糖基化對小米醇溶蛋白結構和消化性影響

張玉靜，黃凌立，郭峻

（省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，天津市食品質量與健康重點實驗室，天津科技大學 食品科學與工程學院，天津 300457）

小米是世界多個國家（如印度、中國）和非洲部分地區種植食用的主食農作物，是我國最具代表性的谷物之一，已有8 000多年種植歷史[1]。小米含有多種營養成分（維生素A、維生素B1和維生素B12），營養均衡，消化率高，且具有各種生理作用，如抗氧化、抗炎、抗癌和抗菌作用[2]。小米蛋白是優質植物蛋白質的重要來源，其蛋白質含量達到9.00%～13.99%[3]，而且具有低敏性[4]，因此適合大多數人食用。醇溶蛋白是小米蛋白的儲藏蛋白，也是含量最高的一種蛋白組分，大約占46%[5]，其結構類型及在不同加工條件下的變化會對小米蛋白的理化和消化特性起重要影響作用。

熱加工（蒸煮、擠壓、焙烤）是谷物常用的加工方式，有研究表明熱加工可以影響蛋白結構。郭蓮東[6]研究表明擠壓使小米醇溶蛋白發生聚集和融合，三級結構發生較大變化。此外，熱加工對蛋白的消化性也有影響。Gulati等[7]研究發現高壓和長時間加熱會導致消化率降低，但小米蛋白在蔗糖溶液和NaCl溶液中加熱可有效減緩胃消化階段消化率的降低；范冬雪等[8]研究發現小米醇溶蛋白經蒸煮及擠壓處理后體外消化率比未處理的蛋白都有所降低。糖基化作為食品加工常用方式也受到廣泛關注。有研究表明糖基化處理可改變蛋白的結構，且對蛋白溶解性、乳化性等功能特性有不同程度的改善。李靈誠[9]以大米蛋白為原料與木糖進行水熱糖基化反應改善了大米蛋白質的溶解性。木糖和大豆分離蛋白經過美拉德反應的復合物結構松散，進而提高了大豆分離蛋白的溶解性[10]。但是，谷物蛋白糖基化的大多研究集中于結構及理化特性等方面的變化，對谷物蛋白質的消化特性以及蛋白結構與消化性的相關因素研究較少。

本文通過研究熱處理糖基化對小米醇溶蛋白的Amadori產物、游離精氨酸側鏈、二級結構、二硫鍵、內源熒光等結構特性及消化特性的變化，闡明單獨熱加工及糖基化修飾對小米醇溶蛋白的結構和消化性的影響，分析結構變化與消化性的相關機制，為小米制品加工條件的選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米（晉谷21號）：產自山西??；胃蛋白酶（酶活力2 500 U/mg）、胰蛋白酶（酶活力 1 500 U/mg）、糜蛋白酶（酶活力40 U/mg）標準品：美國Sigma公司；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT，分析純）：美國 Thermo公司；十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS，分析純）：美國Bio-rad公司。

1.2 儀器與設備

傅里葉紅外光譜儀（Tensor 27）：德國布魯克公司；熒光分光光度計（Lumina）：美國賽默飛科技公司；手持勻漿機（A8）：上海歐河機械設備有限公司；全功能微孔板檢測酶標儀（Infinite 200PRO）：奧地利TECAN有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小米醇溶蛋白的提取

