試驗病株率%

葉處理病株率分別比總CK 降低了11.54%、7.69%、19.22%、46.16%、26.91%、26.91%，丙根、丙莖、丙葉、乙葉處理均與總CK 差異極顯著，乙根、乙莖處理均與總CK 差異不顯著。

2.1.2 誘導處理后的病葉率 由表2 可以看出，番茄發病后，隨著病情的發展，所有處理病葉率逐漸升高。根據末次調查可知，乙根、乙莖、乙葉處理病葉率分別比乙CK 降低了32.68%、6.20%、27.38%，乙根處理與乙CK 差異極顯著，乙葉處理與乙CK差異顯著，乙莖處理與乙CK 差異不顯著；丙根、丙莖、丙葉處理病葉率分別比丙CK 降低了44.31%、18.47%、32.34%，丙根處理與丙CK 差異極顯著，丙葉處理與丙CK 差異顯著，丙莖處理與丙CK 差異不顯著；乙根、乙莖、乙葉、丙根、丙莖、丙葉病葉率分別比總CK 降低了44.99%、23.36%、40.67%、64.03%、47.34%、56.30%；與總CK 比較，乙根、乙葉、丙根、丙莖、丙葉處理均與總CK 差異極顯著，乙莖處理與總CK 差異顯著。

表2 自然病原激發病害試驗病葉率%

2.1.3 誘導處理后的病情指數 由表3 可以看出，番茄發病后，隨著病情的發展，除乙CK 外，其余處理的病情指數均逐漸增大。根據末次調查可知，乙根、乙莖、乙葉處理的病情指數分別比乙CK 降低了23.88%、7.84%、13.81%，乙根處理與乙CK 差異極顯著，乙莖處理與乙CK 差異不顯著，乙葉處理與乙CK 差異顯著；丙根、丙莖、丙葉處理的病情指數分別比丙CK 降低了40.40%、6.40%、18.00%，丙根、丙葉處理與丙CK 差異極顯著，丙莖處理與丙CK 差異不顯著。乙根、乙莖、乙葉、丙根、丙莖、丙葉處理的病情指數分別比總CK 降低了30.38%、15.70%、21.16%、49.15%、20.14%、30.03%，且均與總CK 差異極顯著。

表3 自然病原激發病害試驗病情指數

2.1.4 誘導抗性效果 由圖1 可知，末次調查，乙根、乙莖、乙葉、丙根、丙莖、丙葉誘導抗性效果分別為30.89%、15.82%、21.66%、49.29%、20.52%、30.76%，丙根處理與其他誘導處理差異極顯著，乙根、乙葉、丙莖、丙葉處理之間差異不顯著，乙莖與乙根、丙葉差異極顯著，與乙葉、丙莖無顯著差異。

圖1 自然病原激發病害試驗的誘導抗性效果

2.2 人工接種病原激發病害試驗

2.2.1 誘導處理后的病株率 由表4 可知，番茄發病后，隨著病情的發展，所有處理病株率逐漸升高。根據末次調查，乙根、乙莖、乙葉的病株率比乙CK 降低了22.22%、3.71%、14.82%，與乙CK 比較，乙根差異極顯著，乙葉差異顯著，乙莖差異不顯著；丙根、丙莖、丙葉的病株率比丙CK 降低了29.62%、11.11%、22.22%，與丙CK 相比，丙根、丙葉差異極顯著，丙莖差異顯著；乙根、乙莖、乙葉、丙根、丙莖、丙葉病株率比總CK 降低了27.58%、10.35%、20.69%、34.47%、17.24%、27.58%，與總CK 相比，乙根、乙葉、丙根、丙莖、丙葉差異極顯著，乙莖差異顯著。

表4 人工接種病原激發病害試驗病株率%

2.2.2 誘導處理后的病葉率 由表5 可以看出，番茄發病后，隨著病情的發展，所有處理病葉率逐漸升高。根據末次調查可知，乙根、乙莖、乙葉處理的病葉率分別比乙CK 降低了23.22%、11.85%、16.98%，乙根處理與乙CK 差異極顯著，乙葉處理與乙CK 差異顯著，乙莖處理與乙CK 無顯著差異；丙根、丙莖、丙葉處理病葉率分別比丙CK 降低了44.75%、18.53%、25.98%，丙根、丙莖、丙葉處理與丙CK 差異極顯著；乙根、乙莖、乙葉、丙根、丙莖、丙葉的病葉率分別比總CK 降低了39.55%、30.60%、34.64%、56.44%、35.77%、41.65%，且均與總CK 差異極顯著。

