超聲輔助制備帶魚副產(chǎn)物糖蛋白工藝優(yōu)化

陳佳琪，陸曉丹，沈熠杰，陳沛欣，楊清羽，賈茹，郭澤鑌*

（1.福建農(nóng)林大學 食品科學學院，福建 福州 350002；2.閩臺特色海洋食品加工及營養(yǎng)健康教育部工程研究中心，福建 福州 350002）

帶魚（Trichiurus lepturus）是我國四大海產(chǎn)魚種之一，在我國黃海、東海、渤海至南海都有分布[1]。帶魚作為一種食用經(jīng)濟魚類，含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、脂肪、多不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)[2]。帶魚加工過程中會產(chǎn)生約占原料50%的加工副產(chǎn)物如魚頭、內(nèi)臟、魚骨等[3]，其副產(chǎn)物含有豐富的蛋白質(zhì)，是提取海洋蛋白資源的極佳來源[4-5]。這些魚加工副產(chǎn)物通常被隨意丟棄或被簡單加工成為魚飼料，會造成環(huán)境的污染以及海洋資源利用率較低[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，魚加工副產(chǎn)物是提取生物活性成分的主要來源之一。左格格等[8]從羅非魚加工副產(chǎn)物中提取出硫酸軟骨素；宋恭帥等[9]以大目金槍魚副產(chǎn)物為原料，采用酶解法提取得到粗魚油，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳工藝條件；Chen等[10]從羅非魚鱗片制備得到具有冷凍保護活性的抗凍肽；黑智亮等[11]從鯽魚卵中提取糖蛋白，通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到鯽魚卵唾液酸糖蛋白制備工藝。魚加工副產(chǎn)物含有豐富的功能成分，在食品工業(yè)領(lǐng)域中可被更好地開發(fā)和高值化利用。

糖蛋白是由糖鏈和肽鏈以共價鍵連接而成的結(jié)合蛋白質(zhì)[12]，同時具有多糖和蛋白質(zhì)的某些性質(zhì)，研究表明糖蛋白還具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤等功能作用[13-15]。海洋源糖蛋白的提取方法主要有水浸提法、酸堿提取法、鹽溶液提取法、酶提取法、物理輔助提取法等[16-17]。 目前已有學者從墨魚[18]、鮑魚[19]、海蜇[20]、馬氏珠母貝[21]等提取糖蛋白，還尚未見有關(guān)帶魚副產(chǎn)物提取糖蛋白的相關(guān)研究。超聲技術(shù)在物理輔助提取糖蛋白中應(yīng)用較多，其原理是利用超聲波的空化作用、熱效應(yīng)、機械作用加速細胞壁的破碎，促進胞內(nèi)物質(zhì)的溶出[22]。因此，將超聲技術(shù)應(yīng)用于提取糖蛋白可以有效提高糖蛋白的得率。

基于此，本研究通過測定帶魚副產(chǎn)物的基本營養(yǎng)成分，并在預試驗的基礎(chǔ)上，采用超聲輔助鹽提法提取帶魚副產(chǎn)物中的糖蛋白，選取NaCl濃度、提取時間、提取溫度、料液比、超聲功率、超聲時間作為單因素，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化并確定帶魚副產(chǎn)物糖蛋白的最佳提取工藝條件，為帶魚副產(chǎn)物糖蛋白的提取工藝優(yōu)化及進一步理化特性的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

帶魚副產(chǎn)物：福建宏升兄弟食品有限公司，主要組成為魚內(nèi)臟、魚骨頭、魚刺。

氯化鈉（分析純）、石油醚（分析純）、乙醇（分析純）：西隴科學股份有限公司；正丁醇（分析純）、氯仿（分析純）：上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機（3H24R1）：長沙湘智離心機儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH系列）：上海江星儀器有限公司；大功率恒溫磁力攪拌器（88-1）：常州國華電器有限公司；微波超聲波組合萃取儀（XH-300B）：北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；冷凍干燥機（FDU-1200）：上海愛朗儀器有限公司；電子天平（FA224）：上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 營養(yǎng)成分的測定

