黃精基酒對ICR小鼠抗氧化及抗疲勞作用

馬永強，沈盈，王鑫，張梓原，張一鵬

（哈爾濱商業大學 食品工程學院黑龍江省谷物食品與谷物資源重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150028）

黃精（Polygonatum sibiricum Delar.ex Redoute）又稱垂珠、鹿竹，主要分布在朝鮮、俄羅斯、蒙古及中國[1]，是我國一種傳統的藥食同源原料。近年來有關研究發現，黃精具有潤肺止咳、降低血糖和血脂、抗菌和抗疲勞等多種功效[2]。例如：巫永華等[3]研究發現，利用超聲協同酶法提取的黃精多酚可以有效清除DPPH·和O2-·，楊顯輝等[4]研究發現，滇黃精中的黃酮對于機體疲勞造成的脂質過氧化有緩解作用。基酒又稱酒基、主料，是配制酒中最主要的要素，基酒有很強的包容性，可以結合各種香料成分、功效成分呈現出色香味俱全的酒品[5]，近年來，對于功能型酒飲料的成分分析及功效作用研究較多，例如藍莓果酒、鮮竹酒基酒、橄欖酒等，但對于藥食類基酒的配制及功效研究較少，本研究主要探討配制的黃精基酒對游泳力竭小鼠抗疲勞和抗氧化作用的影響。

疲勞感是機體的一種常見亞健康狀態，主要表現為肌肉力量下降和儲存能量降低，并經常伴隨著中樞神經緊繃和免疫力下降的現象，嚴重者更會出現精神不濟、意識不清、免疫力下降等狀況[6]，因此，研究具有抗疲勞作用的功效產品和措施有重要意義。

本研究選用多花黃精作為原料，利用乙醇浸提法進行3次功效成分提取，得到黃精提取液，再將食用酒精作為基酒進行調配，得到黃精基酒，研究其對ICR小鼠的抗氧化及抗疲勞作用，通過測定超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷丙轉氨酶的活性，丙二醛、谷胱甘肽、乳酸、肝糖原的含量和負重游泳時間相關指標，評價黃精基酒的功效性，進一步揭示黃精基酒抗氧化及抗疲勞的作用效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

5周齡ICR雄性小鼠（清潔級，240只，體質量19 g～20 g）：長春億斯實驗動物技術有限責任公司，合格證號：SCXK（吉）-2018-0007，動物質量合格證序號202000034165，飼養于哈爾濱商業大學藥學院SPF級動物實驗室中，飼養條件：溫度22℃～24℃，相對濕度（55±5）%，12h/12h晝夜循環，小鼠轉移到飼養箱后進行適應性飼養1周，期間喂養普通飼料，保持自由飲水。

黃精：市售；食用釀造酒精：南通海逸化工有限公司；過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）測定試劑盒、乳酸（lactic acid，LA）測定試劑盒、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）測定試劑盒、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）測定試劑盒、肝糖原（glycogen）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器與設備

紫外可見分光光度計（UV-5200）：北京普析通用儀器有限責任公司；電子天平（MC精密型）：北京賽多利斯儀器系統有限公司；酶標儀（SpectraMax 190）：上海科華生物工程股份有限公司；電熱恒溫水浴鍋（HH-4）：中國化工儀器廠；超聲波粉碎機（FW177）：上海滬析實業有限公司；游泳箱（60 cm×50 cm×50 cm）：蓋得化工有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃精基酒制備

工藝流程：黃精→粉碎→稱樣→乙醇浸提→抽濾→一次浸提→二次浸提→三次浸提→合并濾液→濃縮至30%→加入食用乙醇配制成體積分數為40%的黃精基酒。

1.3.2 動物實驗分組及給藥

分別進行抗氧化和抗疲勞兩部分實驗，具體灌胃量參照牛曼思等[7]的方法，其中白酒陰性組為給予和空白組等體積劑量的40%vol白酒，陽性藥物組用量依據臨床使用的人體推薦用量折算（標準體重60 kg），設置高、中、低劑量組，分別給予等同于人體劑量的20倍、10倍和5倍，具體分組及給藥劑量如表1所示。

