miR-34a-5p模擬物與KRASG12C抑制劑ARS-1620協同用藥對非小細胞肺癌轉移效果的研究

龐曉曉 袁浩棟 王輝 徐國新

[關鍵詞]微小RNA-34a-5p；間質表皮轉化因子；ARS-1620；轉移；非小細胞肺癌

肺癌是全球范圍內常見腫瘤，發病率位列所有腫瘤第三位，其中非小細胞肺癌（non-small-celllungcancer，NSCLC）是其最常見的組織學類型，現已構成嚴重的全球健康問題[1-2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類對基因表達有調節作用的非編碼小分子RNA，其主要調控靶基因蛋白表達從而調節增殖、凋亡等多種細胞生物學功能[3-5]。據分析，miR-34a和miR-4664-3p、let-7a-2-3p等miRNAs聯合使用顯著抑制腫瘤增殖[6]。在抗NSCLC腫瘤細胞轉移方面，miR-34a與多種藥物協同作用效果顯著。KRAS基因突變被認為是NSCLC的預后不良因素，其中G12C位點突變約占14%[7-8]。因此臨床已將KRASG12C作為一個極好的肺癌治療靶點。KRASG12C抑制劑ARS-1620是一種快速持續占據靶點的高效價共價化合物，它通過抑制KRASG12C激活從而阻斷RAS-RAF-MEK-ERK信號傳遞，在小鼠移植瘤模型中已證實其抑制人類胰腺癌和結直腸癌細胞系生長的能力[9]。由此，本研究將探究miR-34a通過調控靶基因與ARS-1620協同作用時對KRASG12CNSCLC轉移的影響，為臨床治療KRASG12CNSCLC提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

NSCLC細胞株：H2030與人正常肺上皮細胞Beas-2b均購于中國上海富衡細胞庫。miR-34amimic（miR10000255-1-5）由廣州銳博生物技術有限公司合成，Lipo2000（11668027）購于Invitrogen；ARS-1620（S8707）購于SELLECK生物科技有限公司；4%多聚甲醛（P0099）和結晶紫染液（C0121）購于碧云天生物技術有限公司；PCR試劑盒等（RR820A，638315）購于TaKaRa生物技術有限公司。MET（8198S）、β-actin（3700T）抗體等購于賽信通生物試劑有限公司（CST）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染 將含10%胎牛血清的DMEM完培于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養細胞。將ARS-1620[溶于二甲基亞礬（DMSO）中]直接滴加于培養基，工作濃度為300nM。轉染過程是分別將濃度0、50、100、150nM的miR-34a-5pmimic和Lipo3000分別加入120μlDMEM基培中，混勻室溫靜置20min后將緩慢加入已接種細胞的6孔板內。

1.2.2 生物信息學分析 DAVID（thedatabaseforannotation，visualizationandintegrateddiscovery）分析miR-34a靶基因調控功能。TCGA（thecancergenomeatlas）下載肺癌表達差異基因，R語言制作火山圖（篩選條件為foldchange=2，adj.P=0.001），GEO數據庫下載關于肺癌轉移的系列：GSE42407（篩選條件為|logFC|>1，adj.P<0.01）。

1.2.3 Transwell實驗 將細胞懸液200μl接種于Transwell上室中，下室加500μl培養基于24孔板并于培養箱孵育18～24h。將上下室培養基吸盡，加入4%多聚甲醛固定細胞，15min后再用結晶紫染色。

1.2.4 熒光素酶報告基因實驗 將MET3UTR克隆至報告基因pmiR-RB-Report?的hRluc（海腎熒光素酶）基因下游，構建雙報告基因載體（MET3UTR靶位點：51-57：CACTGCC，突變靶位點：51-57：CACTGCC）。將基因載體與miR-34amimic或陰性對照共轉染293T細胞并測定熒光素酶活性。

1.2.5 qRT-PCR 反應條件為預變性95℃30s；循環40次；95℃5s；60℃30s。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.2.6 （WesternBlot）WB 將上清注入電泳槽中，90V電泳1.5h，90V2h轉至PVDF膜，結束后用5%脫脂牛奶室溫封閉2h，加入一抗4℃孵育過夜，次日加入熒光素標記二抗，掃膜儀成像。

