響應面法優化酶法提取寧紅茶多糖工藝

羅蘭心，張靜，劉洋，姜青，滕杰*

（1.江西農業大學 農學院，江西 南昌 330045；2.江西婺源茶業職業學院，江西 上饒 333200）

茶多糖（tea polysaccharides，TPs）又稱為茶活性多糖或茶葉多糖，是醛糖和（或）酮糖通過α-糖苷鍵或β-糖苷鍵連接成的天然聚合物，主要由阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖等組成高聚合度的多糖苷鍵聚糖類，并與蛋白質緊密結合，約占茶葉干物質重的0.8%～3.5%[1]，茶多糖具有降低血糖、血脂、改善胰島素抵抗、增強葡萄糖耐受、抗血凝等功效，對糖尿病并發癥也有積極預防效果[2-5]，是現階段極具開發潛質的天然物質之一，廣泛應用于功能食品、醫藥保健、美容日化等領域，其提取、純化方法也受到廣泛關注[6-7]。

江西省修水縣古稱義寧州，所產紅茶稱為寧州工夫紅茶，又簡稱為“寧紅”，是當前江西省重點打造“四綠一紅”茶產業中的唯一紅茶品牌[8]。目前，對于寧紅茶營養功效研究相對較薄弱，特別是在功能成分提取制備方面的報道較少。傳統的茶多糖提取方法多采用水提醇沉法[9]、酸堿提取法[10]、超聲波或微波輔助浸提法[11]、超臨界萃取法[12]等，上述方法多存在提取得率低、儀器設備要求嚴或經濟成本高等問題[13]，而采用酶法的提取反應條件較溫和，有效成分浸出率和生物活性較高等優勢[14-15]。為推動寧紅茶深加工利用并提高其茶多糖提取量，基于響應面分析法中的中心組合設計優化酶法提取工藝技術，探討提取時間、復合酶用量和料液比等關鍵因素對寧紅茶多糖提取量的影響，為寧紅茶開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧紅茶：2020年5月產自江西省寧紅集團有限公司，按照寧紅茶傳統工夫紅茶的“萎調→揉捻→發酵→干燥→提香”加工工序制作。干茶粉碎后過40目篩備用。

果膠酶（11 000 U/g）、中性蛋白酶（30 000 U/g）、纖維素酶（10 000 U/g）：諾維信（中國）生物技術有限公司；葡萄糖標準品：成都埃法生物科技有限公司；蒽酮、濃硫酸：國藥集團化學試劑有限公司。以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ME204電子分析天平：梅特勒-托利多（常州）儀器有限公司；UV-722紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；SHB-III循環水式多用真空泵：河南鄭州長城科工貿有限公司。

1.3 方法

1.3.1 寧紅茶多糖標準曲線制作及含量測定

寧紅茶多糖含量測定依據蒽酮-硫酸法[16]進行。稱取0.33 g蒽酮加入到100 mL濃硫酸于棕色瓶中溶解；0.25 g葡萄糖標準品于250 mL容量瓶中定容，搖勻后分別取 2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mL 于 100 mL 定容，分別取 1 mL置于標有 1、2、3、4、5 編號試管，冰水浴中分別加入4 mL蒽酮-硫酸溶液，搖勻后3 min沸水浴后快速冷卻，于620 nm波長處測定其吸光值，以蒸餾水代替葡萄糖溶液為空白對照。以質量濃度x為橫坐標，吸光值y為縱坐標繪制標準曲線，得到標準曲線方程y=0.083 4x-0.033 1（R2=0.999 1），說明測定范圍內線性關系較好。

寧紅茶提取液中茶多糖測定：抽濾樣品于100 mL容量瓶中定容，取0.2 mL試液于具塞刻度試管中，各管中準確移入4 mL蒽酮試劑，搖勻后置于沸水浴中準確加熱7 min，冷卻至室溫后于620 nm波長處測定吸光度，根據標準曲線方程計算各提取液中寧紅茶多糖提取量。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 酶種類篩選