表1 試驗分組及給藥劑量Table 1 Group assignment and dosage

1.3.3 抗氧化實驗

將其中60只5周齡小鼠進行7 d適應性飼養后隨機分為6組，每組10只，實驗期間不間斷給藥21 d，末次給藥結束后，在溫度為（26.5±0.5）℃，規格為60 cm×50 cm×50 cm的透明游泳箱中進行無負重自由活動，休息1 h后采用頸椎脫臼法處死[8]，取小鼠肝臟和腎臟，用生理鹽水去污洗凈處理后，采用超聲波破碎機粉碎組織并制備成勻漿[9]。

1.3.4 抗疲勞實驗

另外180只雄性小鼠進行7 d適應性飼養后隨機分為6組，每組30只，實驗期間不間斷給藥21 d，每組取10只在末次給藥結束后，休息0.5 h進行小鼠負重游泳抗疲勞實驗，在小鼠尾部固定其體重5%的清潔鐵絲，使其在深度為50 cm，溫度為（26.5±0.5）℃的游泳箱中進行負重游泳[10]，記錄小鼠口鼻露出水面開始游泳直至整體沉入水下8 s且不能浮出水面時終止計時，此時間即為小鼠的負重游泳時間。

1.3.5 抗氧化檢測指標

按照試劑盒的操作說明方法進行小鼠肝腎組織中SOD活性、CAT活性、GSH含量和MDA含量的測定[11-13]。

1.3.6 抗疲勞檢測指標

在末次給藥30 min后，每組取10只小鼠，進行無負重游泳60 min，休息10 min后用頸椎脫臼法處死小鼠，摘取肝臟，并用生理鹽水漂洗，濾紙吸干，超聲破碎后制備成質量分數10%的組織勻漿，按照試劑盒操作說明測定小鼠肝糖原含量。

血乳酸測定采用對小鼠采取眼內靜脈叢采血的方法，每組取10只，在末次給藥30 min后進行無負重游泳實驗10 min，分別在開始前0 min，游泳結束后0、20 min測定小鼠血清的乳酸值，根據血乳酸曲線面積公式進行計算。

式中：W為血乳酸曲線下面積；A1為游泳實驗前0 min血乳酸值，mmol/g prot；A2為游泳實驗后0 min血乳酸值，mmol/g prot；A3為游泳實驗后20 min血乳酸值，mmol/g prot。

取負重游泳后的小鼠采用微板法測定ALT活性，按照試劑盒操作說明進行測定并記錄。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 23.0版本統計軟件進行數據分析，數據結果用平均值±標準差表示，并用Origin 2018統計軟件對相關數據指標進行作圖，當P<0.05時數據有顯著性差異，當P<0.01時數據有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 抗氧化功效評價

2.1.1 黃精基酒對小鼠體質量的影響

體質量變化可以直接地反映出小鼠的生長發育情況，也可以間接表現出在飼養期間黃精基酒對ICR小鼠的影響情況。各組小鼠的體質量變化如圖1所示。

圖1 各組小鼠體質量狀況Fig.1 Body weight of mice in each group

在適應性喂養7 d后小鼠的體質量為（20±4）g，由圖1可知，黃精基酒給藥組的小鼠經過21 d給藥灌胃后體質量逐漸上升，與空白組小鼠相比無明顯差異，且日常活動正常，毛色發亮，四肢活動自如，好聚集，說明黃精基酒對小鼠正常活動無明顯影響。

2.1.2 小鼠肝臟及腎臟丙二醛含量

丙二醛含量可以直接反映脂肪分解酶發生脂質過氧化時的強度和速度。自由基過剩會導致體內的脂質小分子發生氧化反應，產生過量的丙二醛，造成器官組織的損傷[14]。因此，測定組織器官中的MDA含量能夠有效反映脂質氧化反應強度和自由基對機體攻擊的程度。不間斷灌胃給藥21 d后取小鼠的肝臟和腎臟組織進行測定，結果如圖2所示。