1.3.1.1 水分測定

水分含量參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》測定。

1.3.1.2 蛋白質(zhì)測定

蛋白質(zhì)含量參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》測定。

1.3.1.3 總糖測定

總糖含量參照GB9695.31—1991《肉制品總糖含量測定》測定。

1.3.1.4 脂肪測定

脂肪含量參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》測定。

1.3.1.5 灰分測定

灰分含量參照GB5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》測定。

1.3.2 帶魚副產(chǎn)物糖蛋白的制備工藝

帶魚副產(chǎn)物經(jīng)滾揉混合成勻漿后，置于-20℃冷藏庫中備用。將冷凍的帶魚副產(chǎn)物自然解凍，稱取樣品，加入石油醚進行充分的脫脂處理。稱取20 g脫脂帶魚副產(chǎn)物，加入一定料液比的鹽溶液進行超聲破碎，于一定溫度下水浴一段時間，離心取上清液，加入乙醇至終濃度為75%，低溫靜置過夜，離心取沉淀，將沉淀溶解后加入與樣品體積比為1:3的sevage試劑（體積比為4:1的氯仿和正丁醇），進行脫游離蛋白，取上層液體透析48 h以上，冷凍干燥得到糖蛋白[13]。

1.3.3 帶魚副產(chǎn)物糖蛋白得率

糖蛋白得率的計算公式如下。

式中：m為糖蛋白凍干質(zhì)量，mg；M為脫脂原料質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 NaCl濃度對糖蛋白得率的影響

固定提取時間為1.5 h、提取溫度為70℃、料液比為1:6（g/mL）、超聲功率為500 W、超聲時間為10 min，研究不同 NaCl濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L）對糖蛋白得率的影響。

1.3.4.2 提取時間對糖蛋白得率的影響

在1.3.4.1試驗基礎(chǔ)上，固定NaCl濃度為0.4 mol/L、提取溫度為70℃、料液比為1:6（g/mL）、超聲功率為500 W、超聲時間為10 min，研究不同提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）對糖蛋白得率的影響。

1.3.4.3 提取溫度對糖蛋白得率的影響

在1.3.4.2試驗基礎(chǔ)上，固定NaCl濃度為0.4mol/L、提取時間為1.5 h、料液比為1:6（g/mL）、超聲功率為500 W、超聲時間為10 min，研究不同提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）對糖蛋白得率的影響。

1.3.4.4 料液比對糖蛋白得率的影響

在1.3.4.3試驗基礎(chǔ)上，固定NaCl濃度為0.4mol/L、提取時間為1.5 h、提取溫度為70℃、超聲功率為500 W、超聲時間為10 min，研究不同料液比[1:3、1:6、1:9、1:12、1:15（g/mL）]對糖蛋白得率的影響。

1.3.4.5 超聲功率對糖蛋白得率的影響

在1.3.4.4試驗基礎(chǔ)上，固定NaCl濃度為0.4mol/L、提取時間為1.5h、提取溫度為70℃、料液比為1:9（g/mL）、超聲時間為10 min，研究不同超聲功率（100、300、500、700、900 W）對糖蛋白得率的影響。

1.3.4.6 超聲時間對糖蛋白得率的影響

在1.3.4.5試驗基礎(chǔ)上，固定NaCl濃度為0.4mol/L、提取時間為1.5h、提取溫度為70℃、料液比為1:9（g/mL）、超聲功率為 500 W，研究不同超聲時間（10、15、20、25、30 min）對糖蛋白得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，以提取溫度（A）、料液比（B）、超聲功率（C）、超聲時間（D）為自變量，以糖蛋白得率（Y）為響應(yīng)值，使用軟件Design-Expert V8.0.6設(shè)計響應(yīng)面分析試驗，確定帶魚副產(chǎn)物糖蛋白的最佳工藝條件，自變量水平及其范圍如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平Table 1 Response surface test factor level

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert V8.0.6軟件進行響應(yīng)面分析，采用OriginPro 2019軟件進行圖形繪制，試驗平行測定3次，結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 帶魚副產(chǎn)物基本營養(yǎng)成分測定

帶魚副產(chǎn)物一般營養(yǎng)成分分析結(jié)果如表2所示。

表2 帶魚副產(chǎn)物的水分、蛋白質(zhì)、總糖、脂肪、灰分含量Table 2 Water，protein，total sugar，fat，and ash contents of byproducts from hairtail%

從表2中可以看出帶魚副產(chǎn)物水分含量較高，達到（75.16±0.34）%。蛋白質(zhì)含量較高，達到（14.12±0.02）%，說明帶魚副產(chǎn)物是較好的蛋白質(zhì)來源。總糖、脂肪、灰分含量分別達到（0.82±0.03）%、（6.86±0.07）%、（2.86±0.12）%。

