梨火疫病菌在庫爾勒香梨枝條中的侵染定殖和擴展特征研究

摘要：【目的】示蹤梨火疫病菌Erwinia amylovora 在庫爾勒香梨（Pyrus sinkiangensis Yu）（簡稱香梨）枝條組織中侵染定殖和擴展特征，為梨火疫病的有效防治提供依據。【方法】以分離獲得梨火疫病強致病力菌株E. a001 為材料，采用熱激法將攜帶有綠色熒光蛋白基因（green fluorescent protein，GFP）質粒phc60-gfp 轉化E. a001，獲得了能發出強烈綠色熒光的標記菌株E. a001-gfp。利用該標記菌株接種香梨枝條，檢測、觀察其在香梨枝條組織中的侵染定殖和擴展動態。【結果】針刺接種和噴霧接種E. a001-gfp 引起枝條發病的最低濃度分別為106 cfu·mL-1和107 cfu·mL-1。相同濃度的病原菌接種，噴霧接種較針刺接種后發病顯癥時間延遲2～3 d。梨火疫病菌侵染枝條產生的壞死病斑的擴展速率隨病原菌濃度提高而升高；病菌在1 年生枝條上的生長擴展速度顯著快于在2 年生枝條內的擴展速度。梨火疫病菌入侵后主要存在于枝條維管系統中，大量分布于皮層薄壁細胞和韌皮部薄壁細胞間隙，少量存在于木質部導管中。在香梨發病枝條上，病健交界處的活菌數量最高，可達到108 cfu·g-1，未顯癥部位0～10 cm處病原菌為105 cfu·g-1，但在香梨枝條病斑外未顯癥部位10～15 cm處均未分離出病原菌。【結論】研究明確了梨火疫病菌在香梨枝條組織中的擴展距離、遷移時間及速率，以及分布及定殖量，為病枝的準確修剪和制定病害的綜合防控措施提供了科學依據。

關鍵詞：庫爾勒香梨；梨火疫病菌；綠色熒光蛋白基因標記；侵染；擴展

中圖分類號：S661.2 S436.612 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）08-1692-11

梨火疫病是由解淀粉歐文氏菌Erwinia amylovora侵染梨、蘋果等多種薔薇科仁果類果樹、造成毀滅性危害的重大國際檢疫性細菌病害[1- 2]。該病害于1780年首次報道于美國紐約，現分布于北美、歐洲、北非、中東和大洋洲等近60多個國家和地區[3]。近年來梨火疫病又傳播至亞洲的日本、哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦等國，2016—2017年相繼在中國新疆伊犁、巴州等地首次被發現，危害梨、蘋果、山楂、海棠、溫桲等果樹，尤其在庫爾勒香梨（簡稱香梨）上傳播極為迅速，造成大批梨樹被砍伐、果園被毀的巨大損失，給香梨生產帶來重創。該病害近期已傳播至甘肅張掖等地區，目前在中國尚屬局部發生，現已被中國列入《一類農作物病蟲害名錄》和《重點管理外來入侵物種名錄》，對中國林果安全生產帶來了巨大威脅和風險[4-5]。國外針對梨火疫病的病原學、檢測技術和預測預警、流行規律和防治技術等開展了大量研究，提出了包括化學防治、生物防治、抗病品種選育、轉基因技術和果園苗圃的綜合治理等多種防控措施。但目前果樹抗病品種匱乏，專門的防治藥劑有限，也沒有能高效控制病害的單一措施，至今病害依然是威脅梨和蘋果產業的突出問題[6]。已有研究表明，梨火疫病菌E. amylovora 在寄主組織中快速轉移的侵染特征是造成病害流行速度快、毀滅性危害和防治難度大的重要原因。梨火疫病菌通過傷口和自然孔口侵入寄主多個部位，造成花器、葉片、幼果變黑凋萎、新梢枯死。易感寄主在氣候條件適宜時，病原菌從病梢快速擴展到枝條、樹干，直至砧木和根部，嚴重時可在幾周或1 至幾個生長季導致全株枯死；病原菌在感病果樹枝干的潰瘍斑、枝條及病果，以及不表現癥狀的組織上越冬，還可在木質部導管中存活多年，難以根除。春季病原菌在病灶處大量繁殖作為當年的初侵染源，通過風雨、昆蟲、鳥類及田間操作將病原菌傳至寄主上造成初次侵染和再次侵染[7-8]。因此及時修剪發病果樹的病枝，不僅可以大大降低病原菌的菌源量，還能阻止其在樹體中的遷移擴展，是簡便易行、經濟有效的病害防控的重要措施。明確梨火疫病菌在不同寄主組織內生長及擴展特性，對深入了解梨火疫病菌的發生流行規律以及病害的科學防控具有重要的指導意義。