圖2 各組小鼠肝、腎丙二醛含量Fig.2 Content of malondialdehyde in the liver and kidney of mice in each group

由圖2可知，與空白組相比，抗壞血酸陽性組、黃精基酒高、中、低劑量組均呈現顯著降低的趨勢（P<0.05），抗壞血酸陽性組肝、腎組織MDA含量分別為0.4、0.93 nmol/mg prot，而白酒陰性組小鼠肝、腎 MDA含量明顯高于抗壞血酸陽性組小鼠（P＜0.05），分別增加了178.57%、62.89%和171.43%、81.44%，黃精基酒高、中、低劑量組小鼠肝、腎MDA含量顯著低于白酒陰性組（P＜0.05），這可能是黃精基酒阻斷了機體內核酸、蛋白質及大分子物質的交聯聚合，阻止了細胞膜上的不飽和脂肪酸發生氧化反應[15]，說明黃精基酒可有效降低MDA含量，緩解小鼠肝臟與腎臟的氧化損傷程度。

2.1.3 小鼠肝、腎谷胱甘肽含量

谷胱甘肽是體內一種游離的巰基三肽，主要生理作用是能夠保護核糖核酸酶類的蛋白質小分子物質的巰基結構不被破壞，清除掉機體內過剩的自由基[16]。不間斷灌胃21 d后GSH含量如圖3所示。

圖3 各組小鼠谷胱甘肽含量Fig.3 Glutathione content of mice in each group

由圖3可知，與空白組相比，抗壞血酸陽性組和黃精基酒3個劑量組的小鼠肝、腎組織均顯著增高（P<0.05），白酒陰性組和黃精基酒中、低劑量組顯著低于抗壞血酸陽性組小鼠（P<0.05），黃精基酒高、中、低劑量組顯著高于白酒陰性組小鼠（P<0.05），說明黃精基酒可有效提高小鼠體內的谷胱甘肽含量，各劑量組之間相互比較發現，隨著給藥劑量的升高，小鼠體內的谷胱甘肽含量也會隨之提升，這可能是由于肝、腎組織內GSH中的巰基（—SH）發生了氧化脫氫反應，與體內過剩的自由基結合，轉化為酸類產物，加快了體內排泄[17]，劉超等[18]研究發現，沙棘籽油濃度越高，衰老型小鼠腦部谷胱甘肽含量也會持續升高，其結論與本文一致。

2.1.4 小鼠肝、腎超氧化物歧化酶活性

研究表明，超氧化物歧化酶有明顯保護肝臟和腎臟細胞并防止肝臟發生纖維化的作用，若SOD活性大幅度降低，則會造成體內自由基清除不足的現象[19]。不間斷灌胃給藥21 d后，小鼠肝臟及腎臟SOD活性如圖4所示。

圖4 各組小鼠肝、腎超氧化歧化酶活性Fig.4 Superoxide dismutase activity in the liver and kidney of mice in each group

由圖4可知，抗壞血酸陽性組小鼠肝、腎組織中SOD活性顯著高于空白組（P<0.05），黃精基酒給藥組小鼠肝、腎SOD含量顯著低于抗壞血酸陽性組小鼠（P<0.05），且顯著高于白酒陰性組小鼠（P<0.05），說明黃精基酒能夠增強小鼠肝、腎組織中SOD的活性，這可能是由于肝、腎組織內的超氧陰離子在超氧化物歧化酶的作用下與體內其它的氫離子發生反應生成了過氧化氫酶體，而植物屬黃精中葉綠體包含的Zn/Cu-SOD和線粒體中包含的Mn-SOD與這種過氧化氫酶體發生循環催化反應清除了O2-·，使SOD活性升高[20]，這一結果充分說明，黃精基酒具有提高小鼠體內超氧化物歧化酶活性的作用。