2.2 單因素試驗

2.2.1 NaCl濃度對糖蛋白得率的影響

NaCl濃度對帶魚副產(chǎn)物糖蛋白得率的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 NaCl濃度對帶魚副產(chǎn)物糖蛋白得率的影響Fig.1 Effect of NaCl solubility on the yield of glycoprotein from hairtail by-products

由圖1可知，隨著NaCl濃度的增加，糖蛋白得率呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢。當NaCl濃度為0.4 mol/L時，糖蛋白得率達到最高，為7.30 mg/g，隨著NaCl濃度的增高糖蛋白得率有所下降，可能是因為由于鹽濃度過高，導致糖蛋白不易析出。故選擇0.4 mol/L的NaCl溶液作為帶魚加工副產(chǎn)物糖蛋白的提取溶劑。

2.2.2 提取時間對糖蛋白得率的影響

提取時間對帶魚副產(chǎn)物糖蛋白得率的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取時間對帶魚副產(chǎn)物糖蛋白得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of glycoprotein from hairtail by-products

由圖2可知，當浸提時間為0.5 h～1.5 h時，糖蛋白得率隨著提取時間的延長而提高，浸提時間達到1.5 h時，糖蛋白得率達到最高，為7.0 mg/g，糖蛋白得率在浸提1.5 h后有所下降，可能是由于浸提時間過長糖蛋白分解成小分子蛋白和糖，在后期提取處理中被除去，導致得率降低。故選擇1.5 h作為帶魚加工副產(chǎn)物糖蛋白的提取時間。

2.2.3 提取溫度對糖蛋白得率的影響

提取溫度對帶魚副產(chǎn)物糖蛋白得率的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取溫度對帶魚副產(chǎn)物糖蛋白得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of glycoprotein from hairtail by-products

由圖3可知，糖蛋白得率隨提取溫度的升高而逐漸提高，當溫度超過70℃時，糖蛋白得率增長趨于緩慢。考慮到溫度過高會使糖蛋白活性降低，選用70℃作為提取糖蛋白的提取溫度。

2.2.4 料液比對糖蛋白得率的影響

料液比對帶魚副產(chǎn)物糖蛋白得率的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 料液比對帶魚副產(chǎn)物糖蛋白得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the yield of glycoproteins from hairtail by-products

由圖4可知，當料液比為1:9（g/mL）時，糖蛋白得率最高達到9.10（mg/g），且糖蛋白得率隨溶劑體積的增大而呈緩慢下降趨勢，可能是由于溶劑體積過大導致原料細胞破碎不完全，糖蛋白溶出不充分，致使得率降低。故選擇料液比1:9（g/mL）作為帶魚加工副產(chǎn)物糖蛋白的提取料液比。

2.2.5 超聲功率對糖蛋白得率的影響

超聲功率對帶魚副產(chǎn)物糖蛋白得率的影響結(jié)果如圖5所示。

圖5 超聲功率對帶魚副產(chǎn)物糖蛋白得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the yield of glycoprotein from hairtail by-products

由圖5可知，隨著超聲功率的提高，糖蛋白的得率呈先上升后下降的趨勢，當超聲功率為100 W～500 W時，糖蛋白得率增加較快，當超聲功率超過500 W時，糖蛋白得率開始下降。可能是不同提取物有不同的適宜提取超聲功率范圍，超出其適宜范圍，超聲作用可能會使目標產(chǎn)物發(fā)生降解而影響其得率[23]。故選擇500 W作為提取帶魚加工副產(chǎn)物糖蛋白的超聲功率。

2.2.6 超聲時間對糖蛋白得率的影響

超聲時間對帶魚副產(chǎn)物糖蛋白得率的影響結(jié)果如圖6所示。

圖6 超聲時間對帶魚副產(chǎn)物糖蛋白得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on the yield of glycoprotein from hairtail by-products

由圖6可知，當超聲時間為25 min，糖蛋白得率達到最高，超過25 min后則降低。這說明在超聲的作用下，糖蛋白更易溶出，但長時間的超聲處理會引起糖蛋白糖苷鍵斷裂而發(fā)生降解，糖蛋白易變性，降低糖蛋白的得率[24]。故選擇25 min作為提取帶魚加工副產(chǎn)物糖蛋白的超聲時間。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