從小米中提取醇溶蛋白參考姬中偉等[11]的方法并作部分修改。將小米破碎后，過80目篩分離殘渣，得到粗制小米粉。按照0.05g/mL的濃度配制小米粉-正己烷溶液，在室溫下攪拌2h～3 h后，放在通風櫥中揮發過夜，以去除小米粉中的脂肪。脫脂后，按照0.1g/mL的濃度制備小米粉水溶液，45℃水浴攪拌2h，于8000r/min離心20min；所得沉淀用3%氯化鈉溶液稀釋至0.0125g/mL，45℃水浴攪拌2 h，于8 000 r/min離心20 min；將所得沉淀用水稀釋至0.1 g/mL，在室溫下攪拌2 h以去除氯化鈉，然后將其在8 000 r/min離心20 min；所得沉淀用70%乙醇溶液稀釋至0.012 5 g/mL，并在40℃水浴攪拌2.5 h后6 000 r/min離心10 min，收集上清液。向上清液中緩慢加入4℃氯化鈉溶液，使體積達到原上清液的3倍（氯化鈉溶液的最終濃度為0.3 g/100 g），4℃靜置1 d后，將沉淀在4℃透析2 d～3 d，將透析好的沉淀物凍干成粉末，得到小米醇溶蛋白備用。以上破碎及提取步驟均重復操作3次。

1.3.2 D-木糖與小米醇溶蛋白糖基化反應

稱取100.0 mg天然小米醇溶蛋白，置于100 mL超純水中，用手持高速勻漿機分散15 s，使小米醇溶蛋白在水中均勻地分散，形成相對穩定的懸浮液。按蛋白與糖質量比1:5向其中加入D-木糖，混勻后，將上述懸浮液分別裝在12 mL的哈希管中。將哈希管置于干浴器中分別在 100、120、140、160、180 ℃ 5 種溫度下反應25 min（以未經處理的天然小米醇溶蛋白作為對照）。將D-木糖修飾的小米醇溶蛋白（D-小米醇溶蛋白）和單獨加熱的小米醇溶蛋白（H-小米醇溶蛋白）裝于透析袋中，在4℃去離子水中透析以去除沒有參與反應的小分子物質，將透析后的小米醇溶蛋白及其反應產物凍干備用。

1.3.3 Amadori產物含量的測定

參照牛治燕[12]的方法稍作修改，用pH7.0磷酸鈉緩沖溶液（10 mmol/L）將蛋白樣品稀釋至1 mg/mL，將含有0.25 mmol/L硝基四唑氮藍（tetranitroblue tetrazolium chloride，NBT）的碳酸鹽緩沖溶液（100 mmol/L，pH10.8）按1:10（蛋白質:硝基四唑氮藍，體積比）的比例添加到試管中。二者混合均勻后在37℃反應45min，待反應完全后使用多功能酶標儀測定其在525 nm下的吸光度（A525），同時測定磷酸鈉緩沖溶液的吸光度作為空白值。所有樣品均重復測定3次。Amadori產物含量（nmol/mL）的計算公式如下：

1.3.4 傅里葉紅外光譜分析

應用傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）分析樣品的二級結構變化。稱取1 mg樣品和150 mg溴化鉀顆粒同時放在研缽里研磨至貼壁，把制好的壓片放入紅外光譜儀中進行掃描。單獨的溴化鉀掃描光譜作為背景，掃描波段為4 000 cm-1～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，背景和樣品的掃描次數均為32。用OMNIC 8.0數據處理軟件對采集的紅外圖譜進行處理，通過計算得到二級結構含量[13]。

1.3.5 游離巰基和二硫鍵含量測定

參考Hong等[14]的方法測定樣品游離巰基（sulfhydryl，SH）和二硫鍵（disulfide bond，SS）含量。游離巰基的測定：用含有8mol/L尿素的Tris-甘氨酸緩沖液制備2 mg/mL的蛋白樣品，室溫反應1 h。再用Tris-甘氨酸緩沖溶液稀釋20倍。隨后取1 mL上述樣品與10 μL Ellman試劑反應25 min，以不添加樣品的緩沖液作為對照，在412 nm處測定吸光度。總巰基的測定：用含有8 mol/L尿素的Tris-甘氨酸緩沖液制備0.5 mg/mL的蛋白樣品，用含有β-巰基乙醇的Tris-甘氨酸緩沖液將樣品溶液稀釋5倍，室溫反應1 h。向混合物中加入10 mL 12%的三氯乙酸，靜置1 h后6 000 r/min離心15 min。將離心后沉淀復溶于2 mL含有8 mol/L尿素的Tris-甘氨酸緩沖溶液中，室溫反應。按上述游離巰基測定方法測定其吸光度。游離巰基和二硫鍵含量計算公式如下。

