重組左聚糖蔗糖酶生產左聚糖工藝優化

梁文鳳，侯媛媛，郭曉磊，陳碩昌，朱萍，蒙健宗，楊輝 ，4*

（1.廣西大學 生命科學與技術學院，廣西 南寧 530004；2.亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004；3.邯鄲職業技術學院 食品與生物工程系，河北 邯鄲 056000；4.廣西微生物與酶工程技術研究中心，廣西 南寧 530004）

左聚糖是一類分子中含有大量茁-2，6-糖苷鍵連接的主鏈和少量茁-2，1-糖苷鍵連接的支鏈的多糖。其化學結構很穩定，固有黏度低，且有一定的溫度穩定性[1]。左聚糖具有抗菌抗病毒、降低血糖和膽固醇等功能[1]，保濕效果可以與透明質酸媲美，同時還具有美白的功能[2]。除此之外，文獻[3-5]研究表明，左聚糖對益生菌和復雜腸道中的微生物群有益。目前合成左聚糖的主要方法有化學合成法、微生物發酵法和酶合成法。相比而言，化學合成法實施過程很繁瑣[6]，微生物發酵法的左聚糖產量低，大約在14.4 g/L～41.7 g/L[7]，而酶合成法具有易控制、產量高、轉化率高等特點。因此，酶法合成制備左聚糖比較有優勢[8]。

左聚糖蔗糖酶屬于GH68水解家族中[9]的一員，具有水解和聚合雙重活性，不但可以水解蔗糖，還可以將果糖基聚合成左聚糖。廣西壯族自治區的蔗糖產量占全國總產量60%以上，但是蔗糖及其衍生產品種類較少，形成了糖業發展技術的瓶頸。據報道，廣西制糖業在2017年虧損11.41億元[10]。利用左聚糖蔗糖酶轉化蔗糖生產左聚糖，可提高產品的附加值，對蔗糖深加工及相關行業的發展具有重要意義。

已有研究表明，不同微生物來源的左聚糖蔗糖酶利用蔗糖合成左聚糖的效率及產量會有所不同。例如來自解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens H47）[11]、納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto CCT7712）[8]和嗜甲基芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus SK 21.002）[12]的左聚糖蔗糖酶分別可合成116、63.60 g/L和100 g/L左聚糖，蔗糖轉化率分別為38.67%、18.17%和33.33%。雖然有個別已報道的左聚糖蔗糖酶合成左聚糖可獲得較高的產量或較高的蔗糖轉化率，但其是在實驗室搖瓶小規模發酵產酶，再經過鎳柱親和層析純化后才進行生產左聚糖研究，例如來自羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri LTH5448）[13]和來自 Brenneria goodwinii[14]的重組左聚糖蔗糖酶可在500 g/L的蔗糖濃度中分別合成183 g/L和185 g/L的左聚糖，來自丙酮丁醇梭菌（Bacillus clostridium）[15]重組左聚糖蔗糖酶經過響應面優化，可在200 g/L的蔗糖濃度下得到94.88 g/L左聚糖。

迄今為止世界上只有美國、韓國和日本等少數國家實現了左聚糖量產[16]，在我國還沒有相關的報道，而且關于中試規模以上生產左聚糖蔗糖酶的研究還很缺乏。本實驗室前期已經在5 000 L發酵罐實現了中試生產大腸桿菌重組枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶[17]，為量產該重組左聚糖蔗糖酶提供了很好的基礎。目前關于重組枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶生產左聚糖的優化研究尚缺乏，并且大部分的優化研究只考慮蔗糖轉化率或左聚糖產量其中一個指標，但是實際中得到最高的蔗糖轉化率和左聚糖產量的條件往往不一致，需要綜合考慮。因此本文利用中試生產的酶進行合成左聚糖研究，并采用響應面法分析影響蔗糖轉化率和左聚糖產量各因素的相互作用，以期獲得高蔗糖轉化率和高左聚糖產量的工藝條件，為酶法生產左聚糖的規模應用提供理論指導和技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌重組枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶酶制劑[17]：廣西大學生命科學與技術學院自制；蔗糖（分析純）：天津博迪化工有限公司；無水乙醇（分析純）：成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平（SE402F）：美國OHAUS公司；數顯恒溫水浴鍋（DK-8D）：金壇市醫療儀器廠；數字式pH計（pHS-25）：上海日島科學儀器有限公司；酶標儀（M200 PRO）：瑞士 TECAN 公司；真空濃縮儀（AG5301）：德國EPPENDORF公司。

