miR-221與E-cadherin在腎透明細胞癌中的表達及臨床意義

詹江輝，楊雪，狄文玉，魯廣建

(1.新鄉市第二人民醫院 檢驗科，河南 新鄉 453002；2.新鄉醫學院第一附屬醫院 a.輸血科;b.病理科;c.檢驗科，河南 新鄉 453100)

腎細胞癌中最常見的病理類型是腎透明細胞癌，目前腎透明細胞癌主要通過手術切除來達到治療的目的，但是大約30%的患者在隨訪中發現手術后發生復發及轉移，因此腎透明細胞癌較其他類型腎癌預后差[1]。有研究顯示miR-221在不同的惡性腫瘤組織中表達升高。有研究者篩選出由miR-181b-5p、miR-183-5p、miR-199-5p和miR-221-3p組成的多種miRNA組合在預測膀胱癌發生方面更好、更可靠，可以代表膀胱癌診斷的穩定生物標志物[2]。另外，有研究發現miR-221/222的異常表達可以改變前列腺細胞對雄激素的反應，從而潛在參與向去勢抵抗前列腺癌轉變，上調miR-221/222的表達可以促進腫瘤的轉移[3]。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程中上皮細胞失去上皮特征和完整性，獲得間充質特征，運動能力增加。E-cadherin是黏附連接的關鍵成分，E-cadherin表達缺失導致接觸抑制缺失，并與細胞活力增加和癌癥晚期相關[4]。因此，本研究通過檢測腎透明細胞癌中miR-221的表達及EMT相關分子E-cadherin的表達，并分析其相關性，探討miR-221在腎透明細胞癌高表達的臨床意義，為腎細胞癌的生存及預后提供潛在的生物標志物。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2015年1月至2016年12月在新鄉醫學院第一附屬醫院接受根治性腎切除術符合納入排除標準的38例腎透明細胞癌患者作為研究對象，并收集癌組織標本作為實驗組，癌旁正常組織標本為對照組。患者確診腎透明細胞癌后進行隨訪，隨訪時間為5 a，若在此期間患者死亡則停止隨訪。納入標準：(1)接受手術治療且術后經過病理診斷為原發性腎透明細胞癌；(2)手術前未接受放療、化療、靶向治療等抗癌治療；(3)臨床資料完整容易收集；(4)出院后隨訪資料容易獲得且未失訪。排除標準：(1)術中未能完整切除腫瘤組織；(2)合并有其他系統惡性腫瘤；(3)合并腎炎；(4)先天性腎畸形或發育不良。

1.2 主要試劑與儀器TRIzol購自美國Invitrogen公司，M-MLV Reverse Transcriptase購自美國Promega公司，Sybr green Ⅰ mix購自日本Takara公司，ABI PRISM 7000熒光定量PCR儀購自Applied Biosystems公司，鼠抗人E-cadherin抗體及免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，BX53顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1總RNA的提取 取出液氮中保存的癌組織及癌旁組織，放于研缽中，其間不斷加入液氮待研磨成粉末之后將其裝入EP管中。加入TRIzol裂解試劑 1 mL，用吸管反復吹吸以充分裂解。加入氯仿200 μL，劇烈震蕩1 min充分萃取。4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，上清液中即為提取的RNA。吸取上清液至另一新的EP管中，加入等量的異丙醇。4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，加入體積分數為75%乙醇后混合均勻，4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min。棄去上清液，放置冰上讓乙醇充分揮發。加入適量的DEPC水，使RNA溶解。使用分光光度計測定提取出來的RNA的濃度，OD260/OD280在1.7～2.1時，說明RNA純度較高。

1.3.2qRT-PCR檢測腎透明細胞癌及癌旁組織中miR-221的表達 根據M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA。按照Sybr green Ⅰ mix試劑盒說明在20 μL反應體積中進行實時熒光定量PCR。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 S，30個循環；72 ℃再延伸5 min。每組做3個復孔。使用U6作為內參，通過2-ΔΔCt方法計算miR-221的相對表達量。

