模擬酶解優(yōu)化鴿血紅蛋白抗氧化肽酶法制備

力俊琛，高昕悅，江晨怡，楊云順，賽買提·艾則孜，劉雅娜，巴吐爾·阿不力克木

（新疆農(nóng)業(yè)大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

血液是肉類工業(yè)中最主要的副產(chǎn)品，屠宰過程中產(chǎn)生的畜禽血液量大且資源豐富[1]。血液中含有高質(zhì)量的蛋白質(zhì)，濕基得率約為15%～18%，包括人體必需的氨基酸、維生素、無機鹽等[2-3]。目前部分的畜禽血液被遺棄造成環(huán)境污染，只有少部分被食用或藥用，如加工成血腸[4]、血豆腐[5]、血糕[6]、血布丁[7]或制備成酒[8]等。禽類血液含有部分酶類及活性肽等功能性物質(zhì)，可用作營養(yǎng)強化劑和增色劑等，有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用[1]。在中國，養(yǎng)殖肉鴿具有悠久的歷史，中國的肉鴿產(chǎn)業(yè)銷售量和飼養(yǎng)量都位居世界之首[9]。

近年的研究發(fā)現(xiàn)，許多從食物中的天然蛋白質(zhì)中提取的生物活性肽比化學合成的多肽更易吸收、更溫和且更安全[10-12]。因此，從動植物中提取的抗氧化肽得到了廣泛的研究，如植物源的大豆蛋白[13]、玉米蛋白[14]、水稻蛋白[15]，以及動物源的肌肉蛋白[16]、膠原蛋白[17]、雞蛋蛋白[18]等已用于制備生物活性肽。隨著自由基理論的提出，越來越多的研究表明活性氧的產(chǎn)生與機體的衰老有關，如超氧陰離子自由基（·O2-）、羥基自由基（·OH）等[12]。體內(nèi)過量的自由基可以通過攝入高活性的抗氧化劑清除。抗氧化肽是近年來被廣泛研究的一類天然生物活性肽，可通過提供還原力、清除自由基、螯合金屬離子、氧化損傷保護以及調(diào)節(jié)機體抗氧化酶活性等多種方式發(fā)揮抗氧化作用[19]。以畜禽血液（如牛血[20]、鴨血[21-22]）為原料制備抗氧化肽，原料易得，具有高附加值、高利用性等特點。酶解法是制備抗氧化肽的主要方法，較其他方法安全性高、條件溫和、專一性強、易于控制[23]。生物信息學工具是近年來抗氧化肽研究的一種新興方法，為抗氧化肽的預測、分析和篩選提供了一種經(jīng)濟有效的手段[19]。不同于耗時繁瑣且高成本的傳統(tǒng)方法，生物信息學的使用讓研究過程簡單、系統(tǒng)且可設計，具有十分廣泛的應用前景[24]。

本研究采用計算機模擬酶解和多步虛擬篩選的方法獲得酶解鴿血紅蛋白的最佳酶。在單因素試驗基礎上，通過響應面法優(yōu)化酶解條件制備鴿血紅蛋白源抗氧化肽，在為消費者提供容易消化吸收的抗氧化肽的同時，也為合理利用肉鴿屠宰加工過程中的副產(chǎn)品提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉鴿（檢疫合格）：市售，通過割喉放血的方式收集新鮮血液，通過紗布過濾后收集于含有5%肝素鈉的容器中。

肝素鈉注射液：江蘇省萬邦生化醫(yī)藥集團有限責任公司；蛋白酶K（20 mg/mL）：北京莊盟國際生物基因科技有限公司；DPPH自由基清除能力測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺 （sodium laurylsulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、彩虹180廣譜蛋白Marker（11 kDa～180 kDa）、牛血紅蛋白、牛血清白蛋白（97.0%）、絲氨酸（99.0%）、酪氨酸（99.0%）、福林酚、鄰苯二甲醛（98.0%，o-phthaldialdehyde，OPA）、二硫蘇糖醇（99.0%）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ME204E/02電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV1800紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器、FD-1A-50冷凍干燥機：上海豫明儀器有限公司；SF-GL-16A高速冷凍離心機：上海菲恰爾分析儀器有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；testo205 pH/溫度測量儀：德圖儀表（深圳）有限公司；DYCZ-24DN型電泳儀、DYY-7C型電泳儀電源：北京市六一儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 鴿血紅蛋粉的制備

