基于網絡藥理學的固本防疫方防治新型冠狀病毒肺炎的作用機制研究

摘 要：為了對固本防疫方防治新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的活性成分、靶點及其關鍵基因、潛在信號通路進行分析，為固本防疫方防治COVID-19提供一定的理論參考依據，通過復方活性成分和靶點收集、藥物-疾病共同靶點篩選、固本防疫方組方藥物成分-靶點-疾病網絡構建、蛋白質互作網絡（PPI）構建及核心靶點分析、基因本體（GO）以及京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，研究并預測固本防疫方防治COVID-19的作用機制。研究發現，在固本防疫方中，防風色酮醇、川白芷內酯、刺果甘草查耳酮、光甘草定、異黃烷酮、華良姜素、漢黃芩素、異鼠李素、山柰酚、橙皮素等是發揮防治作用的活性成分。PPI構建結果表明，核心基因為AKT1、TNF、IL6、VEGFA、HSP90AA1。GO分析結果表明，細胞因子產生的正調節、防御反應的積極調節、蛋白質轉運的正調控、病毒受體活性等機體調控均有正向作用。KEGG分析結果表明，該固本防疫方對COVID-19、甲型流感等流行性傳播疾病均有一定的防治效果。研究可得結論：固本防疫方的主要作用途徑可能是機體免疫系統的正向調節，降低重癥率，縮短確診患者的愈后時間，可為中醫藥防治新型冠狀病毒引起的急性炎癥反應提供理論依據。

關鍵詞：新型冠狀病毒肺炎；網絡藥理學；固本防疫

2019年年底，新型冠狀病毒所導致的急性呼吸道傳染病在全球肆虐，對人們的健康、社會經濟等均造成了巨大的負面影響。新型冠狀病毒變異力極強，目前Omicron株已經完全取代Delta株成為全球主要流行株，其傳播力明顯強于之前的所有毒株[1]，且有可能繼續變異。在我國印發的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》中，國家衛生健康委員會推薦采用中西醫聯合療法對新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）進行治療以及預防[2]。重慶市潼南區中醫院專家對變異性極強的新型冠狀病毒以預防為主，提倡早發現、早治療，根據“三因制宜”原則，針對重慶防治COVID-19提出的固本防疫方已推廣至潼南區COVID-19的定點救治點與隔離點，顯著緩解了輕型患者的臨床癥狀，減緩了轉為危重癥的發生趨勢。固本防疫方投入使用以來，在潼南區已用于萬余次COVID-19隔離點與治療點的群眾治療，但其發揮防治效果的有效成分及作用機制尚不明確且尚未進行系統研究。

中藥網絡藥理學主要從中醫的辯證論治與基于人體的整體觀出發探索中藥對疾病的作用與治療關系，以闡釋中藥復方“多組分、多靶點、多途徑”的藥理學機制[3]。因此，本研究采用網絡藥理學的研究方法，模擬研究多成分、多靶點藥物固本防疫方防治COVID-19的活性成分、靶點及其關鍵基因、潛在信號通路，旨在預測固本防疫方對COVID-19發揮防治作用的機制及原理。

1 " 材料與方法

1.1 "收集與篩選固本防疫方的有效成分與靶點

本研究使用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）檢索黃芪、蒼術、貫眾、防風、陳皮、甘草的成分作為潛在活性成分，設定口服利用度（Oral Bioavailability，OB）不低于30%、類藥性（Drug Likeness，DL）不低于0.18為閾值條件進行篩選，獲得固本防疫方的活性成分，將篩選所得結果導入Swiss Target Prediction數據庫，得到靶標作為藥物靶點（以預測指標大于0為篩選指標）。

1.2 "新型冠狀病毒靶點的確定

在Genecards數據庫、人類在線孟德爾遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）以“novel coronavirus pneumonia”為關鍵詞檢索，獲得新型冠狀病毒的作用靶點。

1.3 "篩選藥物-疾病的共同靶點

在Venny2.1在線軟件作圖工具平臺輸入所獲得的固本防疫方藥物靶點和疾病靶點，兩者取交集后獲得藥物-疾病的共同靶點。

1.4 "中藥-成分-靶點-疾病網絡構建

使用Cytoscape 3.8.2軟件構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖，使用Network Analyzer功能對固本防疫方活性成分進行分析與整理。

1.5 "蛋白質互作網絡（PPI）構建及核心靶點分析

將1.3中獲得的共同靶點輸入蛋白互作數據庫（Search Tool for the Retrieval of Interaction Gene/Proteins，STRING）中進行檢索，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，以0.4作為最低相互作用閾值，獲取靶點相互作用的網絡關系數據，通過Network Analyzer工具進行拓撲分析獲得核心靶點。

1.6 "基因本體（GO）富集

基于R軟件使用Bioconductor生物信息軟件包，篩選指標為“P-value＜0.05”，“Q-value＜0.05”，進行固本防疫方防治COVID-19關鍵靶基因的基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析。

2 " 結果

2.1 "藥物成分及靶點的篩選

在TCMSP數據庫中篩選出固本防疫方（黃芪、蒼術、陳皮、防風、甘草、貫眾）的活性成分151個，通過Swiss Target Prediction數據庫篩選出2 446個藥物靶點，其中，蒼術成分9個、預測靶點225個，陳皮成分5個、預測靶點167個，防風成分18個、預測靶點499個，甘草成分92個、預測靶點777個，貫眾成分7個、預測靶點349個，黃芪成分20個、預測靶點429個。