1.3 統計學處理

采用GraphPadPrism7.0軟件及SPSS26.0進行圖片處理及數據統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較比較采用配對t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 過表達miR-34a抑制H2030轉移

qRT-PCR結果顯示：與人正常肺上皮細胞Beas-2b比較，H2030中miR-34a表達（0.13±0.10）下降，差異有統計學意義（t=15.820，P=0.004）。見圖1A。Transwell實驗結果顯示：miR-34amimic組（1035.00±61.81）細胞轉移數量低于空轉mock組（1321.00±107.50），差異有統計學意義（t=4.931，P=0.039）。見圖1B。

2.2 生信分析篩選并驗證miR-34a靶基因

通過TargetScan、miRDB、PicTar預測miR-34a靶基因并交集得出125個基因（圖2A）。通過DAVID預測miR-34a靶基因涉及遷移功能（圖2B）。將來自TCGA數據庫肺癌表達上調差異基因、GSE42407有關基因以及125個靶基因交集得出11個基因，分別為F2RL2、CCNE2、NRIP3、SEPT3、SEMA4B、ALDOA、BTBD11、ZFHX4、NAV1、JAG1、MET（圖2C～D）。

選擇MET進行下一步實驗，熒光素酶報告基因實驗顯示，相對于MET-WT+NC（1.00±0.07），MET-WT+miR-34a組相對熒光值下降（0.57±0.02），差異有統計學意義（t=7.954，P=0.015），提示miR-34a負調控靶基因MET表達。見圖3A。qRT-RCR結果顯示：miR-34amimic（100nM）組（0.49±0.05）中METmRNA表達低于對照mock組（1.18±0.09），差異有統計學意義（t=19.570，P=0.003）（圖3B）。WB結果顯示，miR-34amimic（100nM）（0.49±0.03）組中MET蛋白表達低于對照mock組（0.79±0.03），差異有統計學意義（t=15.790，P=0.004，圖3C）。

2.3 過表達miR-34a聯合ARS-1620對H2030轉移的影響

為了探究聯合用藥的效果，本研究分為con組、mock+DMSO組、miR-34a-5pmimic組、ARS-1620組和miR-34a-5pmimic+ARS-1620組Transwell實驗結果顯示，miR-34a-5pmimic+ARS-1620組（551.70±53.29）細胞轉移數量顯著低于mock+DMSO組（1421.00±28.02），差異有統計學意義（t=25.020，P<0.05）。見圖4。

3 討論

臨床腫瘤治療中常表現出對藥物的耐藥性，多種藥物協同治療是臨床上的最優選擇。miR-34a與其他藥物協同治療取得了一定效果，已有研究表明，治療肺癌可協同多個miRNAs同時靶向多個致癌因子，由此癌癥相關旁路同時被抑制，發生耐藥的概率降低[6]。IGF1R、mTOR抑制劑和ARS-1620組合可抑制KRAS突變下游PI3K-AKT和RAF-MEK-ERK信號通路的傳遞，并完全抑制S6磷酸化，誘導肺腫瘤消退[9]。miRNAs是一類對基因表達有調節作用的非編碼小分子核糖核酸，異常miRNAs通過其靶基因異常表達從而對細胞產生影響，導致許多疾病，如NSCLC[10-12]。miR-34a異常表達是NSCLC患者復發的不良預測因子，所以恢復miR-34a表達對于NSCLC治療方面具有一定效果[13-14]。miR-34a靶基因MET是除EGFR、ALK和ROS1之后在NSCLC中的另一個重要腫瘤驅動基因和治療靶點，抑制MET蛋白表達對治療NSCLC有一定效果[15]。本研究發現，miR-34a在H2030中表達下降，當恢復miR-34a表達后顯著抑制MET表達并一定程度抑制癌細胞轉移。本研究發現，KRASG12C抑制劑ARS-1620聯合miR-34amimic共同作用于H2030可顯著抑制其遷移，效果顯著于單一使用miR-34amimic處理H2030。

綜上所述，將miR-34a和KRASG12C作為靶點是一種很有前景的治療方案。但NSCLC的發展涉及到復雜信號通路，需要和其他靶向藥物甚至是放化療整合到臨床治療方案中。如何將不同治療方案結合起來將是臨床的一個挑戰。