式中：A412為412 nm處的吸光度；C為小米醇溶蛋白濃度，mg/mL，D為稀釋倍數；SHtotal為總巰基含量；SHfree為游離巰基含量。

1.3.6 內源熒光性的測定

參照Mir等[15]的方法測定樣品的內源熒光性。用pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液制備1 mg/mL蛋白樣品，在激發波長295 nm，發射波長320 nm～550 nm范圍內記錄發射光譜。將天然小米醇溶蛋白作為對照，將單獨的磷酸鹽緩沖溶液用來測量背景熒光。

1.3.7 表面疏水性的測定

小米醇溶蛋白的表面疏水性測定參考Alizadeh-Pasdar等[16]的方法，采用1-苯胺基-8-萘磺酸（1-anilino-naphthalene-8-sulfonate，ANS） 作為熒光探針。 用10 mmol/L，pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液制備5個濃度梯度（分別為 0.019、0.038、0.076、0.150、0.300 mg/mL）的樣品溶液。取制備好的樣品向其中加入20 μL 8 mmol/L的ANS溶液，混合均勻后室溫避光反應15 min。使用熒光分光光光度計在激發波長和發射波長分別為390 nm和470 nm的條件下對樣品進行比色，測量樣品熒光強度。用線性關系良好的回歸曲線的初始斜率來評價表面疏水性（H0）。

1.3.8 消化率的測定

根據Wen等[17]的方法測定蛋白樣品的消化率，按10 mg小米醇溶蛋白的質量計算，以確保消化的初始底物含量一致。

模擬胃消化反應：稱好的樣品加入7 mL模擬胃液，混合均勻后，在振蕩培養箱中37℃，100 r/min消化1 h后，向其中加入1 mol/L NaHCO3終止胃消化反應。

模擬腸消化反應：按照胃消化反應的步驟消化后，向胃消化產物中加入1 mL腸液，混合均勻后加入100 μL胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合溶液。在振蕩培養箱中繼續消化2 h。消化結束后在沸水浴中加熱滅活酶。將消化后的樣品離心，取上清液，用于后續消化率的測定。

采用鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyae，OPA）試劑法測定游離氨基含量。將消化后的上清液用碳酸鈉溶液稀釋20倍，然后再按照1:1（體積比）的比例與OPA試劑（100 mmol/L四硼酸銨，1 mg/mL SDS，0.8 mg/mL鄰苯二甲醛和0.05 mg/mL DTT）混合，室溫下反應10 min后用多功能酶標儀測定其熒光強度（激發波長340 nm，發射波長425 nm）。在同樣的波長下測定不同濃度的色氨酸（0.001、0.005、0.010、0.020、0.050、0.060 mmol/mL）的熒光強度，建立標準曲線（y=0.143 1x+0.167 4）。消化率按以下公式進行計算。

式中：hs是每克蛋白質消化后產生的游離氨基含量，mmol；htotal是當每克蛋白質被完全水解之后所產生的游離氨基的含量，8 mmol。

1.4 數據分析

本試驗結果用平均值±標準差表示。采用Spss26軟件中鄧肯檢驗進行組間比較及顯著性分析，采用Graph-Pad Prism 8進行皮爾遜相關性分析及圖形的繪制。

2 結果與分析

2.1 熱處理及D-木糖對小米醇溶蛋白結構的影響

2.1.1 熱加工對Amadori產物的影響

在食品的熱處理過程中，Amadori產物是在美拉德反應的早期階段產生的初期產物，常用作指示食品熱加工程度的標志性指標[18]。小米醇溶蛋白與D-木糖糖基化反應后Amadori產物的含量見表1。