參考王錚等[25]的方法并稍作修改。采集新鮮鴿血，通過紗布過濾后放入含有5%肝素鈉的容器中，4 000 r/min，離心15 min，吸走上清液，保留下層紅細胞，加入3倍的蒸餾水，超聲波清洗儀（40℃，200 W），處理20 min。4℃，10 000 r/min，離心10 min，得到上清液為鴿血紅蛋白溶液，沉淀為細胞膜及雜質(zhì)，冷凍干燥（-50℃）得到鴿血紅蛋白粉，放入超低溫冰箱（-20℃）保存。

1.3.2 鴿血紅蛋白的模擬酶解

采用數(shù)據(jù)庫UniProt（https：//www.uniprot.org/）獲得鴿血血紅蛋白一級結(jié)構(gòu)，選取鴿血血紅蛋白亞基α-A[（protein information resource，PIR）：JC5514]、鴿血血紅蛋白亞基α-D（PIR：JC5515）、鴿血血紅蛋白亞基β（PIR：A61432）作為抗氧化肽的原料蛋白，其氨基酸數(shù)分別為 142、140、146。采用 PeptideCutter 在線軟件（https：//web.expasy.org/peptide_cutter/） 進行胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）、 蛋白酶K（EC 3.4.21.62）、 胃蛋白酶（pH1.3，pH2，EC 3.4.23.1）、低特異性糜蛋白酶（C 端指FYWML，不在P之前，EC 3.4.21.1）以及高特異性糜蛋白酶（C端指FYW，不在P之前，EC 3.4.21.1）模擬酶解。

1.3.3 預測肽段的生物活性、水溶性、毒性和致敏性

整理模擬酶解鴿血紅蛋白獲得的所有肽段，通過在線軟件 Peptide Ranker（http：//distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）預測生物活性，篩選生物活性評分大于0.5，即有潛在生物活性的多肽。將有潛在生物活性的肽段通過Innovagen在線軟件（http：//www.innovagen.com/proteomics-tools）預測水溶性。通過ToxinPred在線 軟 件（https：//webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/design.php）預測其毒性。采用AllerTOP在線軟件（http：//www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/）預測肽段的致敏性。通過多輪篩選選取模擬酶解結(jié)果較優(yōu)的蛋白酶進行下一步研究。

1.3.4 鴿血紅蛋白的含量測定

參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》[26]，采用分光光度法，測定血紅蛋白含量。

1.3.5 蛋白酶活力測定

參照GB/T 34800—2017《蛋白酶K酶活力及雜質(zhì)檢測方法》[27]，采用分光光度法，測定蛋白酶活力。

1.3.6 蛋白水解度的測定

采用OPA法[28]測定蛋白水解度。

1.3.7 DPPH自由基清除率測定

參照DPPH自由基清除率測定試劑盒說明書測定DPPH自由基清除率。

1.3.8 單因素試驗設計

參考劉丹等[29]的方法并稍作修改。稱取一定量的鴿血紅蛋白粉配成水溶液。水浴鍋加熱至設定溫度，采用選定的蛋白酶進行酶解。到設定時間后，迅速放入沸水中保持10 min使酶失活，酶解液在4 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液待測。

1.3.8.1 酶解時間

固定鴿血紅蛋白濃度1 g/100 mL，pH8，酶添加量400 U/g，酶解溫度為60℃，設置不同的酶解時間為1、2、3、4、5 h，酶解后測定鴿血紅蛋白酶解物水解度和DPPH自由基清除率。

1.3.8.2 酶添加量

固定鴿血紅蛋白濃度1 g/100 mL，pH8，酶解溫度為60℃，酶解時間3 h，設置不同的酶添加量為240、320、400、480、560 U/g，酶解后測定鴿血紅蛋白酶解物水解度和DPPH自由基清除率。

1.3.8.3 酶解溫度

固定鴿血紅蛋白濃度1 g/100 mL，pH8，酶添加量400 U/g，酶解時間3 h，設置不同酶解溫度為40、50、60、70、80℃，酶解后測定鴿血紅蛋白酶解物水解度和DPPH自由基清除率。

1.3.9 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，設定響應值為DPPH自由基清除率，采用軟件Design Expert 8.0.6，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，通過三因素三水平響應面試驗，設計篩選出最優(yōu)的鴿血抗氧化肽酶解工藝。

表1 響應面試驗因素及水平編碼Table 1 Factors and level code of independent variables used for response surface test