2.1.5 小鼠肝臟和腎臟的過氧化氫酶活性

過氧化氫酶廣泛分布于動物的肝臟和紅細胞中，主要作用是清除體內含過氧化氫的自由基，從而使機體內的細胞免受過氧化氫的侵害，為機體提供抗氧化防御，保護機體內的組織器官，是具有抵抗外部物質侵害作用的關鍵物質之一[21]。因此，測定小鼠體內的CAT能有效反映過氧化氫催化反應的速率和效果。不間斷灌胃給藥21 d后，小鼠肝、腎組織中CAT活性如圖5所示。

圖5 各組小鼠肝、腎過氧化氫酶活性Fig.5 Catalase activity in the liver and kidney of mice in each group

由圖5可知，抗環血酸陽性組小鼠與空白組相比肝、腎中CAT活性有明顯提升且呈現顯著性差異（P<0.05），分別增加了48.65%、15.63%，黃精基酒組與抗環血酸陽性組小鼠的CAT活性顯著高于空白組與白酒陰性組（P＜0.05），白酒陰性組小鼠肝、腎的CAT活性明顯低于抗壞血酸陽性組（P＜0.05），分別降低了21.82%、14.86%，這可能與過氧化氫酶的酶體及線粒體中氧氣濃度的反應速率有關，黃精基酒降低了肝、腎組織線粒體內O2濃度，減緩了過氧化氫酶與H+結合生成H2O的催化反應[22]，這一結果表明，黃精基酒可有效提高小鼠體內的CAT活性，增強催化CAT的能力。

2.2 抗疲勞功效評價

2.2.1 小鼠負重游泳時間測定結果

負重游泳實驗是評價小鼠抗疲勞的最有效方法之一[23]，通過游泳時間長短來評價黃精基酒對小鼠的抗疲勞效果。經口灌胃黃精基酒21 d后，小鼠負重游泳時間結果如表2所示。

表2 各組小鼠負重游泳時間Table 2 Weight-bearing swimming time of mice in each group

由表2可知，與空白組相比，黃精基酒高、中劑量組和紅景天苷陽性組小鼠負重游泳時間均有所延長，其中紅景天苷陽性組和中劑量組有顯著性差異（P<0.05），高劑量組有極顯著性差異（P<0.01），與白酒組相比，黃精基酒3個劑量組小鼠負重游泳時間也有所延長，而低、中劑量組呈現顯著性差異（P<0.05），高劑量組有極顯著性差異（P<0.01），說明黃精基酒可以有效延長小鼠的負重游泳時間，提高小鼠運動過程中的耐力，具有一定的抗疲勞作用，并且小鼠游泳時間會隨黃精基酒灌胃濃度的升高逐漸增加。

2.2.2 小鼠肝糖原含量

糖原是生物機體內重要的能量來源，肝糖原能維持機體血糖水平的穩定，當機體進行大量運動時會轉化成葡萄糖[24]，只有機體中存在一定量的肝糖原，才能提供足夠生命活動消耗的能量，從而達到抗疲勞的作用。因此，測定肝糖原含量可以在一定程度上反映機體運動耐力的水平。經口灌胃21 d后測定各組小鼠肝臟中肝糖原的含量如表3所示。

表3 各組小鼠肝糖原含量Table 3 Glycogen content in the liver of mice in each group

由表3可知，負重游泳實驗后與空白組相比，3個劑量組的肝糖原含量顯著增加（P<0.05），而高劑量組小鼠肝糖原含量顯著高于白酒陰性組（P<0.05），且隨著黃精基酒劑量的增大，小鼠體內肝糖原的含量也隨之增加，這可能是由于黃精基酒能增加機體肝糖原的儲備，促進了葡萄糖的轉化量，提升小鼠運動耐力，說明黃精基酒具有緩解運動疲勞，增強機體能量儲存的效果[25]。

2.2.3 小鼠血乳酸含量

乳酸是糖代謝后的產物，由體內的紅細胞和腦組織分泌生成，血液中的乳酸大多在肝臟合成，再經腎臟排出體外，因此，通過測定小鼠體內的乳酸狀況可以有效評價機體肝臟的代謝狀況[26]，各組小鼠的血乳酸含量如表4所示。

