pH 值對水產品中硝基呋喃類代謝物提取效率的影響

王雨琪 ，張靜波 ，陸悅 ，張敏 ，黃強 *

（1.南通市水產品質量檢測中心，江蘇 南通 226000；2.南通市農產品質量檢驗測試中心，江蘇 南通 226000）

硝基呋喃類抗生素是人工合成的具有5-硝基結構的抗生素。因價格低廉，廣泛應用于畜禽及水產養殖業[1-3]。治療由大腸桿菌或沙門氏菌所引起的腸炎、疥瘡、赤鰭病和潰瘍病等。由于硝基呋喃類藥物及其代謝物具有毒性，可引起嘔吐和腹瀉，長時間大劑量使用可致突變、致畸和致癌[4]，2002 年4 月，原農業部第193 號公告將硝基呋喃類抗菌劑列入《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》[5]。因硝基呋喃類藥物的自身代謝特性和代謝物結構特殊性，需對其進行水解衍生化后的衍生物進行檢測定量。目前實驗室常用的檢測手段有液液萃取液相色譜法、固相萃取液相色譜法和高效液相色譜串聯質譜法等。其中高效液相色譜串聯質譜法以快速、準確、靈敏度高的特性，廣泛應用于硝基呋喃類代謝物的定量測定。標準方法中，樣品前處理方法復雜，步驟煩瑣，反應條件對pH 值要求較高，實際操作中多有不便。且動物源性食品種類多、范圍廣，例行抽檢和風險監測量大，耗時多。現通過對水解衍生條件和萃取條件pH 值進行優化，可節約試驗成本，提高前處理效率，縮短大批量樣品的檢測時間。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、2-硝基苯甲醛、醋酸銨、乙酸乙酯、正己烷、二甲基亞砜均為色譜純；磷酸氫二鉀、濃鹽酸（36%～38%）、氫氧化鈉等均為分析純；標準工作溶液：4 種硝基呋喃類代謝物，包括呋喃唑酮的代謝物3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、呋喃它酮的代謝物5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、呋喃西林的代謝物氨基脲（SEM）及呋喃妥因的代謝物 1-氨基-2-內酰脲（AHD）（純度＞99%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司）。使用前根據檢測要求，用流動相稀釋配制成20 mg/L 的混標工作溶液，所使用的內標分別為4 種硝基呋喃代謝物同位素內標，使用前用甲醇作溶劑配制成濃度為200 mg/L的混標溶液。

1.2 儀器

液相色譜系統（Agilent Technologies 1290）；串聯質譜（Agilent Technologies 6470 Triple Quad LC/MS）；色譜柱（Agilent Eclipse Plus C18 2.1mm×50 mm，1.8 μm），酸度計，氮吹儀，高速離心機，恒溫水浴鍋等。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

分別準確稱取2 g（精確到0.01 g）草魚樣品（可食用部位）15 份，于 50 mL 離心管中，加入 250 μL內標混合液、5 mL 0.07 mol/L 鹽酸溶液和150 μL 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋1 min，置于恒溫振蕩器中，37 ℃避光振蕩16 h。

反應完成后，取出離心管并冷卻至室溫，再加入不同體積的磷酸二氫鉀緩沖液和氫氧化鈉溶液,將衍生化后的樣品分為5 個梯度濃度，每個濃度范圍平行樣本 3 個，分別調節 pH 值至 3～5，6～7，7.5，8～10，11～12，之后再加入 8 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻1 min，5 000 r/min 離心5 min。取上層乙酸乙酯到15 mL 離心管中，在40 ℃水浴條件下氮吹至近干，加入1 mL 5%甲醇水溶液將其復溶，渦旋振蕩1 min，再加入5 mL 正己烷，渦旋振蕩30 s，5 000 r/min離心5 min。過0.22 μm 濾膜后上機測定。標準系列溶液也按樣品前處理方法，進行同樣的衍生化和提取過程。