表5 人工接種病原激發病害試驗病葉率 %

2.2.3 誘導處理后的病情指數 由表6 可以看出，番茄發病后，隨著病情的發展，所有處理的病情指數逐漸增大。根據末次調查可知，乙根、乙莖、乙葉處理的病情指數分別比乙CK 降低了20.42%、9.17%、15.21%，乙根、乙葉處理與乙CK 差異顯著，乙莖處理與乙CK 差異不顯著；丙根、丙莖、丙葉處理的病情指數分別比丙CK 降低了38.61%、12.45%、18.78%，丙根處理與丙CK 差異極顯著，丙葉處理與丙CK 差異顯著，丙莖處理與丙CK 差異不顯著。乙根、乙莖、乙葉、丙根、丙莖、丙葉處理的病情指數分別比總CK 降低了39.75%、31.23%、35.80%、54.10%、34.54%、39.27%，且均與總CK 相比差異極顯著。

表6 人工接種病原激發病害試驗病情指數

2.2.4 誘導抗性效果 由圖2 可知，末次調查，乙根、乙莖、乙葉、丙根、丙莖、丙葉處理誘導抗性效果分別為39.57%、30.69%、34.76%、55.40%、35.43%、41.20%，丙根處理與其他誘導處理差異極顯著，乙根、乙葉、丙莖、丙葉處理之間差異不顯著。

圖2 人工接種病原激發病害試驗的誘導抗性效果

3 討論與結論

植物誘導抗性一直是國內外學者研究的熱點。對植物幼苗進行誘導處理后會激發植物體內的抗性因子，植物的組織結構、生理生化、抗性有關代謝通路和田間防病效果有一定的變化趨勢，可以反映浸提液的誘導抗性效果[12-13]。用植物浸提液對植物幼苗進行誘導處理，是提高植物抗逆性、保護生態環境的有效途徑[14-15]。據前人報道，許多植物不同部位的浸提液對植物病害具有誘導抗性作用，黃瓜幼苗經煙草莖部丙酮浸提液誘導處理后，黃瓜霜霉病誘導抗性效果達到50.08%，可以較好地控制黃瓜霜霉病的發生[16]；印楝種子提取物的丙酮流分誘導煙草抗炭疽病試驗表明，誘導后的煙草病情指數為25.00，顯著低于對照（69.17），有較好的誘導抗性效果[17]；40 倍的大黃提取物和20 倍白芷提取物誘導處理團根期煙草植株，可以誘導煙草植株對赤星病的抗病性，誘導抗性效果分別為51.64%、48.74%[18]；銀杏葉提取物對獼猴桃青霉病有誘導抗性效果，誘導處理后發病率比對照降低了24%[19]；中藥材前胡、白芷的水提液，可誘導水稻對稻瘟病的抗性以及小麥對赤霉病的抗性[20-21]；郭文慧等[22]采用114 種植物提取物對煙草花葉病毒誘導抗性效果進行研究，篩選了7 種誘抗效果在50%以上的植物提取物。

筆者的試驗方法與前人類似，采用植物浸提液進行誘導，植物不同，浸提液中誘導的活性物質不一樣，因此不同的植物浸提液可以誘導不同植物抗性的產生[17，23]。但是在浸提劑的選擇方面又與前人的研究存在差異，選用不同試劑不同濃度可以全方面的研究植物浸提液的誘導抗性效果。筆者利用煙草不同部位（根、莖、葉）的40%乙醇、60%丙酮浸提液對番茄幼苗進行誘導處理，從田間防病效果分析，得出如下結論：6 種浸提液可以產生對番茄早疫病的誘導抗性，丙根誘導處理與其他浸提液誘導處理之間抗性效果差異極顯著，為最佳誘導抗性處理。可能原因如下：（1）在煙草根、莖、葉中，誘導番茄早疫病抗性的活性物質在煙草根部分布較多；（2）對番茄早疫病有誘導抗性作用的活性成分在丙酮溶劑中溶解度較大；（3）浸提劑的種類與濃度影響了煙草不同部位活性物質的浸提數量與濃度。筆者的試驗為煙草浸提液誘導番茄早疫病抗性研究提供了理論依據，為進一步研究煙草浸提液對番茄屬其他植物誘導抗性研究提供了參考，為早日實現番茄屬植物的健康、生態種植提供了理論依據或技術手段。

筆者試驗表明，利用不同浸提溶劑（40%乙醇、60%丙酮）浸提煙草不同部位（根、莖、葉）得到的6種浸提液有誘導番茄早疫病抗性的潛力，結合自然病原激發病害試驗與人工接種病原菌激發病害試驗，可得出以下結論：（1）經6 種浸提液誘導處理后的番茄幼苗，病情發展較為緩慢，其中經丙根誘導處理后的番茄幼苗，發病時間較其他處理推遲。（2）經6 種浸提液誘導處理后的番茄幼苗病情指數均與總CK 差異極顯著，并且具有較強的誘導抗性效應，以丙根誘導處理后的番茄幼苗的誘導抗病效果最好。