1.3.10 SDS-PAGE凝膠電泳

配制15%分離膠和5%濃縮膠。濃縮膠80 V，50 min；分離膠 120 V，2.5 h。 電泳結(jié)束后，染色 1 h，用脫色液脫色至條帶清晰。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每項試驗均重復測定3次，采用SPSS 26.0進行數(shù)據(jù)分析，GraphPad 8.0.2進行制圖，Design Expert 8.0.6進行響應面設計及結(jié)果分析。

2 結(jié)果分析

2.1 模擬酶解結(jié)果

通過模擬酶解可知，胰蛋白酶酶解得到多肽41種，共計61條。使用蛋白酶K酶解得到多肽88種，共計312條。胃蛋白酶在pH1.3時酶解得到多肽63種，共計140條；在pH＞2時酶解得到多肽77種，共計170條。低特異性糜蛋白酶酶解得到多肽78種，共計147條。高特異性糜蛋白酶酶解得到多肽33種，共計49條。結(jié)果表明，蛋白酶K通過模擬酶解，得到的肽段數(shù)量和種類多于其他5種蛋白酶。

2.2 生物活性、水溶性、毒性和致敏性的預測結(jié)果

將模擬酶解獲得的882條肽段在Peptide Ranker程序中進行生物活性預測，篩選生物活性評分大于0.5的肽段，即為有潛在生物活性的肽段。預測分數(shù)大于0.5的肽段共88條。在此基礎上，對肽段進行水溶性、毒性以及致敏性的預測。

采用 Innovagen在線軟件（http：//www.innovagen.com/proteomics-tools）預測所收集得到活性肽的水溶性，胰蛋白酶酶解血紅蛋白亞基α-A產(chǎn)生的肽段Leu-Arg（LR）、Tyr-Arg（YR）和酶解血紅蛋白亞基 α-D產(chǎn)生的肽段YR水溶性好；蛋白酶K酶解血紅蛋白亞基 α-A 產(chǎn)生的肽段 Arg-Leu（RL）、Gly-Asp-Leu（GDL）、Asp-Lys-Phe（DKF），酶解血紅蛋白亞基 α-D產(chǎn)生的肽段 RL、DKF、Arg-His-Pro-Asp-Cys-Gly-Ala（RHPDCGA），酶解血紅蛋白亞基β產(chǎn)生的肽段RL、Gln-Arg-Phe（QRF）、Asp-Cys-Gly-Ala（DCGA）、Gly-Lys-Asp-Phe（GKDF）水溶性好；胃蛋白酶在pH1.3和pH＞2時酶解，結(jié)果均為血紅蛋白亞基β產(chǎn)生的肽段RL、Ala-Arg-Leu（ARL）水溶性好；低特異性糜蛋白酶酶解血紅蛋白亞基α-A產(chǎn)生的肽段DKF，酶解血紅蛋白亞基α-D產(chǎn)生的肽段DKF，酶解血紅蛋白亞基β產(chǎn) 生 的 肽 段 RL、ARL、Thr-Gln-Arg-Phe（TQRF）、GKDF水溶性好；高特異性糜蛋白酶酶解血紅蛋白亞基α-A產(chǎn)生的肽段Ala-Lys-Ile-Gly-Gly-Gln-Ala-Gly-Asp-Leu-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu-Glu-Arg-Leu-Phe（AKIGGQAGDLGGEALERLF），酶解血紅蛋白亞基α-D產(chǎn)生的肽段DKF、Glu-Lys-Val-Ile-Arg-His-Pro-Asp-Cys-Gly-Ala-Glu-Ala-Leu-Glu-Arg-Leu-Phe（EKVIRHPDCGAEALERLF），酶解血紅蛋白亞基β產(chǎn)生的肽段TQRF、GKDF水溶性好。將水溶性好的活性肽通過 ToxinPred在線軟件（https：//webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/design.php）預測其毒性，發(fā)現(xiàn)除肽段Arg-His-Pro-Asp-Cys-Gly-Ala（RHPDCGA）之外，其余肽段均無毒性。將無毒性的肽段通過AllerTOP在線軟件（http：//www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/）預測其致敏性，結(jié)果如表2所示，共有11條肽段水溶性好、無毒且非過敏原。

表2 虛擬篩選鴿血紅蛋白源多肽Table 2 Screening of peptides derived from pigeon hemoglobin in silico

