兩種不同方法檢測(cè)血清中甘氨鵝脫氧膽酸鈉的對(duì)比分析

王煌煌 王素玉 王麗 李金英 王志永

摘 要：本文探討生化法與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）檢測(cè)血清中甘氨鵝脫氧膽酸鈉（GCDC）結(jié)果的相關(guān)性。根據(jù)美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）EP9-A文件，每天取臨床樣本８份，分別采用自主研發(fā)的體外診斷生化試劑和HPLC-MS/MS測(cè)定血清GCDC含量，共測(cè)定５d，記錄結(jié)果，去除離群點(diǎn)，計(jì)算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，進(jìn)行偏倚估計(jì)，對(duì)比生化試劑測(cè)量的準(zhǔn)確性。通過試驗(yàn)得出生化法和HPLC-MS/MS方法檢測(cè)血清GCDC的相關(guān)方程為Y生化法=0.9642XHPLC-MS/MS-1.2266，相關(guān)系數(shù)（r）=0.9954，兩種方法結(jié)果高度相關(guān)，有很好的可比性；兩種血清中GCDC檢測(cè)結(jié)果具有很好的可比性，由于檢測(cè)原理和儀器不同，當(dāng)采用不同方法時(shí)，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行對(duì)比分析和偏倚評(píng)估。

關(guān)鍵詞：血清，甘氨鵝脫氧膽酸鈉，對(duì)比

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2023.12.058

甘氨鵝脫氧膽酸鈉（Glycochenodeoxycholate，GCDC）作為一種結(jié)合型膽汁酸，其水平能直接反映出肝損傷程度。高效液相色譜法證實(shí)，通過給小鼠補(bǔ)充甘胺鵝脫氧膽酸鈉可使其膽汁鹽池人源化，此類小鼠慢性干細(xì)胞膽汁淤積單獨(dú)誘導(dǎo)肝纖維化，繼發(fā)肝損傷[1]。另有學(xué)者研究表明，GCDC處理組明顯增加肝臟干細(xì)胞凋亡率[2]。在臨床上測(cè)定血清中GCDC含量具有一定臨床的意義。

目前，國際尚無甘氨鵝脫氧膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，臨床實(shí)驗(yàn)室使用生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)無法判定檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度，高分辨率質(zhì)譜檢測(cè)準(zhǔn)確但在臨床又很難開展。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了生化試劑在生化分析儀上檢測(cè)和HPLC-MS/MS兩種不同方法同時(shí)對(duì)40例臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)[3]，將兩者數(shù)據(jù)依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）批準(zhǔn)的《用患者樣本進(jìn)行方法學(xué)對(duì)比及偏差評(píng)估EP-9指南文件》進(jìn)行相關(guān)回歸和偏倚估計(jì)，比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性，同時(shí)來驗(yàn)證自主研發(fā)的生化試劑在生化分析儀上對(duì)臨床樣本檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜儀，Agilent6460三級(jí)四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國Agilent Technologies 公司）；電子天平（Sa r torius公司，0.1 mg）；漩渦混合器（WXW-20D，杭州齊威儀器有限公司）；臺(tái)式告訴冷凍離心機(jī)（FZ-0209，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；HITACHI7600全自動(dòng)生化分析儀；甲醇（HPLC級(jí)，Merk）；乙腈（HPLC級(jí)，Merk）；甲酸（HPLC級(jí)，Thermo Scientific）；甘氨鵝脫氧膽酸鈉對(duì)照品（純度>97%；Merk）;甘氨鵝脫氧膽酸鈉測(cè)定試劑盒（批號(hào)：220511；規(guī)格：試劑1：60 mL/瓶Ⅹ1；試劑2：20 mL/瓶Ⅹ1；研制單位：河北艾歐路生物科技有限責(zé)任公司）；校準(zhǔn)品（批號(hào)：220511；規(guī)格：1 mL；研制單位：河北艾歐路生物科技有限責(zé)任公司）；質(zhì)控品（批號(hào)：220511；規(guī)格：1 mL；研制單位：河北艾歐路生物科技有限責(zé)任公司）。

1.2 臨床樣本及方法

每天隨機(jī)收集新鮮血清樣本8份，分別用生化法（Y）和HPLC-MS/MS法（X）按順序1～8進(jìn)行標(biāo)本測(cè)定，然后再反順序8～1重復(fù)測(cè)定，連續(xù)5 d。其濃度選擇按照EP-9A文件中方法對(duì)比實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分布建議表的要求，盡可能覆蓋檢測(cè)范圍。

1.3 生化法測(cè)定參數(shù)設(shè)定

方法：速率法；反應(yīng)時(shí)間：10分鐘；反應(yīng)方向：向上；主波：405 nm；副波：660 nm；樣本量：3.6 μL；試劑1：243 μL；試劑2：81 μL；校準(zhǔn)方式：2點(diǎn)線性。

1.4 HPLC-MS/MS方法條件

1.4.1 樣品預(yù)處理

采用乙腈沉淀蛋白法處理血清：取50 μL血清于1.5 mL離心管中，加入100 μL80%乙腈溶液，漩渦振蕩30 s，室溫靜置20 min，10，000 g高速離心20min，吸取上清液，再次高速離心20 min，吸取上清液，30℃氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)?0 μL甲醇溶解，混勻，高速離心20 min，吸取上清液進(jìn)樣分析。

1.4.2 色譜條件

Phenomenex C18色譜柱（150 mm×2.1 mm， 3μm）；流動(dòng)相：0.1% 甲酸水溶液-乙腈（50：50）；洗脫方式：等度洗脫；洗脫時(shí)間：10 min；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL 。

