改良復合碘溶液體外抑菌效果及對草魚的急性毒性研究

周錫勛 ，劉朝清 ，朱曉漫 ，艾曉輝

（1.岳陽漁美康生物科技有限公司，湖南 岳陽 414199；2.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223；3.中國水產(chǎn)科學研究院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，湖北 武漢 430223）

復合碘溶液是精碘溶解后，經(jīng)絡(luò)合、稀釋、酸化而得到的一種消毒劑，具有廣譜、高效、低毒、使用便捷等優(yōu)點，被廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中[1]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，合理使用碘制劑，可起到消毒、驅(qū)殺蟲、調(diào)節(jié)生長與代謝等作用[2]。嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila） 是淡水養(yǎng)殖的主要病原菌之一，嚴重危害水產(chǎn)養(yǎng)殖的健康發(fā)展，對養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟損失[3]。現(xiàn)比較復合碘溶液和改良復合碘溶液對嗜水氣單胞菌的抑菌效果，并檢測其對草魚的急性毒性，確定改良復合碘溶液的安全濃度，為改良復合碘溶液在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗用魚與養(yǎng)殖條件

試驗用健康草魚200 尾，由中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所基地提供，平均體質(zhì)量為（80±20）g。試驗前在玻璃水族箱（規(guī)格為1.0 m×0.6 m，水深0.5 m）中暫養(yǎng)7 d。試驗用水為充分曝氣自來水，養(yǎng)殖和試驗過程中水體持續(xù)充氧，保持水中溶解氧質(zhì)量濃度＞5.0 mg/L，pH 值為 7.5～8.0，溫度為（26±2）℃。

1.1.2 試驗藥物及菌種

試驗藥物：改良復合碘溶液（由漁美康生物科技有限公司研發(fā)配制），拜耳迪典復合碘溶液（成都科宏達科技有限公司）。

試驗菌種：嗜水氣單胞菌XS-91-4-1，由中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所提供。

1.1.3 儀器設(shè)備

高速離心機（Velocity 18R，Dynamica 公司）；生物安全柜（AC2-4S，新加坡ESCO 公司）；生化培養(yǎng)箱（ZSD-1160，上海智城分析儀器制造有限公司）；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-100B，上海智城分析儀器制造有限公司）；電子天平（YP601N，上海高致精密儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 改良復合碘溶液對嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果

1.2.1.1 嗜水氣單胞菌的活化與培養(yǎng)

取20 μL 嗜水氣單胞菌甘油保存菌種于LB 固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用無菌接種環(huán)取培養(yǎng)板上生長狀態(tài)良好的單菌落，接種于LB 液體培養(yǎng)基，置于搖床28 ℃、180 r/min 震蕩培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)好的菌液1 mL，于1.5 mL 離心管10 000 r/min 離心1 min，棄上清液，用無菌生理鹽水稀釋嗜水氣單胞菌至1.5×108CFU/mL。最后用LB 液體培養(yǎng)基將菌液稀釋100 倍，使培養(yǎng)基中嗜水氣單胞菌的濃度為1.5×106CFU/mL，備用。

1.2.1.2 最小抑菌濃度測定

以嗜水氣單胞菌為受試菌株，采用微量稀釋法測定復合碘溶液的最小抑菌濃度。試驗設(shè)置2 組，第1 組試驗藥物組，第2 組為對照藥物組。試驗藥物組將配置好的改良復合碘溶液，加入每孔載有100 μL LB 液體培養(yǎng)基的96 孔板中，采用二倍稀釋法，使第1 至10 孔改良復合碘溶液的質(zhì)量濃度依次為 10 240，5 120，2 560，1 280，640，320，160，80，40 和 20 mg/L。1 至 10 孔，每孔加入 100 μL 濃度為1.5×106CFU/mL 嗜水氣單胞菌的培養(yǎng)基，此時第1 至10 孔的藥物質(zhì)量濃度依次為5 120，2 560，1 280，640，320，160，80，40，20 和 10 mg/L。第 11孔加入100 μL 菌液為陰性對照（加菌不加藥），第12 孔不加菌液為空白對照（不加菌不加藥），試驗設(shè)置3 個平行。對照藥物組以拜耳迪典復合碘溶液作為對照藥物，重復以上步驟，試驗設(shè)置3 個平行。放入恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)，觀察24 h 內(nèi)細菌生長情況，每個平行中無細菌生長對應的最低濃度即為最小抑菌濃度（MIC）[4]。

1.2.2 改良復合碘溶液對草魚的急性毒性

根據(jù)《水質(zhì)物質(zhì)對淡水魚（斑馬魚）急性毒性測定方法》（GB/T 13267—91），開展改良復合碘溶液對草魚的急性毒性試驗[5]。試驗設(shè)置2 組，第1 組為試驗藥物組，第2 組為對照藥物組。先通過半靜水停食法預備試驗浸泡藥液，觀察48 h 內(nèi)草魚的死亡情況，初步確定試驗藥物濃度的大致范圍。再根據(jù)預試驗結(jié)果，將試驗藥物組以等對數(shù)間距法設(shè)置5 個濃度（60，85，120，170 和 240 mg/L）和 1 個空白對照組（不加藥物），試驗設(shè)3 個平行，每個平行放試驗魚10 尾。試驗水體積為50 L，每12 h 更換藥液1 次，更換量為100%。對照藥物組以拜耳迪典復合碘溶液作為對照藥物，重復上述步驟，試驗設(shè)置3 個平行。在試驗過程中，連續(xù)觀察受試魚的行為、中毒癥狀和死亡效應。如 5 min 內(nèi)多次刺激無反應，即可判定試驗魚死亡。記錄各試驗組24，48 和96 h 時魚的存活情況[6]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果，采用Karber 法，計算改良復合碘溶液在24，48 和96 h 對草魚的半致死濃度及95%置信限區(qū)間[1]。公式如下：