1.3.2 色譜條件設定

流動相A 相為5 mmol/L 醋酸銨溶液（含0.1%甲酸）；B 相為甲醇。梯度洗脫程序為：在0～1.0 min內，B 相由 10%提升為 20%；在 1.0～5.0 min 內，B 相由 20%提升為 100%；在 5.0～6.0 min 內，B 相維持在100%；在6.0～6.1 min 內，B 相由100%降至10%。整個梯度洗脫程序中的流量為0.4 mL/min，柱溫40 ℃，進樣體積 10 μL。

1.3.3 質譜條件設定

質譜采用電噴霧 ESI（+）的方式，噴霧電壓4 000 V，碰撞氣體為高純氮氣；鞘氣溫度：370 ℃，氣流量12 L/min；霧化氣：0.24 MPa，4 種硝基呋喃類代謝物質譜條件詳見表1。

表1 4 種代謝物質譜條件

2 結果與分析

2.1 衍生化條件的優選及分析

研究表明[6]，硝基呋喃類藥物能迅速代謝水解，半衰期為0.5 h 到1 h 不等。水解后，這些代謝物能在肉源性組織中殘留很長一段時間，并與蛋白質形成穩定的蛋白質結合物[7]。在實驗室處理的過程中，通過加入鹽酸、三氯乙酸等酸性試劑，使硝基呋喃類代謝物與蛋白的結合物在酸性條件下，水解成游離態的代謝物，其相對分子質量為75～244。由于小分子不易產生具有典型特征的離子碎片，ESI 離子模式背景噪聲高，直接檢測靈敏度較低，因此，對代謝物進行衍生化處理。衍生試劑2-硝基苯甲醛的分子結構中具有一個醛基（-CHO），在酸性條件下，-CHO 可與硝基呋喃代謝物的含氮親和基團氨基（-NH）發生醛胺親核加成反應，形成較好的特性衍生物，代謝過程見圖1[8]。經衍生后，分子離子質荷比均＞200，處于相對適于檢測的質量區域。

水產動物死亡后，血液循環停止，溶解氧含量降低，肌肉中的糖原因缺氧發生糖酵解，生成乳酸，導致肌肉的pH 值從約7.4 下降至6.0 以下[9]。而在儲存過程中，隨著時間的推移，蛋白酶和一些堿性細菌分解水產品中的蛋白質，并產生堿性化合物（氨類化合物和三甲胺等），使水產品肌肉中的pH值逐漸增加[10-12]。鹽酸具有強酸性，能將水產品中硝基呋喃類代謝物從蛋白中解離出來，且價格低廉，較易獲得，考慮到實驗室批量處理樣本和水產品儲藏的特點，選取鹽酸為衍生化反應提供酸性條件，在樣品處理時加入5 mL 0.07 mol/L 的鹽酸溶液。

2.2 萃取pH 值對回收率和離子信號強度的影響

2.2.1 對回收率的影響

不同pH 值下4 種代謝物的回收率見圖2（a）（b）（c）（d）。硝基呋喃類代謝物在酸性條件下完成衍生化反應后，試樣溶液的pH 值對提取和凈化效率有較大影響。通過酸度計測定，衍生化后的液體pH 值2.0～3.0，通過加入不同體積的1 mol/L KHSO4和 0.5 mol/L NaOH 溶液，將 pH 值調至 3.0～5.0，6.0～7.0，7.5，8.0～10.0 和 11.0～12.0，進行前處理。結果發現，當 pH 值＜6.0 時，AMOZ 的回收率偏高，誤差較大；pH 值為 6.0～10.0 時，4 種代謝物的萃取效率較為穩定，萃取情況更符合實際添加情況；當pH 值＞10.0 時，AHD 無法從水相萃取至乙酸乙酯層中，影響后續的測定。當 pH 值為 6.0～7.0 時，AMOZ 和 AOZ 的的萃取效率最高，其中AMOZ 為98.31%，AOZ 為99.14%；當 pH 值為 7.5 時，AHD和SEM 的萃取效率最高，其中AHD 為100.73%，SEM 為97.92%。綜合來看，AMOZ 和AHD 對pH 值的敏感度相對較高，AOZ 和 SEM 對 pH 值的敏感度相對較低，pH 值為6.0～10.0 時，4 種代謝物的回收率較好。