通過模擬酶解試驗發(fā)現(xiàn)，使用蛋白酶K對鴿血血紅蛋白進行酶解，酶解位點最多，獲得的肽段數(shù)目較其他5種蛋白酶多，且得到的生物活性好、水溶性好、毒性低、致敏性低的肽段也較多。通過模擬酶解和虛擬篩選的方法，可優(yōu)化傳統(tǒng)的酶解方法，可以使篩選蛋白酶的過程更具有目的性。生物信息學工具的使用可以大大縮短試驗周期，同時也節(jié)省了試驗經(jīng)費，更經(jīng)濟、更直觀且目的性更強。綜上所述，選用蛋白酶K進行下一步研究。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 酶解時間

酶解時間對鴿血紅蛋白酶解物水解度和DPPH自由基清除率的影響如圖1所示。

由圖1可知，酶解時間為1 h～3 h時，鴿血紅蛋白酶解物的DPPH自由基清除率和水解度均呈現(xiàn)出增長趨勢，在3 h后稍有降低，3 h時達到頂點。這與徐楊林等[30]酶解制備苦杏仁醇溶蛋白抗氧化肽時的研究結(jié)果一致。可能原因為隨著酶解時間的增加，蛋白質(zhì)酶解生成的多肽含量增加，DPPH自由基清除率增加，繼續(xù)水解使蛋白質(zhì)的酶解程度增大，得到的多肽被酶解，成為游離氨基酸，導致多肽含量下降，抗氧化肽的含量也隨之下降。結(jié)合酶解的效率和成本分析，選擇酶解時間為3 h進行后續(xù)試驗。

圖1 酶解時間對鴿血紅蛋白酶解物水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of enzymolysis time on the hydrolysis degree and DPPH free radical scavenging rate

2.3.2 酶添加量

酶添加量對鴿血紅蛋白酶解物水解度和DPPH自由基清除率的影響如圖2所示。

圖2 酶添加量對鴿血紅蛋白酶解物水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on the hydrolysis degree and DPPH free radical scavenging rate

由圖2可知，酶添加量為240 U/g～400 U/g時，水解度與酶添加量成正比，超過400 U/g增長速度減緩，變化幅度較低。酶添加量為240 U/g～400 U/g時，DPPH自由基清除率與酶添加量成正比，在400 U/g時達到頂點，400 U/g后成反比。可能的原因是隨著酶添加量的增多，蛋白質(zhì)酶解程度增加，生成的多肽的數(shù)量也增加，水解度和DPPH自由基清除率呈現(xiàn)出增長的趨勢。DPPH自由基清除率達到頂點時，酶添加量相當于底物而言近似飽和，。酶添加量繼續(xù)增加，水解程度加大，一些具有抗氧化活性的多肽酶解，導致DPPH自由基清除率受到影響。這與孫敏[31]酶解乳清蛋白制備抗氧化肽的結(jié)論相似。結(jié)合試驗結(jié)果分析，選擇酶添加量為400 U/g進行后續(xù)試驗。

2.3.3 酶解溫度

酶解溫度對鴿血紅蛋白酶解物水解度和DPPH自由基清除率的影響如圖3所示。

圖3 酶解溫度對鴿血紅蛋白酶解物水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on the hydrolysis degree and DPPH free radical scavenging rate

由圖3可知，隨著酶解溫度的增加，酶解物的水解度和DPPH自由基清除率的趨勢均為先升高后下降，分別在70℃和60℃時達到頂點。推測可能原因為高溫導致蛋白酶的次級鍵斷裂，改變酶的結(jié)構(gòu)，使酶的活性降低，影響反應體系。結(jié)合上述情況綜合分析，選取酶解溫度為65℃進行下一步試驗。

2.4 響應面試驗結(jié)果

由軟件Design-Expert 8.0.6進行響應面分析，結(jié)果如表3所示，回歸方程方差分析如表4所示。

表3 響應面試驗結(jié)果Table 3 Results for response surface test

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation

如表4所示，DPPH自由基清除率二次多項回歸模型方程為Y=32.77-0.18A+0.19B+1.3C-1.72AB+1.58AC+1.10BC-4.42A2-1.9B2-2.36C2。對此模型進行方差分析，模型 p＜0.01，表示為極顯著；失擬項 p=0.074 9＞0.05，表示為不顯著，該模型建模成功。模型的回歸系數(shù)為R2=0.948 6，表明該模型擬合程度較好，具有統(tǒng)計學意義，可用于模擬鴿血紅蛋白制備抗氧化肽的最優(yōu)工藝。對DPPH自由基清除率影響順序為C＞B＞A，即酶添加量＞酶解時間＞酶解溫度。模型中一次項C，交互項AB、AC，二次項 A2、B2、C2對試驗結(jié)果影響顯著（p＜0.05或 p＜0.01）。