稱取1.0 g寧紅茶粉末，料液比1:20（g/mL），酶解溫度45℃，反應時間3 h條件下，分別檢測0.8%（以底物質量計）酶用量的5種類型[纖維素酶（種類1），果膠酶（種類2），果膠酶與纖維素酶組合酶（種類3），果膠酶、纖維素酶和中性蛋白酶組合（種類4），中性蛋白酶（種類5）]對寧紅茶多糖提取量的影響，確定適合的酶種類。

1.3.2.2 果膠酶與纖維素酶質量比對寧紅茶多糖提取量的影響

準確稱取1.0 g寧紅茶粉末，料液比1:20（g/mL），復合酶用量0.8%（以底物質量計），酶解溫度45℃，反應時間3 h條件下，分別考察果膠酶與纖維素酶質量比為3:1、2:1、1:1、1:2、1:3對寧紅茶多糖提取量的影響。

1.3.2.3 復合酶用量對寧紅茶多糖提取量的影響

準確稱取1.0 g寧紅茶粉末，料液比1:20（g/mL），酶解溫度45℃，反應時間3 h條件下，分別考察復合酶用量（果膠酶:纖維素酶=2:1，質量比）0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%對寧紅茶多糖提取量的影響。

1.3.2.4 酶解溫度對寧紅茶多糖提取量的影響

準確稱取1.0 g寧紅茶粉末，料液比1:20（g/mL），復合酶用量0.9%（果膠酶:纖維素酶=2:1，質量比），反應時間3 h條件下，分別考察酶解溫度35、40、45、50、55℃對寧紅茶多糖提取量的影響。

1.3.2.5 提取時間對寧紅茶多糖提取量的影響

準確稱取1.0 g寧紅茶粉末，料液比1:20（g/mL），復合酶用量0.9%（果膠酶:纖維素酶=2:1，質量比），酶解溫度45℃條件下，分別考察提取時間2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h對寧紅茶多糖提取量的影響。

1.3.2.6 料液比對寧紅茶多糖提取量的影響

準確稱取1.0 g寧紅茶粉末，復合酶添加量0.9%（果膠酶:纖維素酶=2:1，質量比），酶解溫度45℃，提取時間3.5 h條件下，分別考察料液比1:10、1:15、1:20、1:25、1:30（g/mL）對寧紅茶多糖提取量的影響。

1.3.3 響應面優化試驗

按照響應面Box-Behnken中心組合試驗設計的原理，基于單因素試驗結果進行三因素三水平試驗設計，以提取時間（A）、復合酶用量（B）和料液比（C）為響應因子，響應面試驗設計因素與水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factor levels and variables of response surface design

1.4 數據分析

使用Excel 2007軟件分析相關試驗數據，SPSS 21.0軟件對數據進行單因素方差分析和顯著性分析，Design-expert 8.0軟件中Box-Behnken構建響應面試驗和分析回歸模型結果。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 酶種類的確定

不同酶種類對寧紅茶多糖提取量的影響見圖1。

圖1 不同酶種類對寧紅茶多糖提取量的影響Fig.1 Effect of enzyme types on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea

由圖1可知，以種類3（果膠酶與纖維素酶組合）獲得寧紅茶多糖提取量最高，達到27.32 mg/g（P＜0.05），其次是種類2（果膠酶）和種類4（果膠酶、纖維素酶和中性蛋白酶組合），寧紅茶多糖提取量為23 mg/g左右，二者間無顯著差異（P＞0.05），而種類1（纖維素酶）獲得寧紅茶多糖提取量最低，僅有16.70 mg/g（P＜0.05），與種類5（中性蛋白酶）獲得18.70 mg/g寧紅茶多糖提取量無顯著差異（P＞0.05）。說明中性蛋白酶的存在可能會抑制復合酶的綜合作用，且單獨使用時效果亦不佳。確定以種類3（果膠酶與纖維素酶組合）為酶解體系提取寧紅茶中的茶多糖。