國外研究者對梨火疫病菌的侵入及在寄主體內的定殖和遷移擴展曾采用生物學、細胞學和組織學的方法開展過一些研究，但該病原菌寄主種類的多樣性和研究手段及方法的局限性，仍然存在諸多問題，一直沒有獲得確定的結果[9]。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）具有熒光性質穩定、直觀、操作方便和不需添加外源底物就可以在實時、原位條件下對活細胞直接檢測等優點，已廣泛應用于病原菌與寄主植物的互作過程和示蹤觀察的研究中[10-11]。1988 年，Bogs 等[12]首次利用GFP 作為報告基因標記梨火疫病菌，觀察到其通過蘋果枝條韌皮部進入木質部的侵染過程，并證明病原菌在破壞木質部導管后可以定殖到薄壁組織的細胞間隙。Heyens等[13]利用GFP 標記技術發現梨火疫病菌在蘋果葉片的侵染主要沿葉內主脈遷移，從主脈到葉肉和側脈的遷移速率較慢。梨火疫病是近期在中國香梨生產區突發的流行病害，香梨作為梨火疫病的高感品種，梨火疫病菌在香梨枝條中的侵染定殖和擴展動態的研究未見報道。

本研究以分離獲得梨火疫病強致病力菌株為材料，對其進行綠色熒光蛋白報告基因標記，通過人工接種示蹤病原菌在香梨枝條組織中侵染定殖和遷移特征，為深入了解病原菌在寄主組織內的侵染擴展過程及機制，掌握病害發生流行規律，指導田間病枝修剪、抗病品種選育和制定綜合防治措施提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 供試病原菌和質粒

梨火疫病菌：Erwinia amylovora，E. a001 菌株，由新疆農業大學農業微生物與生物技術實驗室從新疆庫爾勒市香梨園梨火疫病樹病枝中分離、鑒定和保存，致病力測定為強致病力菌株。質粒：宿主菌為E. coli DH5α，攜帶gfp 基因并具有卡那霉素（50 μg·mL-1）抗性篩選標記的phc60-gfp質粒載體，由南京農業大學植物保護學院胡白石教授惠贈。

1.2 供試培養基

梨火疫病菌和大腸桿菌培養采用LB（Luria-Bertani）培養基；感受態細胞復蘇培養基為LB+0.5 mol·L-1山梨醇+0.38 mol·L-1甘露醇。

1.3 供試植株材料

以庫爾勒市巴州農科所日光試驗果溫室中栽培的4年生香梨樹的枝條和葉片作供試植株材料。

1.4 梨火疫病菌標記菌株的構建及驗證

參考王穎[14]的方法并略作修改，將phc60-gfp 質粒熱擊轉化到E. a001 菌株的感受態細胞中。先將制備好的E. a001 感受態細胞置于冰上凍融，42 ℃水浴鍋中熱激90 s 后，迅速轉移置于-40 ℃冰箱放置3 min，然后每管加37 ℃預熱的LB 復蘇培養基400 μL，32 ℃、180 r ·min-1復蘇培養30 min，將復蘇后的培養物涂布于LB（加入Km 50 μg ·mL-1）平板上，37 ℃恒溫培養過夜，通過倒置熒光顯微鏡（NikonECLIPSE Ts2R-FL）檢測菌落熒光。挑取陽性轉化子用GFP特異性引物（gfp-F：5’-ATGAGTAAAGGAGAAGAACT- 3’；gfp- R：5’-TTATTTGTATAGTTCATCCATG- 3’，Size：700 bp）分別對轉化子與野生菌株進行菌落PCR 擴增和電泳檢測，將擴增出目的基因的陽性轉化子命名為E. a001-gfp。