綜合單因素試驗的結(jié)果，選擇對糖蛋白得率影響較大的因素進行響應(yīng)面優(yōu)化。本試驗固定NaCl濃度和提取時間，選取提取溫度（A）、料液比（B）、超聲功率（C）、超聲時間（D）為因素，糖蛋白得率（Y）作為響應(yīng)值。根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，對試驗方案中29組試驗進行研究，得到的結(jié)果如表3所示。

表3 試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Experimental Design and Results

運用Design-Expert V8.0.6軟件對以上29組試驗響應(yīng)值進行回歸分析，經(jīng)回歸擬合后，得到糖蛋白得率（Y）標準回歸方程：Y=9.03+1.07A+0.35B-0.091C-0.015D+0.15AB+0.32AC-1.14AD+0.45BC-0.62BD+0.01CD-1.22A2-1.50B2-1.25C2-0.85D2。

2.3.1 回歸模型的方差分析

方差分析如表4所示。

在糖蛋白得率的響應(yīng)面二次模型方差分析中，模型模型P＜0.000 1，表明該模型具有極顯著性，失擬項P＞0.05不顯著，表明該模型的擬合效果較好。模型決定系數(shù) R2=0.781 2，修正相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.912 7，表明預測值和試驗值具有良好的相關(guān)性，可以應(yīng)用到理論預測。根據(jù)F值大小得出各因素對糖蛋白得率的影響主次順序為提取溫度＞料液比＞超聲時間＞超聲功率。在一次項中，A提取溫度和B料液比均達到極顯著水平，二次項A2、B2、C2和D2的影響均達到極顯著水平。

2.3.2 響應(yīng)面分析

利用軟件Design-Expert V8.0.6對表4的數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到相應(yīng)回歸方程的響應(yīng)面圖如圖7～圖12所示。

表4 糖蛋白得率的響應(yīng)面二次模型方差分析Table 4 Response surface quadratic model analysis of variance for glycoprotein yield

圖7 提取溫度與料液比的交互作用Fig.7 Interaction between extraction temperature and solid-liquid ratio

圖8 提取溫度與超聲功率的交互作用Fig.8 Interaction between extraction temperature and ultrasonic power

圖9 提取溫度與超聲時間的交互作用Fig.9 Interaction between extraction temperature and ultrasonic time

圖10 料液比與超聲功率的交互作用Fig.10 Interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic power

圖11 料液比與超聲時間的交互作用Fig.11 Interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic time

圖12 超聲功率與超聲時間的交互作用Fig.12 Interaction between ultrasonic power and ultrasonic time

因素對響應(yīng)值影響越顯著，響應(yīng)面圖曲面越陡峭[25]。由圖7～圖12可知，提取溫度和超聲時間、料液比和超聲時間之間交互作用的曲面圖較陡，說明這兩個交互作用項對糖蛋白得率的影響較顯著。

2.3.3 驗證試驗

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后，以糖蛋白得率為評價指標，確定其制備的最優(yōu)條件：提取溫度78.37℃，料液比1:10.01（g/mL），超聲功率525.32 W，超聲時間21.14 min，此時帶魚副產(chǎn)物糖蛋白得率為9.59 mg/g。根據(jù)實際情況調(diào)整后得到帶魚副產(chǎn)物糖蛋白的最優(yōu)制備條件：NaCl濃度0.4 mol/L，提取時間1.5 h，提取溫度78℃，料液比1:10（g/mL），超聲功率 525 W，超聲時間 21 min，采用上述優(yōu)化后的制備工藝條件進行重復試驗，測得的帶魚副產(chǎn)物糖蛋白得率為（9.20±0.20）mg/g。實際值與預測值的誤差在1%以內(nèi)，表明此預測模型可行。

3 結(jié)論

本文以帶魚副產(chǎn)物為原料，對超聲輔助鹽提法提取糖蛋白的工藝進行研究。采用單因素試驗和響應(yīng)面法確定了帶魚副產(chǎn)物糖蛋白提取的最優(yōu)工藝：NaCl濃度0.4 mol/L，提取時間1.5 h，提取溫度78℃，料液比1:10（g/mL），超聲功率 525 W，超聲時間 21 min，并且在此工藝條件下的帶魚副產(chǎn)物糖蛋白得率為（9.20±0.20）mg/g，得率的實際值與預測值無明顯差異。本文通過對帶魚副產(chǎn)物海洋資源的進一步利用，采用響應(yīng)面優(yōu)化提取得到帶魚副產(chǎn)物糖蛋白，為帶魚加工副產(chǎn)物糖蛋白的制備工藝優(yōu)化研究提供一定的理論基礎(chǔ)。