表1 不同加熱溫度下H-小米醇溶蛋白、D-小米醇溶蛋白Amadori產物的含量變化Table 1 Content of Amadori products of H-millet gliadin and D-millet gliadin heated at different temperatures mol/L

從表1中可以發現，單獨加熱處理的小米醇溶蛋白無Amadori產物生成，原因是Amadori產物需要在還原糖的羰基端的參與下與蛋白質中的游離氨基發生糖基化反應生成[12]；當小米醇溶蛋白與D-木糖在100℃～160℃進行糖基化反應時，Amadori產物的含量從（0.78±0.03）mol/L 顯著增加到（1.14±0.07）mol/L（p＜0.05）。在熱處理溫度為140℃～160℃時，D-木糖修飾的小米醇溶蛋白的Amadori產物含量沒有顯著增加（p＞0.05），且在180℃時Amadori產物的含量減少，可能是因為Amadori產物是糖基化反應的一個中間產物，該產物會因為加熱溫度的升高轉化變成其他物質[12]。隨著加工溫度的升高，Amadori產物含量的變化說明糖基化的反應程度增強。

2.1.2 熱加工對小米醇溶蛋白及糖基化產物二級結構的影響

FT-IR光譜中的酰胺Ⅰ帶（1 600 cm-1～1 700 cm-1）能夠反映蛋白質二級結構的變化。熱處理糖基化修飾的小米醇溶蛋白FT-IR光譜圖如圖1所示。

圖1 天然小米醇溶蛋白、H-小米醇溶蛋白和D-小米醇溶蛋白的傅里葉紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectra of natural millet gliadin，H-millet gliadin and D-millet gliadin

由圖1中不同處理組樣品的吸收峰的峰型和寬度的變化可以判斷出，熱處理、糖基化改變了小米醇溶蛋白的二級結構。為分析小米醇溶蛋白二級結構含量的變化，對酰胺I帶進行了去卷積二階導數擬合計算，結果如表2所示。

表2 不同加熱溫度下H-小米醇溶蛋白和D-小米醇溶蛋白二級結構含量的變化Table 2 Content of secondary structural elements in H-millet gliadin and D-millet gliadin heated at different temperatures %

由表2可知，經過單獨熱處理后小米醇溶蛋白α-螺旋的含量從（13.27±0.09）%降低至（10.12±0.21）%，β-折疊的含量從25.08%顯著增加至（37.19±1.39）%（p＜0.05），β-轉角的含量從（48.20±0.21）%顯著降低至（43.23±1.50）%（p＜0.05），無規則卷曲從（13.46±0.11）%降低至（9.47±0.16）%。D-木糖糖基化修飾后小米醇溶蛋白 α-螺旋的含量降低至（10.15±0.60）%，β-折疊的含量顯著增加至（37.65±1.29）%（p＜0.05），β-轉角的含量顯著降低至（43.01±1.74）%（p＜0.05），無規則卷曲的含量降低至（9.20±0.13）%。隨熱處理溫度的升高，無規則卷曲和β-轉角的含量降低，β-折疊增加。這意味著蛋白質剛性的增加，柔韌性降低[19]。以上結果說明，加熱和D-木糖都能使小米醇溶蛋白產生緊密的二級結構。在熱處理過程中，D-木糖促使小米醇溶蛋白的β-折疊含量增加，從而引起分子間發生聚集，最終形成更加有序的結構。

2.1.3 游離巰基及二硫鍵含量的變化

圖2為天然小米醇溶蛋白、H-小米醇溶蛋白和D-小米醇溶蛋白的游離巰基和二硫鍵的含量。

圖2 不同加熱溫度下H-小米醇溶蛋白和D-小米醇溶蛋白游離巰基含量和二硫鍵含量的變化Fig.2 Content of free sulfhydryl and disulfide bond of H-millet gliadin and D-millet gliadin heated at different temperatures

