基于網絡藥理學和分子對接探究滌痰湯治療冠心病的作用機制

王朕 劉光輝 王洋

[關鍵詞]滌痰湯；網絡藥理學；冠心??；分子對接；作用機制

冠心病（coronaryheartdisease，CHD）是一種缺血性心肌病，CHD可引起管腔狹窄或閉塞，導致心肌缺血、缺氧或壞死。CHD中醫又稱“胸痹心痛”，出自《靈樞·經脈》，由多種原因引起瘀血、寒凝、痰濁、氣滯痹阻心脈。痰濁是氣機失調或血行不暢引發的病理產物，近現代醫家多從痰濁辨證治療胸痹心痛，楊關林教授團隊研究結果表明，痰濁貫穿于胸痹心痛的整個病程[1]。滌痰湯出自明代董宿《奇效良方》卷一，具有補虛豁痰，清熱利氣之功，善于治療動脈粥樣硬化痰濁瘀阻證。現代研究證實滌痰湯治療CHD穩定型心絞痛具有顯著臨床效果[2]。滌痰湯關于CHD的治療研究已經進入分子水平[3]，但缺少基于網絡藥理學分析滌痰湯治療CHD作用機制的研究。本研究通過篩選交集靶點，進行富集分析、分子對接技術，將前期預測靶點和活性成分進行對接驗證，探討滌痰湯治療CHD的生物分子作用機制，為今后學者使用該方治療CHD及相關疾病提供依據。

1 材料與方法

1.1 滌痰湯藥物活性成分及其作用靶點的篩選

通過檢索中藥系統藥理學數據庫[4]檢索滌痰湯9種中藥的化學活性成分，根據類藥性（DL）≥0.18，口服利用度（OB）≥30%篩選獲得中藥活性化合物。在Uniprot蛋白質數據庫將其轉化為基因靶點進行規范。

1.2 差異基因（DEGs）的篩選與處理

從高通量基因表達數據庫獲得編號GSE71226基因芯片的原始數據及對應的GPL基因注釋文件，使用在線分析工具GEO2R篩選出CHD和正常人的差異基因。導入在線繪圖平臺，以表達差異檢驗P<0.05、表達倍數（FC）絕對值>2為條件，導出差異基因并繪制熱圖及火山圖。

1.3 CAD相關靶點獲取及維恩圖的繪制

以“coronaryheartdisease”為關鍵詞，在Drugbank、OMIM和GeneCards數據庫篩選取并集，獲得本研究使用CHD疾病靶點繪制維恩圖。

1.4 滌痰湯成分-CHD靶點PPI網絡

將1.3獲得疾病靶點與藥物靶點取交集，得到CHD-滌痰湯有效成分交集靶點。使用Cytoscape3.8.2軟件得到“中藥-活性成分-基因靶點”網絡圖。

1.5 基因本體（geneontology，GO）功能富集分析

使用metascape和David數據庫，選擇物種信息為人，導出富集通路信息，進行可視化富集分析。

1.6 基因組百科全書（kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG）通路富集分析

通過metascape和David數據庫交集靶點進行富集分析。繪制氣泡圖發掘CHD治療中滌痰湯作用機制。

1.7 滌痰湯處方組成-活性成分-CHD靶點-通路網絡圖構建

將KEGG通路富集結果導入Cytoscape3.8.2軟件，獲得“活性成分-靶標-通路”網絡圖，根據網絡拓撲參數判斷核心靶點前10位及發揮藥效的主要活性成分。

1.8 分子對接驗證

以1.7所作圖中度值較大的有效成分和兩個網絡圖靶點度值排名前10位交集的關鍵靶點蛋白為研究對象進行分子對接驗證。

2 結果

2.1 滌痰湯活性成分的篩選

通過篩選共得到滌痰湯中有效活性化合物73個，其中人參10個、甘草20個、橘紅5個、茯苓3個、膽星5個、竹茹6個、枳實12個、菖蒲4個、半夏8個。

2.2 DEGs的篩選與處理

GSE71226共含基因45119個。log2FC>0為上調基因，反之為下調基因，繪制火山圖，見圖1。以FC絕對值>2、P<0.05為條件篩選到正常組和CHD組差異基因3473個，選擇幅度最大的前18位基因繪制聚類熱圖，見圖2。

2.3 滌痰湯治療CHD的潛在作用靶點及文氏圖的繪制

去重得到4511個CHD疾病基因，見圖3。把交集靶點導入STRING數據庫，限定物種為“人”，得到疾病藥物共有靶點PPI網絡圖，見圖4。節點度值通過文字大小節點面積來表示，度值越高的節點的面積越大，其中AKT1、RELA和HSP90AA1可能是滌痰湯治療CHD重要靶點。

2.4 藥物-成分-靶點PPI網絡圖

滌痰湯治療CHD的“中藥-活性成分-基因靶點”網絡圖，見圖5。網絡中所有成分均對應2個以上靶點，說明滌痰湯發揮作用是“多成分、多靶點”共同的結果，符合我國中醫藥辨證、辨病、辨癥相結合治療疾病的特點。研究方劑滌痰湯的核心成分，按度值進行排序，前3位為去山柰酚（度值=125）、β-谷甾醇（度值=95）、柚皮素（度值=93），見表1。

2.5 GO富集分析

得到GO-BP（生物過程）富集結果361條、GO-CC（細胞成分）富集結果44條、GO-MF（分子功能）富集結果66條。于BP、MF、CC中分別選出FDR值最小的10條通路，繪制富集條形圖，見圖6。