圖2 不同pH 值下4 種代謝物的回收率

2.2.2 對離子信號強度的影響

不同pH 值下4 種代謝物的離子信號強度見圖3（a）（b）（c）（d）。由圖 3 可見，AMOZ 在 pH 值為3.0～5.0 時響應值最低，相比較高pH 值條件下的離子強度，信號為 3×104，這也解釋了 AMOZ 在該 pH 值時，回收率和真實添加情況的誤差較大；隨著pH值升高，響應程度逐漸升高，pH 值為6.0～12.0 時，響應程度受pH 值影響較小。AHD 隨著pH 值的升高響應值逐漸降低，當pH 值＞8.0 時，響應信號在100 左右；當pH 值＞10.0 時，無法在萃取液中檢測出AHD。AOZ 和SEM 的響應情況受pH 值變化影響較小，但整體在弱堿性的萃取條件下，響應值最高。綜合看來，在 pH 值為 6.0～7.5 時，4 種代謝物的離子信號強度較高，數據誤差較小。

圖3 不同pH 值下4 種代謝物的離子信號強度

2.3 精密度、重復性和回收率

取4 種硝基呋喃類代謝物標準品混合溶液，按照1.00，2.00，4.00，6.00，8.00，12.00，16.00 和 20.00 μg/L的質量濃度進行稀釋，并按照2.1 節、2.2 節條件進行前處理，測定得到4 種代謝物的標準曲線，回歸方程見表2。

選用草魚魚肉基質進行添加回收率和精密度試驗。在空白基質中加入5.0 μg/kg 的混合標準溶液，混勻后靜置，使樣品充分吸收標準溶液，然后按照2.1 節、2.2 節條件進行前處理，并上機測定。平行樣本3 個，添加水平測定5 次，計算加標回收率范圍和相對標準偏差（RSD），結果見表2。由表2 可見，4 種代謝物的平均回收率為98.147%～100.729%，連續測定 RSD 為0.228%～2.482%，平行樣RSD 為1.129%～2.895%，說明在該萃取pH 值下，添加回收率、精密度和重復性良好。

表2 4 種代謝物線性關系及回收結果

3 結語

在其他探究硝基呋喃類代謝物衍生化過程中梯度調節pH 值對提取效率影響的試驗中，pH 值調節范圍過大，可能會影響代謝物的提取和檢測；pH 值調節范圍過小，批量試驗時時間成本較高。例如陳明明[13]在豬肉和蝦肉樣品基質中，不調節酸度，在pH 值為3.0～7.0 時萃取，AMOZ 的離子信號強度較弱，平均加標回收率為127.20%，超出70%～120%的合理范圍；楊鵬[14]在pH 值為7.0～8.0 時進行梯度試驗，選擇合適的萃取 pH 值（7.2±0.2），對 4 種硝基呋喃類代謝物的離子信號強度和回收率影響不大，對大批量樣本進行pH 值精準調節的時間成本較高。

為更加高效地檢測4 種硝基呋喃類代謝物，確保回收率和數據的準確度，本試驗通過調節水產品硝基呋喃類代謝物提取過程中的pH 值，確定衍生化后萃取的最佳值為6.0～7.5，獲得了滿意的萃取效果和檢測靈敏度。其回收率、精密度、重復性均滿足殘留分析的要求，且通過試驗，選取較為寬泛的pH 值調節范圍，可方便快捷、簡單、穩定地進行大批量樣品試驗。