由圖2可知，天然小米醇溶蛋白的游離巰基含量為（4.52±0.04）μmol/g，二硫鍵含量為（4.43±0.02）μmol/g。加熱溫度從100℃升高到180℃，H-小米醇溶蛋白的游離巰基含量從（4.27±0.02）μmol/g顯著降低至（3.00±0.08）μmol/g（p＜0.05），而二硫鍵的含量從（4.43±0.02）μmol/g顯著增加至（8.78±0.04）μmol/g（p＜0.05）。 這說明熱處理傾向于通過形成二硫鍵來聚合小米醇溶蛋白。Wang等[19]發現水浴加熱可以引起藜麥蛋白疏水殘基的暴露，誘導蛋白質中二硫鍵的形成。當小米醇溶蛋白被加熱到較高溫度時，由于游離巰基被氧化成二硫鍵，小米醇溶蛋白迅速聚集形成三維網狀結構，這一結果與熱處理過程中丙酮醛對麥谷蛋白修飾的結果一致[20]。上述二級結構也表明加熱引起小米醇溶蛋白結構更加緊密，因此，二硫鍵是小米醇溶蛋白進一步聚合的關鍵因素。

隨著加熱溫度的升高，D-小米醇溶蛋白的游離巰基含量逐步降低，二硫鍵含量逐漸增加，且在同一加熱溫度下游離巰基含量顯著低于H-小米醇溶蛋白（p＜0.05），超過100℃后在相同溫度下D-小米醇溶蛋白二硫鍵含量顯著高于H-小米醇溶蛋白（p＜0.05）。可能是在D-木糖存在的情況下，D-木糖與游離巰基反應以促進穩定加合物的形成[21-22]。另外，蛋白質氧化可能會引起游離巰基與二硫鍵之間交換反應的失衡，進一步引起游離巰基在不同氧化水平下生成不可逆產物（亞磺酸和磺酸）或可逆產物（二硫和亞磺酸）[22]。另外，再次生成的游離巰基也能夠參與到氧化反應或巰基/二硫鍵的交換反應，進而使小米醇溶蛋白中有更多的分子間二硫鍵產生[20]。

2.1.4 內源熒光性的變化

蛋白質的內源熒光主要由色氨酸和酪氨酸產生，它們的熒光性質很容易受溶劑極性的影響，發射光譜受這兩種氨基酸所處的微環境影響很大[23]。蛋白內源熒光性的變化可以體現蛋白結構的變化，因此，本試驗對天然小米醇溶蛋白、H-小米醇溶蛋白和D-小米醇溶蛋白的內源熒光發射光譜進行測定，結果見圖3。

圖3 不同熱處理溫度下天然小米醇溶蛋白、H-小米醇溶蛋白和D-小米醇溶蛋白的內源熒光光譜Fig.3 Fluorescence intensity of natural millet gliadin，H-millet gliadin，and D-millet gliadin heated at different temperatures

圖3（a）結果表明，加熱至120℃后，隨著加熱溫度的升高，H-小米醇溶蛋白樣品的熒光強度降低，這一現象可能是因為加熱導致小米醇溶蛋白發生一定程度的聚集，分子量變大，從而屏蔽了色氨酸殘基[12]。

圖3（b）結果表明，通過熱處理后D-小米醇溶蛋白的熒光強度降低，這表明蛋白質的空間構象在小米醇溶蛋白和D-木糖發生糖基化反應后發生變化。糖基化導致蛋白質熒光強度降低的原因可能是糖鏈對色氨酸殘基的屏蔽作用[24]，或者是D-小米醇溶蛋白中的色氨酸殘基被包埋到疏水環境中，相比于天然的小米醇溶蛋白其可能有更多的三級構象。各相同加熱溫度下，與D-小米醇溶蛋白的最大熒光強度比H-小米醇溶蛋白的最大熒光強度低，表明D-木糖促進了小米醇溶蛋白分子間聚集體的形成從而使結構更加緊湊，因而掩埋了更多的色氨酸殘基，這與Wang等[20]的研究結果一致。