由表4可知，負重游泳前各組小鼠的血清乳酸含量無顯著差異（P>0.05），游泳結束后中劑量組小鼠即刻的血乳酸含量顯著低于空白組和白酒陰性組小鼠（P<0.05），高劑量組小鼠血清乳酸含量極顯著低于空白組和白酒陰性組（P<0.01），游泳結束后20 min各組小鼠的血乳酸值沒有顯著差異（P>0.05），根據血乳酸曲線面積公式計算后發現，中劑量組和高劑量組小鼠血乳酸曲線面積極顯著低于空白組和白酒陰性組（P<0.01），這可能是由于紅景天苷和黃精基酒可以減少體內乳酸的堆積，促進丙酮酸脫氫酶對丙酮酸的轉換作用，生成大量的乙酰輔酶A[27]，說明黃精基酒可以有效清除小鼠體內的乳酸，起到緩解疲勞的作用。

表4 各組小鼠血乳酸含量Table 4 Lactic acid content in the blood of mice in each group

2.2.4 酒精肝損傷檢測

谷丙轉氨酶（ALT）廣泛存在于肝臟細胞中，當肝臟受到一定損傷時，體內大量的ALT會流出到肝臟外，造成肝炎性類的疾病。ALT指標能明顯反映肝臟損傷的情況，酒精脂肪肝是長期飲酒后最常出現的一種病狀，人體在大量飲酒后會加快組織器官的正常活動，對肝臟的生理活動產生負荷作用，形成病變，造成機體血清中的ALT活性升高[28]。因此，測定血清中的ALT活性可以在一定程度上反映出酒精對肝臟的損傷程度。各組小鼠的ALT活性測定結果如表5所示。

表5 各組小鼠谷丙轉氨酶活性Table 5 Activity of alanine aminotransferase of mice in each group

由表5可知，負重游泳實驗后與空白組相比，中、低劑量組小鼠血清中的ALT活性顯著升高（P<0.05），高劑量組小鼠的ALT活性極顯著升高（P<0.01），與白酒陰性組相比，黃精基酒中劑量組呈現顯著降低趨勢（P<0.05），高劑量組呈現極顯著降低趨勢（P<0.01），這可能是由于肝臟細胞中的ALT將丙氨酸中的α-酮戊二酸轉化為谷氨酸，丙氨酸轉化成丙酮酸，二者貯存在肝臟細胞的細胞質中，參與機體活動過程中的蛋白質代謝，防止脂肪沉積，進而對小鼠酒精肝損傷起到緩解作用，可在一定程度上保護小鼠肝臟[29]。而白酒陰性組明顯高于紅景天苷陽性組，證明白酒對于小鼠的肝臟會造成一定損傷。

3 結論

本研究通過測定游泳運動后的小鼠各項指標情況，評價黃精基酒對其抗氧化和抗疲勞的作用，結果顯示，黃精基酒3個劑量組和抗壞血酸陽性組小鼠肝、腎組織中的CAT活性和GSH含量明顯高于空白組和白酒陰性組小鼠（P<0.05），而MDA含量有明顯的降低趨勢（P<0.05），不同劑量組之間比較發現，隨著黃精基酒濃度的增加，整體抗氧化能力也逐漸提高，說明所調配的黃精基酒可以有效提高小鼠機體內過氧化氫酶的活性和谷胱甘肽的含量，其抗氧化效果與劑量高低也存在一定關系。在小鼠抗疲勞負重游泳實驗結果中顯示，高、中、低劑量組和陽性藥物紅景天苷能有效延長小鼠的負重游泳時間（P<0.05），減少乳酸含量（P<0.05），說明所配制的黃精基酒對機體大量運動產生的疲勞感有一定的緩解作用。從酒精肝損傷檢測結果看，黃精基酒3個劑量組ALT活性明顯低于陰性組小鼠（P<0.05），這證明白酒對于小鼠的肝臟會造成一定的損傷，而黃精基酒具有一定的保護作用。