1.3 方法

1.3.1 重組左聚糖蔗糖酶水解活力測定

采用 3，5-二硝基水楊酸 （3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）顯色法[18]測定重組左聚糖蔗糖酶的水解活力。水解活力單位（U）定義：在最適的pH值和溫度條件下，1 min催化蔗糖轉化成1 μmol葡萄糖所需的左聚糖蔗糖酶的量為一個活力單位[19]。

1.3.2 重組左聚糖蔗糖酶聚合活力測定

稱量若干干燥潔凈、規格為2.0 mL EP管的質量并記錄，從反應結束的反應體系中取500 μL反應液于EP管中，再加入3倍體積無水乙醇終止反應，4℃靜置24 h，12 000 r/min離心20 min，棄上清液；用去離子水重懸沉淀，再加入3倍體積無水乙醇，4℃靜置24 h，10 000 r/min離心16 min，直至用DNS顯色法檢測上清液無還原糖殘留[20]。將所得到的左聚糖沉淀放入真空濃縮儀干燥至恒重，計算蔗糖轉化率和左聚糖產量，蔗糖轉化率定義為合成的左聚糖產量（g/L）與初始蔗糖（g/L）的百分比[17]，公式如下。

式中：500表示反應終止體積，滋L；10-6表示換算單位的倍數。

1.3.3 響應面試驗

根據實驗室單因素試驗結果[17]，選取對酶促反應影響顯著的3個因素：反應pH值、反應溫度和蔗糖質量濃度為試驗因素，分別以蔗糖轉化率和左聚糖產量為響應值，通過Design-Expert軟件設計三因素三水平Box-Behnken響應面試驗，如表1和表2所示。試驗過程中，反應時間和酶濃度分別為30 h和1.6 U/mL，每個試驗重復3次，結果取平均值。然后對蔗糖轉化率和左聚糖產量進行二次多元回歸方程擬合，得到各因素與響應值之間函數關系的回歸方程，根據試驗生成的響應曲面圖確定最優的酶促反應條件。

表1 以蔗糖轉化率為響應值的Box-Behnken設計因素及水平Table 1 Factors and coded levels in Box-Behnken design of conversion yield of sucrose

表2 以左聚糖產量為響應值的Box-Behnken設計因素及水平Table 2 Factors and coded levels in Box-Behnken design of levan yield

1.3.4 模型的驗證及放大體系試驗

利用響應面模型優化的最佳條件進行酶促反應，反應體系為100 mL，比較模型預測值與試驗值，驗證模型的有效性，每個試驗重復3次，數值表示為平均值±標準差。將反應體系從100 mL擴大到5 L，其他反應條件不變進行重組左聚糖蔗糖酶聚合反應，比較兩個體系的蔗糖轉化率和左聚糖產量以考察優化條件的適用性。

1.4 數據分析與處理

試驗重復3次，運用Design-Expert 10.0.7軟件進行響應面設計和方差分析，用Origin 2018軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 Box-Behnken響應面法優化蔗糖轉化率試驗結果

2.1.1 Box-Behnken響應面試驗結果

重組左聚糖蔗糖酶酶促反應條件Box-Behnken試驗優化結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 Box-Behnken試驗設計與結果Table 3 Experimental design scheme and results of Box-Behnken

表4 Box-Behnken試驗方差分析Table 4 Variance analysis of Box-Behnken experiment

利用Design-Expert軟件進行分析，蔗糖轉化率Y對反應pH值、反應溫度和蔗糖質量濃度的多元二次回歸方程：蔗糖轉化率=35.83-0.21A-1.13B+0.92C-0.11AB-0.02AC+0.52BC-1.19A2-3.94B2-1.8C2。