1.5 E. a001-gfp 標記菌株的生物學特性

1.5.1 遺傳穩定性測定參照任嘉紅等[15]的方法，挑取已長出的E. a001-gfp 單菌落接種至LB液體培養基中，28 ℃、200 r ·min-1培養過夜，以獲取的菌懸液為種子液按1%的接種量接種至無抗生素LB培養液中，每次隔12 h 接種到新鮮50 mL的LB液體培養基中培養。分別在培養12、24、36、48、60、72、84、96 h時取100 μL菌液涂布到不含抗生素的LB平板上培養過夜。用接種針隨機挑取100 個單菌落，點接至LB（加入Km 50 μg ·mL-1）培養基平板上，24 h 后計數平板生長菌落數，以熒光菌落數所占總菌落數百分比計算菌株的遺傳穩定性。

1.5.2 生長曲線測定將E. a001-gfp 和原始菌株E. a001 分別加入無抗生素的LB 培養液中，28 ℃、200 r · min-1培養OD600=1.0 左右。按照1%的比例分別接至LB培養液中，28 ℃、200 r·min-1振蕩培養，每隔2 h 測量一次OD600值，繪制生長曲線。1.5.3 標記菌株的致病性測定取健康香梨離體葉片，用0.5%次氯酸鈉浸泡10 min 進行表面消毒，用無菌水浸泡漂洗3 次。用無菌牙簽在葉片的葉柄基部扎孔，用移液槍分別滴加5 μL的E. a001-gfp 和E. a001 菌懸液（濃度為108 cfu ·mL-1），每個處理20枚葉片，以接種無菌水為對照。接種后將葉片置于培養皿中，28 ℃下保濕培養，觀察發病時間并用游標卡尺測量病原菌沿葉脈擴展的病斑長度。

1.6 接種E. a001-gfp 標記菌株在香梨枝條組織中的侵染和遷移擴展動態

1.6.1 不同濃度的E. a001-gfp 菌懸液的制備將E.a001-gfp 菌株在LB 培養基上活化，挑取單菌落接入LB（加入Km 50 μg · mL- 1）培養液中，在28 ℃、160 r · min-1 震蕩培養OD600=1.2 左右。用無菌水將培養液稀釋至106、107、108和109 cfu ·mL-1不同濃度的菌懸液。1.6.2 香梨枝條上接種E. a001-gfp 及其在枝條中的遷移擴展測定在試驗溫室供試香梨植株上選取長勢一致的1 年生、2 年生枝條，分別采用針刺法和噴霧法接種E. a001-gfp 菌懸液。（1）針刺法接種：在香梨幼嫩枝條距頂梢5 cm 左右處用無菌牙簽刺傷約0.5 cm的傷口，用移液槍吸取10 μL不同濃度的菌懸液滴入傷口，在接種點上方1 cm處包裹一圈無菌水浸潤的無菌棉條，再用保鮮膜將接種部位同脫脂棉條一起包裹好保濕24 h 后去除接種位點上方塑料薄膜和脫脂棉；（2）噴霧法接種：將不同濃度的菌懸液裝入手持式壓力噴壺中，將菌液均勻噴施在香梨枝條頂梢約10 cm 處至葉片與枝條完全濕潤，套袋保濕24 h。每個菌懸液濃度處理接種20 個枝條，以接種無菌水作為對照。接種后每天定時觀察枝條發病情況，測定并記錄發病香梨植株枝條上病斑擴展的距離、時間，計算遷移速度。

1.7 接種E. a001-gfp 標記菌株在香梨枝條組織中的定殖

1.7.1 E. a001-gfp 在香梨枝條組織中的定殖量在試驗溫室種植的4 年生香梨植株的當年生幼嫩枝條上，采用1.6.2 針刺法接種E. a001-gfp 菌懸液（濃度為109 cfu 穖L-1）。接種后9、19、40 d 分別從發病枝條頂梢處、病健交接處和未顯癥部位取樣，用75%的酒精浸泡1 min，1%次氯酸鈉浸泡2～3 min，再用無菌水沖洗3～4 次。取最后一次無菌水沖洗液100 μL涂布于LB培養基，置于28 ℃恒溫箱中培養2 d。取表面滅菌徹底的樣品放入滅菌的研缽中，加入PBS緩沖液將組織充分研磨，將上清液加入試管無菌水中充分混勻制成不同稀釋度的稀釋液。每個梯度稀釋液吸取100 μL加在LB（含50 μg穖L-1的Km）平板培養基上，用無菌涂布器均勻涂布后放入28 ℃培養箱，培養2 d。在倒置熒光顯微鏡下觀察、統計平板上長出的具有綠色熒光的菌落，計算出病原菌在枝條不同部位的定殖量（cfu穏-1）。