2.1.2 果膠酶與纖維素酶質量比的影響

果膠酶與纖維素酶質量比對寧紅茶多糖提取量的影響見圖2。

由圖2可知，在果膠酶與纖維素酶質量比2:1～1:3內，隨著纖維素酶的用量增加，寧紅茶多糖提取量呈現下降趨勢，由 27.87 mg/g降低到 18.70 mg/g（P＜0.05）。以果膠酶與纖維素酶質量比為2:1時，兩種酶活性復合作用發揮最優，此時寧紅茶多糖提取量最高（27.87 mg/g），但與果膠酶與纖維素酶質量比為1:1時的寧紅茶多糖提取量無顯著差異（P＞0.05），綜合試驗結果和原料成本確定果膠酶和纖維素酶質量比為2:1適宜。

圖2 果膠酶與纖維素酶質量比對寧紅茶多糖提取量的影響Fig.2 Effect of pectinase-cellulose content ratio on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea

2.1.3 復合酶用量的影響

復合酶用量對寧紅茶多糖提取量的影響見圖3。

圖3 復合酶用量對寧紅茶多糖提取量的影響Fig.3 Effect of compound enzymatic addition on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea

由圖3可知，在選取的果膠酶與纖維素酶組合的復合酶用量范圍內，寧紅茶多糖提取量隨著復合酶用量的增加呈先升高后降低的變化趨勢，當復合酶用量為0.9%（以底物質量計）時，寧紅茶多糖提取量達到最高 30.72 mg/g（P＜0.05），繼續增加復合酶用量，寧紅茶多糖提取量顯著降低，在復合酶用量為1.3%時僅有21.98 mg/g，其原因是酶量達到一定臨界時，反應體系會達到飽和狀態，隨著復合酶用量的繼續增加會抑制酶活性或加速產物轉變[17]。綜合表明果膠酶和纖維素酶組合的復合酶用量以0.9%最佳。

2.1.4 酶解溫度的影響

酶解溫度對寧紅茶多糖提取量的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對寧紅茶多糖提取量的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea

由圖4可知，在35℃～45℃內寧紅茶多糖提取量隨著溫度升高顯著增加，由最初的22.37mg/g顯著增加到30.73 mg/g（P＜0.05），達到寧紅茶多糖提取量最大值。而隨著溫度繼續升高，寧紅茶多糖提取量顯著下降，在55℃時寧紅茶多糖提取量僅有21.29 mg/g，但與35℃時的提取效果無顯著差異（P＞0.05），其原因是酶具有最適溫度，低溫不能發揮酶的最適活性，溫度過高會抑制酶活性甚至是破壞酶結構，直至完全喪失其活性[18]。45℃～55℃的酶解溫度抑制了酶活性，而活性物質溶出率的上升往往依靠溫度的提高，但提取效果不及酶解效果。結果表明酶解溫度以45℃適宜。

2.1.5 提取時間的影響

提取時間對寧紅茶多糖提取量的影響見圖5。

圖5 提取時間對寧紅茶多糖提取量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea

由圖5可知，在選取2.0h～4.0h內，茶多糖提取量隨著提取時間的延長呈現先增加后降低的變化趨勢，在3.0h時達到寧紅茶多糖提取量最大值32.33mg/g（P＜0.05），而提取時間2.0h寧紅茶多糖提取量最低，僅為18.57mg/g（P＜0.05）。表明短時間的提取時間，酶解作用和浸提效果不充分，而酶解時間過長對提高寧紅茶多糖的提取量無顯著促進作用，存在反應體系抑制酶活性的現象或不利于產物的穩定因素[19]。確定提取時間以3.0 h最佳。

2.1.6 料液比的影響

料液比對寧紅茶多糖提取量的影響見圖6。

圖6 料液比對寧紅茶多糖提取量的影響Fig.6 Effect of ratio of solid to liquid on extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea

由圖 6 可知，在 1:10（g/mL）～1:30（g/mL）內，寧紅茶多糖提取量隨溶劑添加量的減小而呈現顯著的先升高后降低的變化趨勢，當料液比1:20（g/mL）時，寧紅茶多糖提取量達到最大值32.27 mg/g（P＜0.05），隨后顯著下降，在料液比 1:30（g/mL）時僅有 18.49 mg/g（P＜0.05），該結果與 1:10（g/mL）時提取量（17.93 mg/g）無顯著差異。其原因為料液比較大時易受到傳質阻力影響，寧紅茶多糖溶出量偏低；在一定的料液比范圍內，傳質阻力減弱，包括寧紅茶多糖在內的活性物質溶出量會升高，當溶劑添加量過小時大量的液體溶劑形成稀釋效應[20]。確定料液比以1:20（g/mL）最佳。