1.3.3免疫組織化學染色 將收集好的癌組織標本及相應的癌旁組織標本放入組織固定液里面固定4 h。將組織塊放入梯度酒精中脫水。放入二甲苯溶液中透明處理，然后浸蠟，包埋，切片，脫蠟，水化。放于枸櫞酸鈉溶液中，然后將其放入微波爐中修復抗原表位。切片上滴加H2O2封閉內源性過氧化物酶。在切片上滴加山羊血清封閉液封閉非特異性位點。組織切片上滴加鼠抗人E-cadherin一抗，放置于4 ℃的冰箱里過夜。組織切片上滴加試劑盒中的二抗。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液。組織切片上滴加DAB顯色液。滴加蘇木精染色液進行復染5 min。再進行脫水，透明，封固。在高倍顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.4 免疫組織化學染色判斷標準每張切片在200倍顯微鏡視野下隨機選取5個不同的視野，由兩位高年資的病理醫生分別進行獨立閱片。根據200倍顯微視野下的染色程度和陽性染色細胞百分比進行綜合評分，其中陽性細胞百分比評分規則為：≤5%記為0分，6%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%記為3分，76%～100%記為4分。染色程度評分規則為：未著色記為0分，著淺黃色記為1分，著棕黃色記為2分，著棕褐色記為3分。計算染色程度和陽性細胞百分比的乘積。乘積結果為0～4分判斷為低表達，低表達結果判斷為陰性；6～12分判斷為高表達，高表達結果判斷為陽性[5]。

2 結果

2.1 miR-221在腎透明細胞癌組織與癌旁組織中的表達及與臨床病理參數的關系miR-221在實驗組中相對表達量為4.911±1.064，在對照組中相對表達量為1.163±0.238，在實驗組中相對表達量高于對照組，兩組間比較差異有統計學意義(P<0.001)(見圖1)。在癌組織標本中，miR-221的相對表達量在Fuhrman不同分級、有無淋巴結轉移方面差異有統計學意義(P<0.05)，不同年齡、性別、腫瘤大小、腎靜脈內有無癌栓方面差異無統計學意義(P>0.05)(見表1)。

圖1 qRT-PCR檢測腎透明細胞癌患者實驗組及對照組中miR-221表達

表1 miR-221表達與腎透明細胞癌患者臨床病理參數的關系

2.2 腎透明細胞癌患者E-cadherin的表達及與臨床病理參數的關系免疫組織化學染色結果顯示E-cadherin主要表達于細胞膜上(見圖2、3)。在實驗組中E-cadherin表達陽性率為26.32%(10/38)，對照組中E-cadherin表達陽性率81.58%(31/38)，兩組表達差異有統計學意義(χ2=23.356，P<0.001)。E-cadherin的表達在不同年齡、性別、腫瘤大小、有無淋巴結轉移、癌栓形成方面無統計學意義(P>0.05)，在Fuhrman不同分級方面差異有統計學意義(P<0.05)(見表2)。

A為腎透明細胞癌組織；B為癌旁組織。圖2 腎透明細胞癌與癌旁組織HE染色(200×)

表2 E-cadherin與腎透明細胞癌病理參數的關系[n(%)]

2.3 腎透明細胞癌患者miR-221的表達與E-cadherin的相關性對腎透明細胞癌患者癌組織中miR-221與E-cadherin的表達進行Spearman相關性分析，相關系數r為-0.569(P<0.001)，表明miR-221與E-cadherin的表達呈負相關(見圖4)。

圖4 腎透明細胞癌患者癌組織中miR-221的表達與E-cadherin表達的Spearman相關性分析

2.4 腎透明細胞癌患者癌組織中miR-221表達與患者生存預后的關系在腎透明細胞癌患者癌組織中miR-221表達平均數為4.911，以4.911為界限，將腎透明細胞癌患者分為miR-221高表達組(>4.911)17例和miR-221低表達組(<4.911)21例，其中失訪病例已排除出組。38例腎透明細胞癌患者經過5 a隨訪，總生存26例，死亡12例。Kaplan-Meier法生存曲線結果顯示miR-221高表達組5 a生存率為52.94%(9/17)，miR-221低表達組5 a生存率為80.95%(17/21)，miR-221高表達組與miR-221低表達組生存曲線比較log-rank檢驗結果差異有統計學意義(χ2=4.329，P=0.037)(見圖5)。

