HS-SBSE-GC/MS結合ROAV法分析六堡茶關鍵香氣成分

梁劍鋒，李亞*，賓月景，奚廣生，陳金輝，梁燕妮，蔣德莉，黃麗銘

（1.梧州學院食品與制藥工程學院（六堡茶現代產業學院），廣西 梧州 543002；2.廣西六堡茶產業科研人才小高地，廣西 梧州 543002；3.梧州市食品藥品檢驗所，廣西 梧州 543002）

六堡茶是具有1 500多年歷史廣西名茶、邊銷茶，原產于廣西梧州六堡鎮，以“紅、濃、陳、醇”獨特品質深受全國及東南亞國家消費者喜愛[1-3]。六堡茶主要采用蒼梧群體種鮮葉為原料，經過特殊的冷水渥堆發酵、陳化工藝，形成具有黑茶特殊風味和滋味；其中六堡茶“陳”是指其香氣，為影響消費者選擇的重要因素，六堡茶除了陳香外還有參香、檳榔香、蜜香、棗香、馥郁香等16種香型[4-5]。茶葉香型其實是大量香氣化合物相互影響并被人體嗅覺系統識別而成的，目前對于食品類香氣成分提取、檢測方法包括頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術（headspace solid phase microextraction-gas chromatograph-mass spectrometer，HSSPME-GC-MS）[6]、頂空攪拌子吸附萃取氣質聯用技術（headspace stir bar sorptive extraction-gas chromatograph-mass spectrometer，HS-SBSE-GC-MS）[7]、二維氣相色譜-質譜（飛行時間）聯用技術[8]、氣相色譜-嗅覺測量技術（gas chromatography olfactometry，GC-O）[9]、電子鼻技術[10]等；茶葉中關鍵香氣成分鑒定方法包括香氣活性值（odor activity value，OAV）[11]、相對香氣活性值（relative odor activity value，ROAV）[12]和正交偏最小二乘判別分析法（orthogonal projections to latent structures discriminant analysis，OPLS-DA）[13]等。 相關學者利用上述分析手段鑒定黑茶類茶葉的香氣主要成分有芳樟醇、雪松醇、萜品醇、1，2，3-三甲氧基苯、苯甲醛、1-甲基萘、二氫獼猴桃內酯等50余種[14-16]，溫立香等[17]研究認為α-雪松醇、β-芳樟醇、二氫獼猴桃內酯、α-萜品醇和β-紫羅酮等是陳香六堡茶特征香氣成分；黃林杰等[18]研究發現檳榔香型六堡茶關鍵香氣成分為雪松醇、芳樟醇、水楊酸甲酯、苯甲酸甲酯等。

現代六堡茶廠茶生產工藝中六堡茶出香順序為菌香、棗香、參香、木香、藥香，其中棗香、參香為是采用輕發酵工藝則可以出香型，而菌香、木香為采用重發酵工藝出香型。參香六堡茶，為經過陳化10年以上六堡茶出類似中藥材西洋參的特征香氣，滋味特點是具有很甘甜口感；棗香六堡茶主要是紅棗香氣，其屬于花果香類別較容易區分，紅棗香為六堡茶熟茶所特有，香氣特征是甜而帶有紅棗氣味，紅新發酵的半成品香味較為清淡，隨著產品經過長期陳化后紅棗香逐漸凸顯。在目前六堡茶市場上具有顯著參香、棗香的六堡茶比較受到消費者喜愛，但缺少相關特征香氣成分及具體明確的生產工藝的研究。

本試驗在企業陳化倉庫中抽取相同工藝與陳化環境、不同陳化時間生產參香、棗香香氣六堡茶各5批次樣品，先采用感官審評方法篩選出參、棗香香氣最顯著樣品，然后采用攪拌子吸附萃取技術對樣品進行香氣成分提取，再采用氣質聯用儀進行關鍵成分檢測分析，鑒定各香型六堡茶中主要香氣化合物名稱及相對平均含量，最后各類香氣化合物根據其相應香氣閾值計算各自相對香氣活性值，明確對六堡茶影響形成香型關鍵香氣成分。本文旨在探索研究影響六堡茶香型的關鍵香氣成分，為明確各類香型六堡茶鑒定與量化、品質控制提升、生產加工工藝研究提供理論數據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

六堡茶樣品：在企業陳化倉庫中選取不同陳化時間（10年～20年）參香、棗香香氣顯著六堡茶各5份；茶樣采用自封袋陰涼避光、密閉保存待用。癸酸乙酯、正構烷烴（C6-C30）（色譜純，純度＞98%）:上海 Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

GC7890B-5977B氣相色譜-質譜儀聯用儀（含DB-Wax氣相色譜柱）：美國Agilent公司；GERSTE磁力攪拌棒：德國哲斯泰公司；TD100熱脫附系統：英國瑪珂思公司；手動固相微萃取進樣器（含PDMS57348-U萃取頭）：美國安耐普公司；HH-M4恒溫水浴鍋：上海赫田儀器公司；HX 7000超純水發生器：美國默克公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品感官審評