由表4可知，所選擇的回歸模型的P<0.01，表示整體模型對試驗結果具有極顯著影響，具有可信度。模型的失擬項P=0.220>0.05，差異不顯著，說明未知因素對試驗結果的影響不大，殘差主要由隨機誤差引起的，能較好地反映酶促反應過程中3個因素與蔗糖轉化率（Y）之間的準確關系，所以模型選擇適當。模型的R2為0.993，校正相關系數為0.984，信噪比32.933>4，表明各因素與蔗糖轉化率之間具有高度相關性，擬合程度良好，試驗誤差較小，可對蔗糖轉化率進行準確預測和分析。

在該模型中，一次項反應溫度B、蔗糖質量濃度C、二次項 A2、B2和 C2對結果的影響極顯著（P<0.01），交互項BC對結果影響顯著（P<0.05），其它項對結果影響不顯著（P>0.05）。根據F值可知，對蔗糖轉化率影響程度：B（F=94.167）＞C（F=62.866）＞A（F=3.228），即反應溫度＞蔗糖質量濃度＞反應pH值。

2.1.2 響應曲面圖

綜上所述，蔗糖轉化率回歸方程為酶法合成左聚糖轉化率的優化提供了一個合理模型，利用Design-Expert軟件繪制響應曲面圖，結果如圖1所示。

圖1 兩因素交互作用的響應曲面圖Fig.1 Response surface plot of the interaction of each two factors

根據圖1的響應曲面圖，可以看到曲面最高點都在響應面上，說明都有最佳值，3個因素的最佳水平在所選的范圍之內。各因素的交互作用可通過對應的響應曲面圖來判斷。反應溫度和蔗糖質量濃度的響應曲面較為陡峭，呈橢圓形，表示它們之間的交互作用顯著，蔗糖質量濃度和反應溫度分別達到310 g/L和25℃時，蔗糖轉化率與蔗糖質量濃度和反應溫度的升高呈正相關，但隨著這兩個變量的進一步升高，蔗糖轉化率下降。反應pH值和反應溫度、反應pH值和蔗糖質量濃度的響應曲面較為平緩，表示其交互作用較不顯著，在一定范圍內增加各變量的取值，蔗糖轉化率會隨之增加，但與蔗糖質量濃度和反應溫度的增加相比，增幅較小。

為進一步準確確定全局最優解，以最大化蔗糖轉化率為優化目標，根據Design-Expert軟件運行的結果，蔗糖轉化率在最佳工藝條件：反應pH值為6.46、反應溫度為24.37℃、蔗糖質量濃度為311.90 g/L，在此條件下模型預測的蔗糖轉化率達到最大值36.02%。為了驗證本模型的準確性，按照優化后的試驗條件，結合實際情況，進行模型的驗證。修正條件：反應pH 6.5，反應溫度24℃，底物濃度310 g/L，按照修正條件進行驗證試驗，所得蔗糖轉化率為（36.73±0.60）%。與模型預測結果基本吻合，誤差率僅為1.90%，表明該模型預測的結果符合實際情況，與試驗值具有良好的擬合性。同時，與未優化前相比，該工藝條件下蔗糖轉化率提高了約19%。

2.2 Box-Behnken響應面法優化左聚糖產量試驗結果

2.2.1 Box-Behnken響應面試驗結果

以左聚糖產量為響應值（Y）的Box-Behnken試驗結果見表5，方差分析結果如表6所示。

表5 Box-Behnken試驗設計與結果Table 5 Experimental design scheme and results of Box-Behnken

根據Design-Expert軟件分析結果可得，左聚糖產量Y對反應pH值、反應溫度和蔗糖質量濃度的多元二次回歸方程：左聚糖產量=136.96-3.59A+5.11B+1.35C+1.10AB-4.47AC+1.93BC-4.31A2-13.95B2-10.53C2。