2.1.5 表面疏水性的變化

天然小米醇溶蛋白、H-小米醇溶蛋白、D-小米醇溶蛋白的表面疏水性見表3。

表3 不同熱處理溫度下H-小米醇溶蛋白、D-小米醇溶蛋白的表面疏水性的變化Table 3 Surface hydrophobicity of H-millet gliadin and D-millet gliadin heated at different temperatures

如表3所示，當加熱溫度為100℃～160℃時，H-小米醇溶蛋白的H0隨溫度的升高而升高。這是因為熱處理使小米醇溶蛋白變性，進而暴露出起初掩埋在蛋白質核心的疏水殘基，使其移動到蛋白質表面，進一步導致表面疏水性增加[25]。然而，當加熱溫度達到180℃時，H-小米醇溶蛋白的疏水性反而下降。這是因為溫度過高，小米醇溶蛋白發生熱聚集現象，掩蓋了小米醇溶蛋白的疏水區，引起與ANS結合的疏水基團含量降低[20]。以上現象說明，熱處理溫度相對較低時，熱處理使小米醇溶蛋白的結構展開，起初隱藏的疏水基團逐漸暴露于表面，在溫度過高時，熱處理又引發小米醇溶蛋白發生分子內或分子間聚集，最終引起其疏水性下降[20]。

由表3可以看出，溫度由100℃升高到180℃，由D-木糖修飾的小米醇溶蛋白的表面疏水性顯著降低（p＜0.05）。這說明小米醇溶蛋白與D-木糖反應時，小米醇溶蛋白生成聚集體，進而隱藏了小米醇溶蛋白表面的疏水性殘基，導致ANS對疏水殘基的可及性受到抑制[26]。也可能是由于親水性的糖在疏水蛋白表面附著，糖的—OH基團的氫鍵結合能力改變了表面疏水性。經熱處理、糖基化的小米醇溶蛋白結構發生變化，引起疏水性的變化，從而改變蛋白酶的酶切位點，進一步使小米醇溶蛋白的消化性發生改變[21]。

2.2 D-木糖修飾小米醇溶蛋白隨溫度變化的消化率

隨熱處理溫度的改變，天然小米醇溶蛋白、H-小米醇溶蛋白和D-小米醇溶蛋白的胃腸消化率的變化如圖4所示。

圖4 不同加熱溫度下H-小米醇溶蛋白和D-小米醇溶蛋白胃消化率和腸消化率的變化Fig.4 Gastric digestibility and intestinal digestibility of the H-millet gliadin and D-millet gliadin heated at different temperatures

由圖4（a）可知，當溫度從100℃升高到180℃時，H-小米醇溶蛋白和D-小米醇溶蛋白的胃消化率分別從（15.15±0.19）%顯著下降至（7.57±0.32）%、（7.70±0.36）%，而且在140℃～160℃，D-小米醇溶蛋白的胃消化率顯著低于H-小米醇溶蛋白的胃消化率（p＜0.05）。由圖4（b）可知，當溫度從100℃升高到180℃時，H-小米醇溶蛋白和D-小米醇溶蛋白的腸消化率分別從（13.38±0.10）%顯著下降到（7.48±0.04）%、（6.52±0.17）%。