圖5 腎透明細胞癌患者癌組織中miR-221高表達組和低表達組的生存曲線

3 討論

腎細胞癌是比較常見的泌尿系統惡性腫瘤，其中腎透明細胞癌是最常見的腎細胞癌類型，占腎惡性腫瘤的90%，其他亞型包括乳頭狀腎細胞癌占6%～15% ，嫌色腎細胞癌占2%～5%[6]。早期發現對患者預后非常重要，被診斷為器官局限性疾病的患者5 a生存率約為90%，而遠處轉移患者的預后仍然很差，5 a生存率不到10%[7-8]。腫瘤復發主要是由于腎細胞癌對化療和放療的抵抗，5%～10%的腎透明細胞癌病例延伸到腎靜脈或下腔靜脈[9]。舒尼替尼通常用作腎細胞癌的一線治療，盡管舒尼替尼對10%～20%的晚期腎細胞癌患者本身治療無效[10]。因此，迫切需要增加對腎細胞癌進展和轉移的分子機制的了解，同時發現分子標志物用于腎癌的預后評估。

miRNA是一類高度保守、半衰期長的非編碼小分子RNA。成熟的miRNA以20～24個核苷酸的miRNA雙鏈體形式存在，包括miRNA引導鏈及其互補的過客鏈[11]。研究顯示miR-221在不同的癌癥類型中表達升高，其具有類似癌基因的功能。在膀胱癌中，有研究發現miR-221的下調通過增加TP53INP1誘導自噬，并通過抑制ERK的激活來抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲，并且miR-221與膀胱癌患者的不良生存率相關[12]。在肝癌中，研究發現miR-221的表達顯著高于鄰近正常組織，且miR-221表達與肝癌患者的腫瘤TNM分期有相關性，miR-221表達降低可以延長肝癌患者的生存時間[13]。在胃癌中，與癌旁組織相比，腫瘤組織中miR-221表達明顯升高，miR-221表達較高的患者預后明顯較差，miR-221可以調控胃癌細胞的增殖和凋亡[14]。有研究者使用癌癥基因組圖譜數據的生存分析表明，miR-221的高表達與結直腸癌患者的低生存率相關，表明miR-221可能通過抑制自噬和靶向TP53INP1促進結直腸癌的細胞增殖[15]。有研究顯示miR-221的靶基因包括p27 Kip1、p57 Kip1、PTEN、c-kit等，除此之外，miR-221在平滑肌細胞增生和人類老齡化進程中也起著重要的作用[16]。本研究檢測腎透明細胞癌中miR-221的表達，研究結果顯示在癌組織中miR-221表達量高于對照癌旁組織，臨床病理參數分析結果表明miR-221的表達與年齡、性別、腫瘤大小、靜脈內癌栓無關，而與淋巴結轉移及Fuhrman分級有關。

EMT是一種最初在發育早期觀察到的過程，在這個過程中可將極性固定的上皮細胞轉化為間充質細胞，運動能力增加。在EMT的過程中，具有上皮特征的E-cadherin表達降低，具有間充質特征的N-cadherin、波形蛋白等表達量增加[17]。E-cadherin表達的喪失與癌癥進展和轉移有關，多項研究表明，E-cadherin在癌細胞中低表達。有研究者使用免疫組化檢測170例食管鱗狀細胞癌組織和相應的正常食管黏膜組織中E-cadherin的表達情況，食管鱗狀細胞癌組E-cadherin表達陽性率明顯低于對照組，E-cadherin表達的陽性率與分化等級、腫瘤分級、淋巴結轉移階段顯著相關[18]。對78例經過保乳手術治療的乳腺癌患者進行研究，將有腋窩淋巴結轉移患者設為實驗組，發現實驗組E-cadherin陽性表達率低于對照組，該實驗證實了乳腺癌患者保乳術后腋窩淋巴結轉移與E-cadherin表達降低有一定的相關性[19]。本實驗使用免疫組化檢測E-cadherin在腎透明細胞癌中的表達情況，結果顯示E-cadherin在癌組織中陽性率低于癌旁組織。E-cadherin的表達與miR-221的表達呈負相關。Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗結果顯示miR-221高表達組與miR-221低表達組的生存曲線差異具有統計學意義。

綜上所述，miR-221在腎細胞癌中表達升高且與臨床Fuhrman分級及淋巴結轉移有關，miR-221與EMT相關分子E-cadherin的表達有相關性。本研究表明miR-221在腎透明細胞癌EMT進展過程中發揮一定的作用，是腎透明細胞癌患者生存及預后評估的潛在生物標志物。