由表6可知，3個因素對左聚糖產量影響最大的為反應溫度，其次為反應pH值。失擬項P=0.143>0.05，差異不顯著，模型的R2為0.972，校正相關系數為0.935，信噪比13.933>4，以上數據表明該模型的可信度很高，誤差較小，所以模型可用。在該模型中，一次項反應pH值A、反應溫度B、二次項B2和C2對結果的影響極顯著（P<0.01），AC和A2對結果影響顯著（P<0.05），其它項對結果影響不顯著（P>0.05）。根據F值可知，對左聚糖產量影響程度：B（F=26.234）＞A（F=12.945）＞C（F=1.839），即反應溫度＞反應 pH 值＞蔗糖質量濃度。

表6 Box-Behnken試驗方差分析Table 6 Variance analysis of Box-Behnken experiment

2.2.2 響應曲面圖

利用Design-Expert軟件對影響左聚糖產量的因素進行分析并繪制響應曲面圖，結果如圖2所示。

圖2 兩因素交互作用的響應曲面圖Fig.2 Response surface plot of the interaction of each two factors

根據圖2的響應曲面圖，可以看到曲面最高點都在響應曲面上，所以3個因素的最佳水平在所選的范圍之內，均存在最大值。反應pH值和反應溫度、反應pH值和蔗糖質量濃度、反應溫度和蔗糖質量濃度之間都有一定的交互作用。當反應pH值和蔗糖質量濃度分別達到6.3和410 g/L時，左聚糖產量隨著兩個變量的升高而升高，兩個變量進一步升高時，左聚糖產量急劇下降。且它們的響應曲面圖呈橢圓形，表明反應pH值和蔗糖質量濃度之間的交互作用顯著，對左聚糖產量的影響最大。其次為反應溫度和蔗糖質量濃度的交互作用，反應pH值和反應溫度的交互作用最不顯著。

根據Design-Expert軟件結果可知，左聚糖產量在反應pH值A、反應溫度B、蔗糖質量濃度C的共同影響下的最佳工藝條件：反應pH值為6.25、反應溫度為25.88℃、蔗糖質量濃度為409.20 g/L，在此條件下模型預測的左聚糖產量達到最大值，為138.42 g/L。為了驗證本模型的準確性，按照優化后的試驗條件，結合實際情況，進行模型的驗證。修正條件：反應pH6.3，反應溫度26℃，底物濃度410 g/L，按照修正條件在100 mL反應體系中進行驗證試驗，所得左聚糖產量為（138.59±2.90）g/L，與模型預測結果較接近，表明該模型具有良好的擬合性。同時，與未優化前相比，該工藝條件下左聚糖產量提高了約80%。

2.3 放大體系試驗

為考察酶法合成左聚糖所優化條件的適用性，將優化條件100 mL反應體系擴大到5 L后進行大批量反應，結果如圖3所示。

圖3 不同反應體積下左聚糖合成試驗Fig.3 Levan production under different reaction volumes

由圖3可知，5 L反應體系的蔗糖轉化率為（35.56±0.80）%、左聚糖產量為（130.15±3.30）g/L，與 100 mL反應體系結果相近。體現了酶法合成左聚糖的效果較為穩定，優化的工藝條件是合理的，為工廠大批量生產左聚糖提供了參考。

3 討論

響應面試驗結果表明，反應溫度對蔗糖轉化率和左聚糖產量均具有極其顯著的影響，由于重組左聚糖蔗糖酶是蛋白質，溫度對蛋白的活性影響比較大，溫度過高或過低都會使酶的活性遭到抑制，而且過高的溫度會使酶變性失活[1]，所以控制溫度在生產過程中具有極其重要的作用。本文研究的重組枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶的最適聚合溫度在25℃左右，分別為24℃和26℃，與相關學者[20]研究的枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶合成左聚糖溫度25℃相近。目前所報道的研究表明，來源不同的左聚糖蔗糖酶反應溫度差別比較大[21]。左聚糖蔗糖酶催化的反應不同，所對應的最適溫度也不同，例如來自Brenneria goodwinii的左聚糖蔗糖酶的最適聚合和水解溫度分別為35℃和45℃[14]，來自丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae pv）[22]的左聚糖蔗糖酶最適聚合和水解溫度分別為18℃和60℃。甚至有研究表明即使是來源相同的左聚糖蔗糖酶轉果糖基合成左聚糖的最適溫度也不一樣，來自Bacillus amyloliquefaciens胞內和胞外的左聚糖蔗糖酶的最適溫度分別為25℃～30℃和40℃，均低于最適水解溫度45℃～50℃和50℃[23]。