2.6 KEGG富集分析

得到KEGG富集結果163條。于BP、MF、CC中分別選出FDR值最小的15條通路。如圖可知，CHD疾病病機是多通路共同作用的結果，KEGG主要涉及脂質與CHD、白介素17和TNF信號通路等，見圖7。

2.7 滌痰湯處方組成-活性成分-CHD靶點-通路網絡圖構建

分析KEGG結果，構建網絡。找出對應靶點和有效成分，根據度值、介度及緊密度大于閾值篩選。獲得關鍵靶點47個，見表2?？梢曅詢灮▓D8）。找出藥效作用的主要成分及核心靶點。結果顯示主要成分為豆甾醇、β-谷甾醇、柚皮素、山柰酚、谷甾醇和槲皮素等。核心靶點前10個為：RELA（16）、AKT1（15）、JUN（15）、CASP3（14）、MAPK1（12）、MAPK3（12）、HSP90AA1（12）、pTGS2（12）、pRKCA（11）、MAPK14（10）。與PPI網絡的前10個核心靶點對比，有6個共同靶點。此網絡體現了滌痰湯通過多靶點、多成分、多通路的方式干預CHD的特點。

2.8 分子對接驗證

分子對接兩者之間有一定的結合活性，則結合能≤-4.25kcal/mol；若結合活性較好，則結合能≤-5.0kcal/mol；若兩者之間有強的結合活性，則結合能≤-7.0kcal/mol[5]。選取篩選得到的核心成分分別與關鍵靶點進行分子對接驗證，計算其對接分數（表3），由表可見，其中100%的活性成分與其蛋白質靶點之間有較好的結合活性，大部分有強的結合活性，而β-谷甾醇與MAPK3的對接分數最高，為-10.2。

3 討論

3.1 CHD成因與滌痰湯治療CHD理論依據

心血管疾病發病率逐年上升，截至2017年，我國心血管疾病患者數量高達2.9億人[6]。濁、毒、痰、瘀等邪氣通過血液的流通對脈道產生影響，脈道變厚，血流速度變緩，血管異常收縮，形成血栓或粥樣斑塊[7]。有學者治療胸痹心痛時多從調理水谷之海入手，運用祛瘀、行氣、化痰、健脾等治法[8]。滌痰湯由二陳湯化裁而成，具有祛痰化瘀的功效，相關研究認為，滌痰湯能緩解CHD（痰濁瘀阻證）患者臨床表現，減少血液粥樣斑塊，使血液流變學指標改善[9]。對治療不穩定型心絞痛痰濁瘀阻型CHD，滌痰湯可在一定程度上提高臨床預后，緩解胸痛、胸悶、心悸等癥狀[10]。

3.2 滌痰湯以“β-谷甾醇”等為主要活性成分治療CHD

臨床中，滌痰湯常用于急性心梗和不穩定型心絞痛痰濁瘀阻證等疾病，方中橘紅理氣寬中，半夏燥濕化痰。相關活性成分β-谷甾醇能發揮保護缺血再灌注損傷心肌的作用[11]。竹茹化痰止嘔，枳實破氣行痰，膽南星清熱化痰，主要成分柚皮苷通過調節絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路減少脂質條紋增殖以及血管平滑肌細胞遷移[12]。炙甘草調和諸藥，槲皮素是人參、甘草、竹茹等中藥的主要成分之一，具有保護內皮、擴張血管、降脂等內分泌調節的作用[13]。因此滌痰湯可能通過以上藥物活性成分，發揮調節膽固醇、保護心肌、降糖、調脂、抑制心肌細胞凋亡等作用。

3.3 滌痰湯以“MAPK1”等核心靶基因治療CHD

MAPK系列在CHD的發展、心肌細胞凋亡和增殖及血管內皮細胞新生中具有重要的組織學作用。MAPK1和MAPK3是重要多通路功能蛋白，與心肌纖維化發生發展有密不可分的關系。RELA是NF-κB家族中最常見的成員，有研究表明，RELA（p65）可以通過調控人主動脈平滑肌細胞生物學機制減緩CHD的病理進展[14]。AKT信號通路在心血管系統中控制著多種細胞功能。通過Ap-1、c-JUN與Fank1、Jab1共同作用，上調下游基因Bcl-2的表達，起到抑制細胞凋亡的作用[15]。以上靶點與緩解動脈粥樣硬化和心肌細胞凋亡、保護動脈重構密不可分，提示滌痰湯可能通過增強或抑制相關靶點的表達來治療CHD。

3.4 滌痰湯治療CHD各分類疾病涉及的生物學過程及信號通路

WHO將CHD分為5大類，其中心力衰竭是由于心臟收縮或舒張功能障礙，心臟射血不能滿足機體的需要，TNF通路通過激活CASP3對凋亡因子起到抑制作用和抗凋亡因子的激活作用[16]。心肌梗死是冠狀動脈急性、持續性缺血缺氧所引起的心肌壞死。PI3K-AKT通路通過調節NOS3的表達，調控JNK和p38，上調Bcl-2和下調Bax的表達，從而達到抗凋亡的目的。綜上，對于CHD多種分型，以上靶點與通路分別通過調節抗炎和抑制細胞凋亡、抗氧化因子等機制，發揮緩解和治療的作用。

4 小結

本研究證實了滌痰湯多靶點、多成分、多通路的中藥藥物作用機制。由于網絡藥理學、分子對接技術的局限性，后期可圍繞藥效學評價-物質基礎代謝組學-通路驗證等開展實驗研究，為滌痰湯治療CHD以及藥物開發利用提供理論依據。