（1）lg LC50=Xk－I（∑P－0.5），

（2）S（lg LC50）=I（∑pq/n），

（3）95%置信限：lg－1[lg LC50±1.96 S（lg LC50）]。

式中：LC50——半致死濃度，mg/L；Xk——最大劑量對數(shù)；I——相鄰兩組劑量的對數(shù)差；∑P——各組死亡率總和，%；S（lg LC50）——標準誤差，mg/L；∑pq/n——各組死亡率×存活率/每組動物數(shù)的總和，mg/L。安全濃度計算參照Turabell 公式[7]。

SC=0.3×48 h LC50/（24 h LC50/48 h LC50）2

式中：SC——安全濃度，mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 復合碘溶液對嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果

復合碘溶液對嗜水氣單胞菌的抑菌效果（24 h）見表1。由表1 可見，改良復合碘溶液對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度為320 mg/L，拜耳迪典復合碘溶液對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度為2 560 mg/L，改良復合碘溶液對嗜水氣單胞菌的抑菌效果是拜耳迪典復合碘溶液的8 倍。在試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，在12 h 內(nèi)80 mg/L 改良復合碘溶液可以很好地抑制嗜水氣單胞菌繁殖生長，而拜耳迪典復合碘溶液則需要2 560 mg/L 才可以達到抑制作用，說明12 h 內(nèi)改良典復合碘溶液對嗜水氣單胞菌的抑制作用是拜耳迪典復合碘溶液的32 倍。

2.2 復合碘溶液對草魚的急性毒性

在復合碘溶液對草魚的急性毒性試驗過程中發(fā)現(xiàn)，對照組草魚健康且行動活潑，未出現(xiàn)異常現(xiàn)象；試驗組不同程度地出現(xiàn)反應遲鈍、行動緩慢、呼吸異常等中毒和死亡現(xiàn)象，且死亡率隨復合碘溶液濃度的升高而增加。復合碘溶液對草魚的急性毒性試驗結(jié)果見表2。由表2 可見，改良復合碘溶液24，48和96 h 的LC50均低于拜耳迪典復合碘溶液。根據(jù)有毒物質(zhì)48 h 對魚類的毒性標準[7（]劇毒：LC50＜0.1 mg/L；高毒：0.1 mg/L＜LC50≤1.0 mg/L；中毒：1.0 mg/L＜LC50≤10 mg/L；低毒：LC50＞10 mg/L），改良和拜耳迪典復合碘溶液對草魚均屬于低毒性物質(zhì)。

3 討論

3.1 改良復合碘溶液的抑菌效果

復合碘溶液主要通過碘的鹵化作用，破壞菌體蛋白的生物學活性和菌體的生物膜結(jié)構(gòu)，從而殺滅病原菌[8]。嗜水氣單胞菌是淡水養(yǎng)殖的主要病原菌之一，感染后可引發(fā)魚類敗血癥[9]。本研究改良了復合碘溶液，并比較了其對嗜水氣單胞菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)改良復合碘溶液的體外抑菌效果是原來的8 倍，極大提高了復合碘溶液的抑菌作用，提高了藥效，降低用藥量和成本。高曉華[10]測定了聚維酮碘對6 株嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度，發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌對聚維酮碘的敏感度不太高，6 個菌株中最高的MIC 為1 024 mg/L，進一步說明了本研究中改良復合碘溶液抑菌的高效性。除了嗜水氣單胞菌，改良復合碘溶液對氣單胞菌[11]、哈維氏弧菌[12]、銅綠假單胞菌[13]、魯氏耶爾森氏菌[10]等均具有不同程度的抑菌效果，可用于防治多種水產(chǎn)動物病害。

3.2 改良復合碘溶液對草魚的安全性評價

本研究發(fā)現(xiàn)，改良復合碘溶液對草魚的急性毒性作用和拜耳迪碘復合碘溶液相差不大，說明改良后復合碘溶液的抑菌性能有所改進且并未損害其安全性。改良復合碘溶液對草魚的安全濃度為22.21 mg/L，遠高于復合碘溶液的臨床推薦使用濃度0.10 mg/L，可在草魚養(yǎng)殖過程中放心使用。漁業(yè)養(yǎng)殖水體是一個復雜且完整的水生生態(tài)系統(tǒng)，多種微生物相互作用，共同維持水環(huán)境穩(wěn)定，有時很小的藥物劑量也可達到消毒水體和調(diào)控水質(zhì)的作用，這也是復合碘溶液臨床使用劑量遠遠低于實驗室抑菌劑量的原因。