2.2 "疾病作用的篩選

在OMIM、Genecards數據庫以“novel coronavirus pneumonia”為關鍵詞分別進行檢索，去掉兩個數據庫所得到的重復靶點后，共獲得疾病靶點1 008個。

2.3 "藥物-疾病共同靶點的篩選

將2.1與2.2獲得的靶點結果輸入Venny2.1在線軟件作圖工具平臺，得到藥物-疾病交集結果，獲得共同靶點165個。

2.4 "疾病-靶點-藥物成分網絡構建及分析

在軟件Cytoscape 3.8.2中輸入2.3中的共同靶點，得到“活性成分-靶點-新型冠狀病毒”相互作用的網絡圖（見圖1）。對網絡圖結果進行拓撲分析，篩選出Degree值前50的固本防疫方活性成分，顯示該成分與作用靶點的關聯個數，其大小作為評判原則，得出固本防疫方由防風色酮醇、川白芷內酯、刺果甘草查耳酮、光甘草定、異黃烷酮、華良姜素、漢黃芩素、異鼠李素、山柰酚、橙皮素等成分發揮防治作用。

2.5 "PPI網絡構建及核心靶點的結果分析

將2.3中獲得的數據導入軟件Cytoscape 3.8.2中，得到蛋白網絡圖，并對所得結果進行拓撲分析。分析結果表明，核心基因為AKT1、TNF、IL6、VEGFA、HSP90AA1。

2.6 "富集結果分析

本研究基于R軟件使用Bioconductor生物信息軟件包獲得固本防疫方的生物富集分析結果。在富集分析過程中，將165個共同靶點經R語言運行后，GO分析選取生物學過程、分子功能、細胞組分共3個部分的分析結果，得到2 399條生物學過程通路，可見固本防疫方主要通過對細菌來源分子的反應、細胞對化學應激的反應、脂多糖的反應、防御反應的積極調節以及蛋白質轉運的正調控、細胞因子產生的正調節、蛋白質定位建立的正調控、細胞蛋白定位的正調控等生物過程對機體產生作用；交集基因共富集得到96個細胞組分表達過程，可見固本防疫方主要通過膜微區囊泡腔、質膜外側面、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶等細胞組分對機體產生作用；交集基因共富集得到169個與分子功能相關的過程，從結果可見固本防疫方主要通過蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶、外源蛋白結合等分子功能對人體發揮作用。165個共同靶點經R語言運行后共得到京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路179條，形成KEGG功能富集排序前20的結果，由此可見，固本防疫方對COVID-19、甲型流感、HIF-1信號通路等均有一定的防治效果。

3 " 討論

本研究應用網絡藥理學探索潼南區中醫院專家制定的固本防疫方對COVID-19的防治作用。通過蛋白質互作網絡（Protein-Protein Interaction Networks，PPI）構建研究發現，固本防疫方對COVID-19發揮作用的核心基因為AKT1、TNF、IL6、VEGFA、HSP90AA1。通過GO富集研究發現，固本防疫方對細胞因子產生的正調節、防御反應的積極調節、蛋白質轉運的正調控、病毒受體活性等機體調控均有正向作用，對COVID-19、甲型流感等流行性傳播疾病均有一定治療效果。分析固本防疫方防治COVID-19的有效活性成分作用機制發現，方中華良姜素、橙皮素、川白芷內酯、歐前胡素、漢黃芩素、異鼠李素、防風色酮醇、山柰酚、刺果甘草查耳酮、光甘草定、異黃烷酮等活性成分可抑制新型冠狀病毒對機體攻擊時所產生的炎癥反應，同時以上成分具有可調節機體的正向免疫作用。

《瘟疫論》認為“疫者，感天行之癘氣也”，即“疫”為自然界疫癘之氣[4]。《黃帝內經》對疫病的防治早有記載：“不相染者，正氣存內，邪不可干，避其毒氣。”[5]對于變異性極強、傳染性極強的新型冠狀病毒所導致的COVID-19，目前暫無可針對性治療的特效藥。因此，提高人體免疫力對新型冠狀病毒所引起的急性肺炎防治極其重要且關鍵。

[參考文獻]

[1]袁志鷹，林軼，李亮，等.基于網絡藥理學和分子對接法的新型冠狀病毒肺炎湖南省預防1號方作用機制探討[J].時珍國醫國藥，2020（10）：2411-2415.

[2]劉云濤，王進忠，鄭丹文，等.《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》中醫藥部分更新解讀[J].廣東醫學，2022（6）：661-663.

[3]李錦英，張兆萍，葉金飛，等.基于網絡藥理學的菟絲子-枸杞子藥對治療卵巢早衰的作用機制研究[J].中國藥房，2020（18）：2202-2209.

[4]郭薇薇，倪磊，李磊.基于吳又可《瘟疫論》探討新型冠狀病毒肺炎的診治[J].江蘇中醫藥，2020（52）：14-15.

[5]郭靄春.黃帝內經素問校注[M].北京：人民衛生出版社，1992.