有研究發現，不同來源的左聚糖蔗糖酶合成左聚糖的產量會隨著蔗糖質量濃度的升高而有不同的趨勢。例如來自地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis 8-37-0-1）[24]、Bacillus amyloliquefaciens H47[11]的重組左聚糖蔗糖酶在蔗糖濃度超過一定濃度后（300 g/L左右）左聚糖產量開始降低，且Bacillus amyloliquefaciens H47重組左聚糖蔗糖酶在蔗糖質量濃度為600 g/L時轉化率降低到不足2%。但也有當蔗糖質量濃度達到一定程度后產量趨于穩定的情況，例如來自Bacillus methylotrophicus SK 21.002[12]的左聚糖蔗糖酶，合成左聚糖產量在蔗糖質量濃度為300 g/L時達到最高，隨后逐漸趨于穩定。本文響應面試驗結果表明蔗糖質量濃度對蔗糖轉化率的影響極顯著，當蔗糖質量濃度超過310g/L后，轉化率開始下降。Permatasari等[25]使用響應面法優化來自Bacillus licheniformis BK2的重組左聚糖蔗糖酶生產左聚糖時，發現蔗糖質量濃度對左聚糖產量的影響最大。由于左聚糖蔗糖酶擁有水解和聚合雙重活性，有研究發現當蔗糖質量濃度超過10%時，左聚糖蔗糖酶催化水解反應超過轉果糖基化反應[22]。而且反應體系的滲透壓和黏度隨著蔗糖質量濃度的增加而增加，會導致酶的活性遭到抑制[25]。此外，來源不同的左聚糖蔗糖酶合成左聚糖的能力差別比較大。雖然蔗糖轉化為左聚糖的理論轉化率約為50%[18]，但已有研究中的實際蔗糖轉化率一般在20%～40%左右。來自Bacillus licheniformis的左聚糖蔗糖酶的蔗糖轉化率較高，可到40%以上[7]，但是其最適底物濃度為100 g/L，實際產量僅為40 g/L左右，即該酶對底物的耐受性不高，限制了其生產應用。有些左聚糖蔗糖酶雖然可以在實驗室中得到比較高的轉化率，但產量不一定高，說明只看蔗糖轉化率是不能評價左聚糖蔗糖酶的應用價值的。本文采用中試發酵生產的重組枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶酶制劑可以在較高的底物濃度（300 g/L～400 g/L）下進行反應，說明其底物耐受性比較高。且經酶法合成左聚糖工藝優化，得到的蔗糖轉化率（36.73±0.60）%和左聚糖產量（138.59±2.90）g/L，在已有報道中處于較高水平，顯著高于來自Bacillus subtilis natto[8]的左聚糖蔗糖酶合成左聚糖的產量（63.60 g/L）和轉化率（18.17%）。本工藝在5 L酶促反應體系中能夠高效地生產左聚糖，顯示了其具有規模生產左聚糖的潛在應用價值。

4 結論

本文應用響應面法優化了大腸桿菌重組枯草芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶轉化蔗糖生產左聚糖的工藝條件。重組左聚糖蔗糖酶在310 g/L和410 g/L蔗糖質量濃度下反應分別得到最高的蔗糖轉化率和左聚糖產量，比優化前分別提高了約19%和80%。得到的回歸模型能較好地反映相應的轉化率和產量規律，為左聚糖生產提供了有效的理論支持。優化的工藝在5 L體系中能夠穩定高效地生產左聚糖，為進一步量產左聚糖研究提供了基礎，具有良好的應用潛力。