1.7.2 E. a001-gfp 在香梨枝條組織中定殖位點的顯微觀察采用1.6.2 的方法對香梨1 年生枝條針刺接種E. a001-gfp。于接種10 d 后取發病枝條的不同部位（接種點，距接種點不同距離，顯癥和未顯癥部位）1 cm的片段在冷凍切片機（賽默飛CryoStar NX50 ）上橫切、縱切制作組織切片，置于激光共聚焦掃描顯微鏡下（TCS SP8 STED 3X），在GFP 的激發波長（488 nm），熒光檢測波長（495～515 nm）下觀察在香梨枝條表皮、皮層、韌皮部、維管束、木質部和導管組織中標記菌株的分布，拍照并分析。

1.7.3 E. a001-gfp 在離體香梨枝條中的存活能力檢測將1.7.1 接種E. a001-gfp 發病的香梨枝條剪下，裝入牛皮紙袋放置在實驗室室溫下保存，每個月抽取6 個病枝，采用1.7.1 的組織分離法進行病原菌的分離，檢測病枝條中存活的病原菌數量。

2 結果與分析

2.1 梨火疫病菌E. a001-gfp 轉化子的獲得和鑒定

采用熱激轉化法將攜帶gfp 基因的質粒phc60-gfp 導入梨火疫病菌E. a001 感受態細胞中。挑取在LB 選擇性抗生素平板上長出的菌落，在熒光顯微鏡下觀察可見菌落和菌體均發出強烈的綠色熒光（圖1-B，C）；抗性菌落呈乳白色、半球形隆起狀，表面濕潤，光滑，半透明（圖1-A），菌體為短桿狀，與野生菌株無差異，而野生菌株不發熒光。用gfp 基因特異性引物對陽性轉化子、野生菌株E. a001 進行PCR檢測，結果顯示在陽性轉化子基因組、含gfp 基因的質粒DNA中均能擴增出大小約700 bp 的目標條帶，而野生菌株中擴增不到目的片段（圖2），表明gfp 基因已成功轉入到E. a001 的基因組中并在細胞中成功表達，將標記菌株命名為E. a001-gfp。

2.2 E. a001-gfp 標記菌株的生物學特性

2.2.1 E. a001-gfp 遺傳穩定性檢測遺傳穩定性檢測結果顯示（表1），E. a001-gfp 標記菌株在不含抗生素的LB培養基中每隔12 h連續繼代培養8次后，菌落保持強烈的綠色熒光，質粒保持率為99%以上。結果表明，gfp質粒可在E. a001中穩定遺傳且表達良好。

2.2.2 標記菌株與野生菌株的生長曲線比較測定比較標記菌株與野生菌株的生長曲線（圖3）。在相同培養條件下，標記菌E. a001-gfp 與野生菌株E. a001均在生長6 h 后進入指數期，約24 h 后，進入穩定期，生長曲線的變化趨勢基本相同（圖3）。結果顯示，外源基因gfp的轉化和表達未影響標記菌株E. a001-gfp的生長，其生長速率與野生菌株基本一致。

2.2.3 標記菌株與野生菌株的致病性比較在香梨葉片上針刺接種標記菌株E. a001-gfp 和野生菌株E. a001，比較其致病性（圖4）。E. a001-gfp和E. a001在香梨葉片上產生病斑的顯癥時間無差異，均在接種后3 d 可見病原菌開始沿主葉脈擴展，擴展距離略有差異，分別為4.1 cm和3.9 cm，但差異不顯著（p＞0.05）。結果表明，E. a001-gfp 標記菌株的侵染能力和致病性與野生菌株相似，可以將其用于接種測定病原菌在寄主組織中的侵染過程的功能菌株。