1.4.3 質(zhì)譜條件

多反應(yīng)檢測(cè)掃描MRM 模式；ESI電離源；正離子模式；毛細(xì)管電壓：4000 V；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流速：11 L/min；霧化器壓力：15 Psi；Precursor Ion：432.2；Product Ion：414.3*（定量離子）、339.3；Fragmentor：135；Collision Energy：10；Cell Accelerator Voltage：7。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2.1 記錄測(cè)定結(jié)果，做散點(diǎn)圖及偏差圖

利用Window XP Office Excel 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)算每個(gè)樣本測(cè)定結(jié)果的均值（Xi和Yi），每樣本兩次重復(fù)測(cè)定值間差值的絕對(duì)值（DXi、DYi）及2種方法測(cè)定結(jié)果均值間的差值（Yi- Xi），Xij和Yij，j標(biāo)示重復(fù)次數(shù)。

2.2 目測(cè)離群點(diǎn)

計(jì)算樣本兩次重復(fù)測(cè)定值間差值的絕對(duì)值（DXi、DYi）的平均數(shù)。計(jì)算兩種方法測(cè)定結(jié)果均值間差值（Yi-Xi）的平均數(shù)。判斷：對(duì)任一標(biāo)本，若重復(fù)測(cè)定值差的絕對(duì)值（DXi、DYi）或兩種方法測(cè)定結(jié)果均值間差值（Yi-Xi）超出平均數(shù)４倍，則檢驗(yàn)結(jié)果視為無效。

3 譜圖與結(jié)果

3.1 兩種方法的結(jié)果

通過生化發(fā)反應(yīng)曲線可知，該反應(yīng)在6.56～8.44min之間生成物與反應(yīng)時(shí)間成正比，K值3800。通過HPLC-MS/MS測(cè)定結(jié)果表明，GCDC對(duì)照品提取離子色譜圖在4.68 min出鋒，實(shí)際樣品溶液出鋒時(shí)間和對(duì)照品一致。

3.2 樣本結(jié)果

生化法測(cè)定結(jié)果在0.4～23.2 μmol/L之間，每樣本兩次重復(fù)測(cè)定值間差值的絕對(duì)值的平均值為0.4μmol/L；HPLC-MS/MS測(cè)定結(jié)果在0.2～21.5 μmol/L之間，每樣本兩次重復(fù)測(cè)定值間差值的絕對(duì)值的平均值為0.13 μmol/L。

4 討 論

本文依據(jù)N C C L S標(biāo)準(zhǔn)化文件E P- 9A對(duì)測(cè)定血清GCDC的兩種方法進(jìn)行了比較。其結(jié)果為：生化法和高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法具有相關(guān)性，其線性回歸方程為：Y生化法= 0.9 6 42X H PLC-MS /MS -1.2266，相關(guān)系數(shù)（r）=0.9954。預(yù)期偏倚在中低濃度時(shí)隨GCDC濃度增高而降低，高濃度時(shí)預(yù)期偏倚在10%以下。整體結(jié)果生化法測(cè)定結(jié)果較HPLCMS/MS法測(cè)定結(jié)果偏高，高濃度時(shí)兩種方法偏差在10%以下。

質(zhì)譜技術(shù)以其高靈敏度，高分辨率的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，為質(zhì)譜的發(fā)展注入了新的活力，形成了獨(dú)特的生物質(zhì)譜技術(shù)。此種方法需要對(duì)血清樣本進(jìn)行去蛋白前處理，檢測(cè)步驟較多，且檢測(cè)儀器昂貴。生化法檢測(cè)過程簡單，是目前臨床化學(xué)檢驗(yàn)的主流方法。由于國家尚未發(fā)布甘氨鵝脫氧膽酸測(cè)定試劑盒配套的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在日常檢測(cè)過程中，缺少準(zhǔn)確度對(duì)照用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。本文通過以高效串聯(lián)質(zhì)譜法和自主研發(fā)的生化試劑配套日立7600全自動(dòng)生化分析儀，同時(shí)檢測(cè)血清中GCDC含量，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和偏倚分析，考察兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性，為臨床生化檢測(cè)的準(zhǔn)確性提供理論依據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果表明兩種方法相關(guān)性較高，同時(shí)本試驗(yàn)也表明，兩種方法存在一定偏倚，尤其是在血清GCDC較低時(shí)，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果偏差較大。因此，建議各臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的情況選擇實(shí)驗(yàn)方法，并建立相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室參考值，結(jié)合臨床癥狀，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，給出科學(xué)判斷和解釋。

參考文獻(xiàn)

H O H E N E S T E R S ， K A N I T Z V， K R E M E R A E ， e t c .Glycochenodeoxycholate promotes liver fibrosis in mice withhepatocellular cholestasis[J]. Cells，2020，9（2）：281.

李志鵬，王健，肖程，等.膽汁淤積性微環(huán)境中甘氨鵝脫氧膽酸鈉促進(jìn)肝臟干細(xì)胞凋亡[J].解剖學(xué)報(bào)，2019，50（6）：747-753.

郭健，謝潔紅，趙海艦.方法學(xué)比較實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)及對(duì)兩種清蛋白測(cè)定法的比較[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2000，23（6）：343-345.

作者簡介

王煌煌，大專，研究方向?yàn)轶w外診斷試劑質(zhì)量評(píng)價(jià)。

王志永，通信作者，本科，工程師，研究方向?yàn)獒t(yī)療器械質(zhì)量控制。

（責(zé)任編輯：劉憲銀）