參考國家標準GB/T 32719.4—2016《黑茶第4部分：六堡茶》中感官評價方法，由高級評茶員組成5人審評小組，對10批次樣品進行密碼評審并記錄香型評語及打分，選出打分在85分以上且參香、棗香顯著的六堡茶樣品各一份，進行香氣成分提取及成分分析。

1.3.2 樣品香氣提取

先取六堡茶樣品2.00 g置于50 mL萃取瓶中，然后加入8.00 mL 100℃的超純水攪拌均勻，然后將萃取瓶置于60℃恒溫水浴鍋中保溫10 min，插入提取的攪拌萃取吸附子（提前老化1.5 h），頂空吸附60 min，取出吸附子立即放入脫附管。

1.3.3 香氣成分測定

先將吸附子進行在熱脫附系統熱脫附香氣后進樣（一級熱脫附280℃、10 min；二級熱脫附300℃、5 min）。樣品香氣成分采用氣質聯用技術進行測定，色譜條件：進樣口溫度240℃，起始柱溫50℃，保持5 min；先以1.5℃/min上升至170℃，再以10℃/min上升至210℃保持20 min。質譜條件：離子源為電子轟擊（electron impaction，EI）；離子源溫度為 230℃，采集模式為全掃描，掃描質量范圍50.00 aum～650.00 aum。

1.3.4 試驗數據處理與關鍵香氣成分

采用氣相色譜-質譜聯用儀聯合分析樣品得到色譜圖，通過計算機與NIST17質譜庫進行檢索與匹配，結合化合物的保留時間、匹配度等參數香氣成分進行鑒別；香氣各組分相對含量（Ci）采用各色譜峰面積與總峰面積比值的面積歸一計算；計算出各香氣組分相對含量后，根據化合物在水中香氣閾值（Ti），由下式計算出各香氣成分ROAV值，其中ROAV值大于等于1的化合物，為對樣品香型起到決定性作用的關鍵香氣成分，而ROAV值小于1的化合物，則為對樣品香型起到修飾性作用的香氣成分[19]。

式中：Cmax為對樣品香型貢獻最大組分的相對含量，%；Tmax為對樣品香型貢獻最大組分在水中的香氣閾值，μg/L；Ci為樣品經過攪拌子萃取出來的各香氣組分平均相對含量，%；Ti為各香氣組分在水中的香氣閾值，μg/L。

2 結果與分析

2.1 參香、棗香六堡茶主要香氣成分分析

2.1.1 香氣成分分析

經過感官審評分別具有參香（陳化時間10年）、棗香（陳化時間15年）顯著六堡茶樣品2份，其香氣具體各香氣組分如表1所示。

表1 兩種香型六堡茶香氣成分組成及相對含量Table 1 Composition and relative content of aroma components in two types of Liupao tea

續表1 兩種香型六堡茶香氣成分組成及相對含量Continue table 1 Composition and relative content of aroma components in two types of Liupao tea

試驗采用攪拌子吸附萃取氣質聯用技術，共從樣品中鑒定出七大類共51種香氣化合物。由表1可知，兩種香型六堡茶香氣成分主要以醇類揮發性化合物為主，其相對含量約占到總香氣成分的三分之一左右；兩種香型六堡茶香氣成分在烷烴類、醇類、醛類、雜氧化合物4類化合物相對平均含量相差不大，但在酮類、烯類、脂類3類化合物含量相差較大，特別是參香六堡香氣成分中烯類化合物是棗香六堡茶的28倍，香氣成分中氧化芳樟醇、芳樟醇、萜品醇、萜烯醇4種化合物相對平均含量超過總含量四分之一，為六堡茶香氣的主要組成成分。茶葉香氣中的醇類化合物通常具有花香、果香等香氣，可以對茶葉香型形成具有較好的修飾、協調作用，比如芳樟醇類化合物具有強烈木香、花香和果香氣息，芳樟醇氧化物化合物還有帶有樟腦的氣息，1-辛烯-3-醇化合物具有果香和木香氣息，醇類香氣化合物不但可以使香氣具有濃郁、韻味持久的特點，同時還可以使茶湯產生滋味純厚、鮮爽、回甘好的口感[20]；茶葉香氣成分中醛類、酮類化合物通常具有花果香和清香；而甲氧基芳香烴類分化合物則是黑茶在陳化貯藏中形成特殊香氣成分，比如1，2-二甲氧基苯、1，2，4-三甲氧基苯、1，2，3，4-四甲氧基苯等化合物具有黑茶陳香特征氣息，是六堡茶中“陳”的特殊風味主要貢獻化合物，六堡茶中甲氧基芳香種類與相對含量隨著陳化時間延長而不同[21]；茶葉香氣成分中不飽和烴類化合物較飽和烴類化合物貢獻比較大[22]。