2.3 E. a001-gfp 標記菌株在香梨枝條中的遷移擴展特征

2.3.1 針刺法接種標記菌株在香梨枝條中的侵染擴展距離、遷移時間和速率采用針刺法在香梨樹1年生、2 年生枝條上接種E. a001-gfp 菌液，觀察測定病原菌的侵染和在枝條組織中的遷移擴展情況。試驗結果表明（圖5，表2），接種不同濃度E. a001-gfp 菌液，從針刺傷口侵染產生的壞死病斑在枝條中的擴展距離、遷移時間及速率均有明顯差異。在香梨1年生幼嫩枝條上接種，當病原菌濃度為105 cfu ·mL-1 時僅局限在傷口處變黑，病斑不擴展；病原菌濃度為106 cfu ·mL-1時，接種3 d 后枝條上開始出現黑色壞死病斑，5 d 后病斑才逐漸開始擴展，之后擴展迅速；濃度為107、108和109 cfu·mL-1病原菌接種后2 d 枝條上即出現黑色壞死病斑并擴展，擴展速率隨病原菌濃度的增加而提高，108 cfu·mL-1病原菌在枝條中的擴展最快，速率可達3.95 cm· d-1，顯著高于其他濃度。濃度≥106 cfu·mL-1病原菌接種后侵染香梨枝條組織產生壞死病斑并上下遷移的時間為10～15 d（平均13.5 d），病斑擴展距離為38.06～45.31 cm（平均42.55 cm），其中106、107 cfu·mL-1接種處理的枝條病斑遷移持續時間最長（15 d），109cfu ·mL-1接種處理的枝條病斑的遷移時間持續最短（10 d）；108 cfu·mL-1濃度的病原菌接種處理的病斑擴展最長（45.31 cm）。在2 年生枝條上針刺接種，病原菌濃度為105 cfu · mL- 1 時僅局部變色，病斑不擴展；濃度≥106 cfu ·mL-1病原菌接種后8～12 d 才開始出現病斑癥狀并緩慢擴展，擴展距離為3.05～3.86 cm（平均3.46 cm），15 d 后病斑不再擴展。

2.3.2 噴霧接種標記菌株在香梨枝條中的擴展距離、遷移時間和速率在香梨樹1 年生、2 年生枝條上采用噴霧法接種不同濃度的E. a001-gfp 菌液。試驗結果表明（圖6，表3），在1 年生枝幼嫩枝條上，濃度為≤106 cfu ·mL-1病原菌接種后枝條不顯癥；濃度為107 cfu·mL-1病原菌接種后5～6 d 在頂梢處開始出現黑色壞死病斑并沿枝條逐漸向下擴展；濃度為108 cfu·mL-1和109 cfu·mL-1病原菌接種后2 d 即開始顯癥并沿枝條擴展，108 cfu·mL-1接種處理的病斑擴展最快，擴展速率可達4.06 cm·d-1。濃度≥107 cfu·mL-1的接種處理，枝條病斑的遷移時間為15 d，之后病斑長度不再增加；病斑擴展距離為38.89～47.27 cm（平均43.08 cm），108 cfu·mL-1接種處理的病斑擴展最長（47.27 cm）。

在2年生枝條上噴霧接種病原菌濃度≤107 cfu·mL-1均不出現癥狀，濃度≥108 的接種處理后10 d 開始出現病斑并擴展，擴展距離為2.05～3.9 cm（平均2.96 cm），15 d 后病斑不再擴展。