2.2 響應面模型建立與分析

根據Box-Benhnken的中心組合原理設計17組試驗，結果如表2所示。

表2 響應面分析試驗及結果Table 2 Response surface methodology and analysis results

對表2中的試驗數據進行二次多項式回歸擬合，得到寧紅茶多糖提取量（Y）與提取時間（A）、復合酶用量（B）、料液比（C）的回歸模型方程：Y=31.18+2.58A+2.24B+6.08C+0.19AB+1.18AC+1.89BC-1.41A2-5.85B2-6.65C2。

方差分析見表3。

表3 寧紅茶多糖提取量的回歸模型方程方差分析Table 3 Analysis and statistical parameters of regression model on tea polysaccharides from Ninghong black tea

由表3可知，該試驗模型P<0.000 1，極顯著；失擬項P=0.368 0>0.05，不顯著，說明該模型具有很高可信度[21]。本試驗選取的3個因子對寧紅茶多糖提取量Y的影響強弱順序：C（料液比）>A（提取時間）>B（復合酶用量）；一次項 A、B、C 均呈極顯著；二次項 B2、C2和交互項AC、BC均呈極顯著，二次項A2呈顯著。相關系數R2=0.993 8，表明響應值的變化有99.38%來源于所選變量；校正相關系數R2adj=0.985 9，表明該模型可以解釋98.59%的響應值變化；變異系數C.V.%=3.39<5%，說明試驗設計的精確性和重復性極其顯著。綜上證明該模型擬合程度高，可應用于分析和預測寧紅茶中茶多糖的提取工藝。

2.3 Box-Behnken響應面圖分析

各響應因素交互作用對寧紅茶多糖提取量影響如圖7所示。

由圖7可知，提取時間與料液比、復合酶用量與料液比對寧紅茶多糖提取量影響的響應曲面坡度較陡峭，等高線呈橢圓形且各曲線之間密集，說明各因子的交互效應對寧紅茶多糖提取量的作用顯著。同時，結合曲面陡峭變化，說明料液比對寧紅茶多糖提取量的影響更顯著，其次是提取時間和復合酶用量，與方差分析結果一致。

圖7 各響應因素交互作用對寧紅茶多糖提取量影響的響應面和等高線圖Fig.7 The response surface and contour plots of the interaction of each factor to the extraction of tea polysaccharides from Ninghong black tea

2.4 最佳條件確定與回歸模型驗證

通過Box-Behnken響應面優化試驗得到復合酶法提取寧紅茶多糖最佳工藝參數：提取時間3.211h，復合酶用量0.933%（以底物質量計），料液比1:20（g/mL），此條件下獲得寧紅茶多糖提取量為31.905 mg/g。為便于實際操作，優化調整工藝技術參數：提取時間3.2 h，復合酶用量0.93%（以底物質量計），料液比1:20（g/mL），并在此參數下進行3次重復驗證，寧紅茶多糖提取量平均值為31.62 mg/g，與理論值31.905 mg/g接近（P>0.05），表明基于Box-Behnken響應面優化酶法提取寧紅茶多糖的工藝技術可靠。

3 結論

本研究以江西省寧紅茶的茶多糖提取量為考察目標，在單因素試驗篩選基礎上，利用Box-Behnken響應面優化酶法提取寧紅茶多糖的工藝技術，獲得最佳提取工藝參數：提取時間3.2 h，復合酶用量0.93%（以底物質量計），料液比1:20（g/mL），在此工藝參數下其提取量為31.62 mg/g，接近模型預測的提取值31.905 mg/g（P>0.05），綜合說明此試驗模型結果可靠，且該提取方法優于傳統提取方法效果，試驗為寧紅茶的深加工利用提供科學依據。