2.5 響應面交互作用分析

響應面交互作用結(jié)果如圖4～圖6所示。

圖4 酶解時間與酶解溫度的交互作用Fig.4 Interaction between enzymolysis time and enzymolysis temperature

圖5 酶添加量與酶解溫度的交互作用Fig.5 Interaction between enzyme addition and enzymolysis temperature

圖6 酶添加量與酶解時間的交互作用Fig.6 Interaction between enzyme addition and enzymolysis time

各個因素交互作用時響應值發(fā)生變化，形成立體的空間曲面，響應面可較為直觀的反應兩因素間交互作用是否明顯。三維圖中的曲面傾斜度越大，表現(xiàn)在二維圖中的顏色越深，圖形越近似橢圓，等高線之間的距離也越近，說明兩因素間的交互作用越明顯，反之則交互作用不顯著[33]。由圖4～圖6可知，酶添加量與酶解時間（BC）的交互作用與其他2組相比更弱。

2.6 響應面驗證試驗

通過分析響應面試驗結(jié)果，得到鴿血紅蛋白制備抗氧化肽的最優(yōu)工藝條件為鴿血紅蛋白濃度1 g/100 mL、pH8、酶解時間3.07 h、酶解溫度65.04℃、酶添加量415.54 U/g，DPPH自由基清除率的預測值為32.99%。結(jié)合實際操作，將此條件修訂為鴿血紅蛋白濃度1 g/100 mL、酶解時間3 h、酶解溫度65℃、pH8、酶添加量415.54 U/g，在該條件下進行響應面驗證試驗，實際測得DPPH自由基清除率為（33.21±0.68）%，接近于預測值，表明該模型可較好地反映各因素與響應值之間的關系。

2.7 SDS-PAGE凝膠電泳試驗結(jié)果

SDS-PAGE凝膠電泳試驗結(jié)果如圖7所示。

圖7 鴿血紅蛋白酶解前后SDS-PAGE圖譜Fig.7 SDS-PAGE map of pigeon hemoglobin before and after enzymolysis

將最優(yōu)工藝酶解后的鴿血紅蛋白酶解液與酶解前的鴿血紅蛋白溶液做對比。由圖7可以清晰的看出鴿血紅蛋白酶解前后的條帶量和分子量分布，泳道2的條帶數(shù)目明顯少于泳道3，目的條帶消失。說明在最優(yōu)工藝條件下，蛋白酶K能夠很好的對鴿血紅蛋白進行酶解，使最優(yōu)工藝條件得到了進一步的驗證。

3 結(jié)論

本研究通過計算機模擬酶解結(jié)合傳統(tǒng)酶解方法制備鴿血紅蛋白抗氧化肽。通過模擬酶解和虛擬篩選，結(jié)果顯示選用蛋白酶K可以得到更多種類和更多數(shù)量的小分子肽，故而選取蛋白酶K為最佳蛋白酶。試驗結(jié)果表明，鴿血紅蛋白酶解物具有一定的抗氧化活性，在單因素試驗的基礎上進行響應面優(yōu)化試驗，探究酶解時間、酶添加量和酶解溫度對鴿血紅蛋白酶解物DPPH自由基清除率的影響，最終得到的最優(yōu)工藝條件為鴿血紅蛋白濃度1 g/100 mL、pH8、酶解時間3 h、酶添加量415.54 U/g、酶解溫度65℃。在此條件下，通過驗證試驗得出響應值DPPH自由基清除率（33.21±0.68）%，與預測值相差較小，證明此條件為最優(yōu)工藝。采用SDS-PAGE凝膠電泳試驗，對比最優(yōu)工藝條件下鴿血紅蛋白酶解前后的情況，發(fā)現(xiàn)目的條帶消失，進一步驗證該方法為酶解鴿血紅蛋白源抗氧化肽的最優(yōu)工藝，本研究結(jié)果可以為合理利用鴿屠宰加工過程中的副產(chǎn)品提供一定的參考。