雖然可以通過攪拌子萃取-氣相色譜/質譜聯用技術對參香、棗香顯著的兩個六堡茶樣品進行香氣成分及各相對平均含量測定，但是各香氣成分對六堡茶香型的貢獻大小卻與其相對含量無直接關系，所以需要采用科學方法對其進行分析并評價出影響茶葉香型的關鍵香氣成分。

2.1.2 關鍵香氣成分ROAV分析

根據食品中相關香氣研究發現，現在已發現的一萬余種香氣成分中，僅有一小部分化合物對食品中香氣及風味起到關鍵決定作用，所以這一部分化合物也稱關鍵香氣成分[23]；食物的香氣并不是簡單直接與香氣化合物相對含量高低相關，需要根據香氣化合物相對應的ROAV值進行分析和鑒定，根據以上研究基礎，參考相關文獻各類化合物在水中的香氣閾值[24]，計算兩種香型六堡茶中香氣ROAV值如表2、表3所示。

表2 參香六堡茶中主要香氣成分Table 2 List of main aroma components in Shenxiang Liupao tea

表3 棗香六堡茶中主要香氣成分Table 3 List of main aroma components in Zaoxiang Liupao tea

通過表2、3的ROAV值可以發現，參香、棗香六堡茶分別鑒定出13種和15種關鍵香氣成分（ROAV值大于1）。β-紫羅酮水中香氣閾值較低，具有甘甜醇厚的花香，是兩種香型六堡茶ROAV最大香氣成分，而紫羅酮類香氣化合物具有明顯木香香氣特征，可以進一步氧化成二氫?？麅弱?、茶螺烯酮等香氣化合物，有研究認為其為黑茶香型主要貢獻香氣成分[25-26]。水楊酸甲酯為棗香型六堡茶獨有香氣成分，其具有與冬青葉相類似的薄荷香味，有研究發現水楊酸甲酯在一般在茶葉鮮葉或者綠茶中含量較高[27]。α-雪松醇是具有陳香、木香的香氣成分，其在參香六堡茶中香氣貢獻作用大約是棗香六堡茶3倍，有學者認為α-雪松醇是黑茶類在陳化過程中產生的特有的香氣成分[28-29]；在兩個香型六堡茶樣品中檢測出多種含氧芳香烴類關鍵香氣化合物，氧芳香烴類化合物一般具有陳味、霉味，被認為是黑茶在陳味產生主要香氣成分，具有隨著陳化發酵時間增加其在香氣成分占比隨著增加趨勢[30-31]。芳樟醇又稱為沉香醇，芳樟醇和橙花叔醇是決定茶葉花甜香的關鍵物質，芳樟醇在兩種香型六堡茶中香氣的ROAV值在1.2左右，說明其對六堡茶香型基本起到修飾作用；楊麗容等[32]研究發現老樹茶香氣成分中醇類化合物占70%以上，并且芳樟醇及其氧化物含量遠高于其他化合物，因此認為芳樟醇及其氧化物是可以作為決定茶葉品質關鍵香氣物質。

在六堡茶毛茶制作完成后進入了渥堆、陳化后發酵的階段，在這階段茶葉的內含物質通過微生物發酵過程中分泌胞外酶的酶促作用、微生物呼吸發酵產生的熱量和六堡茶水分濕熱作用等共同影響下生成新風味化合物，六堡茶的特殊香氣成分也是在此階段生成并不斷變化，其由各自不同香氣成分綜合表現出來的香型也隨著陳化時間產生變化：三年左右的六堡茶多呈現陳香，類似于荷香、樟香、蘭香等，五年左右的六堡茶逐漸出現香氣下沉趨勢，呈現出栗香、木香、檳榔香，十年左右則會轉化出參香、果糖香，超過十年甚至會轉化出淡淡的棗香、蜜香，而六堡茶最終呈現出的香型也會受茶葉品質、存儲條件的影響。六堡茶經過后發酵過程形成的各類陳香、參香、棗香香型，其實就是各種關鍵香氣成分的改變后綜合作用的結果。

3 結論

本文先通過感官評審篩選出兩種參香、棗香顯著的六堡茶樣品，然后采用頂空攪拌子萃取-氣相色譜/質譜聯用技術對樣品進行揮發性香氣成分檢測，試驗從共鑒別出芳香烴、醇、酮、醛、烯、酯、雜氧化合物七大類共51種香氣化合物，借鑒ROAV法從中鑒別出參香六堡茶13種、棗香六堡茶15種關鍵香氣成分化合物。試驗為科學鑒定、評價六堡茶各類香型提供關鍵香氣成分數據，為研究不同香型六堡茶生產工藝及相關標準提供數據基礎。