隨著熱處理溫度的升高，H-小米醇溶蛋白的消化率逐漸降低，說明熱加工對小米醇溶蛋白的消化率有抑制作用，且隨著熱處理溫度的升高抑制作用逐漸增強。在相同熱處理溫度下，D-小米醇溶蛋白的消化率始終低于H-小米醇溶蛋白的消化率，這可能是由于D-木糖能夠引起蛋白質分子的交聯，并通過空間位阻抑制胃蛋白酶和胰蛋白酶對蛋白質的水解[20]。胃蛋白酶催化谷氨酸、色氨酸和酪氨酸等肽鍵的斷裂[27]。已有文獻報道含硫氨基酸和色氨酸在還原糖的存在下很容易被消耗[28]，這意味著D-木糖對小米醇溶蛋白中氨基酸的修飾改變了胃蛋白酶的切割位點，進而降低了消化率。大多數研究將蛋白質消化率的降低歸因于空間組合聚集體的形成。也有研究表明，食物蛋白質的輕微的氧化損傷可能不會影響甚至提高蛋白質的消化率，而嚴重氧化可能會降低蛋白質對胰蛋白酶的敏感性[29]。嚴重的蛋白質羰基化往往涉及到劇烈的蛋白質氧化以及交聯和聚集體的形成，最終導致消化率受損[28]。因此D-木糖引起的小米醇溶蛋白嚴重的氧化作用也可能是D-小米醇溶蛋白消化率降低的原因。在熱加工中一些蛋白結構的變化是不可逆的，如蛋白質的去折疊，隱藏的疏水基團的暴露以及熱誘導的聚合等，這些變化不利于人體的消化吸收，但是有利于蛋白質作為包埋壁材的開發應用，強烈的熱處理甚至可能最終導致氨基酸殘基的退化和降解[30]。

2.3 結構與消化性之間的相關性

H-小米醇溶蛋白和D-小米醇溶蛋白結構和消化性變化的相關性分析見圖5。

圖5 H-小米醇溶蛋白和D-小米醇溶蛋白結構和消化性變化的相關性分析Fig.5 Correlation between structure and digestibility of H-gliadin and D-gliadin

圖5皮爾遜相關性顯示，小米醇溶蛋白消化率與α-螺旋含量呈正相關，而與β-折疊含量呈負相關，這一結果與文獻[31]的熱處理對大豆蛋白結構與消化率的相關性結果一致，β-折疊含量的增加可能會導致小米醇溶蛋白消化率的降低。此前在不同品種的大豆分離蛋白研究中發現，β-折疊含量與大豆分離蛋白存在負線性相關系數[32]。此外，D-木糖修飾的小米醇溶蛋白的表面疏水性與消化率呈正相關，這是因為D-木糖誘導小米醇溶蛋白發生聚集和交聯，屏蔽了識別和反應位點，所以疏水性下降，進而使其消化率下降，該結果在Li等[21]研究的丙二醛對米糠蛋白消化性影響的研究中得到證實。同時，小米醇溶蛋白消化率與二硫鍵含量呈負相關，小米醇溶蛋白中二硫鍵的生成會導致蛋白質的空間結構更加緊密，不利于消化酶切割位點的暴露，因此導致小米醇溶蛋白消化性能隨著溫度的升高而降低，此結果在Wang等[20]研究中得到證實。糖基化加劇了β-折疊、二硫鍵含量的增加，導致消化性進一步降低。此外，小米醇溶蛋白的消化率與熒光強度呈正相關，這與Wen等[17]結果是一致的。

3 結論

研究表明熱處理、糖基化能顯著影響小米醇溶蛋白的結構進而影響其消化性。隨著熱處理溫度的升高、糖基化反應的加劇，小米醇溶蛋白β-折疊含量增加、無規則卷曲含量減少，使其二級結構向有序性轉變，二硫鍵含量增加，使其高級結構發生構象變化，從而引起蛋白酶酶切位點的改變，最終導致小米醇溶蛋白消化性的降低。相關性分析表明，小米醇溶蛋白二級結構和二硫鍵是影響消化性的主要因素。因此，熱處理、糖基化不利于小米醇溶蛋白的消化。研究結果為探究熱處理、糖基化對小米蛋白結構和營養消化性的影響以及對小米食品的開發加工提供了理論依據。后續將在改善小米蛋白消化性、營養利用率以及糖基化修飾對小米蛋白抗氧化活性的影響方面開展進一步的深入研究。