2.4 E. a001-gfp 標記菌株在香梨枝條組織中的定殖

2.4.1 標記菌株在香梨枝條中的定殖量在4 年生香梨植株的當年生幼嫩枝條上距頂梢5 cm 處針刺接種E. a001-gfp 菌懸液。在接種后分別從發病枝條頂梢、病健交界和未顯癥部位取樣，通過選擇性抗性平板進行組織分離，結合菌落熒光觀察，測定標記菌株在枝條不同部位中的活菌定殖量。結果顯示（表4），在接種后9～40 d，從感病枝條的頂梢、病斑和健康組織的交接處及未顯癥的0～10 cm枝條部位均能檢測到活病原菌的定殖。在感病枝條的病健交界組織中的病原菌最為集中，活菌定殖量最大。接種后第9 天定殖量可達到1.40×108 cfu·g-1，之后隨著侵染時間延長有所下降并維持穩定，至40 d時可保持在2.50×106 cfu·g-1。其次，活菌定殖量較多的部位是在感病枝條的頂梢部位。接種后第9 天定殖量可達到1.40×107 cfu · g-1，40 d 后下降至3.50×104 cfu · g-1。在感病枝條的未顯癥部位0～10 cm 有病原菌定殖，定殖量為8.00×101～7.05×105 cfu · g-1，40 d 后在該部位仍能分離出活菌。但在感病和枝條未顯癥部位10～15 cm組織中未分離出病原菌。

2.4.2 標記菌株在香梨枝條內定殖的顯微觀察在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察接種E. a001-gfp 感病的香梨枝條。由圖7 可見，接種10 d 后，在感病枝條組織中E. a001-gfp 標記菌株主要定殖于維管系統中，大量分布于皮層薄壁細胞和韌皮部薄壁細胞的細胞間隙，有少量存在于木質部導管中。

2.5 標記菌株在香梨離體枝條中的存活能力

E. a001-gfp 標記菌株在離體香梨枝條中存活力的測定結果如圖8 所示。感病枝條在室溫下存放1 個月后檢出病原菌活菌量為108 cfu ·g-1，之后逐漸下降，3 個月時活菌數下降至106 cfu·g-1，4 個月后仍能在病枝中分離到105 cfu·g-1的活菌量。

3 討論

GFP 作為報告基因，在定性和定量監測功能微生物菌株在環境中的動態、微生物與宿主的相互作用，示蹤病原菌對宿主組織侵染過程、空間定位和基因表達調控等研究中得到了廣泛應用。有研究發現，GFP在微生物細胞內的高效表達會造成一些標記菌株的代謝負擔，影響其遺傳穩定性、生理代謝活動和生物學功能的發揮[16]。因此標記菌株的生長，生理生化特性、致病力及遺傳穩定性等，與原始菌株相比是否有較大的變化都會直接影響到該菌株的研究和應用價值。馮永君等[17]比較成團泛菌YS19 的GFP標記菌株及其野生菌株的生長情況，發現標記菌株最大比生長速率和最大生物量減少12.4%和6%，代時延長14.0%。張昕等[18]報道的在無選擇壓力標記菌株ZJY-116G連續傳10 代，GFP 質粒保存率是69.3%。筆者在本研究中成功將攜帶GFP基因的質粒導入梨火疫病菌E. a001 菌株中，標記菌株E. a001-gfp 與野生菌株E. a001 的菌落形態無差異，生長曲線基本一致，致病力相當，無顯著差異；同時在無抗生素的選擇壓力條件下多次繼代培養后質粒的保持率仍能達到99%以上，并且保持強烈的綠色熒光，表明GFP重組質粒在E. a001-gfp 菌株中能穩定遺傳和基因表達，可用于示蹤研究病原菌在寄主組織中的侵染過程的功能菌株。

梨火疫病菌從香梨枝條嫩梢侵入是病原菌的另一個重要侵入途徑，梨樹新梢生長期也是病害發生的另一個高峰期。為掌握病原菌對枝條嫩梢侵入、擴展遷移的規律，本研究在香梨樹枝條上采用不同濃度的E. a001-gfp 標記菌株菌液通過針刺和噴霧2種方法接種，比較病原菌侵入枝條組織發病顯癥的時間及病斑擴展距離、速率和遷移時間等。試驗結果表明，針刺接種引起枝條發病的最低病原菌濃度為106 cfu·mL-1，低于噴霧接種（107 cfu·mL-1）。相同濃度的病原菌接種，噴霧接種較針刺接種后發病，顯癥時間延遲2～3 d。這可能是因為噴霧接種病原菌主要通過枝條表皮上的皮孔、氣孔等的自然孔口入侵，進入組織內的病原菌量有限，而針刺接種病原菌更容易通過傷口穿透表皮進入皮層組織中，更利于病原菌的快速生長和擴展，在較短時間、較低的病原菌濃度下即可致病。研究結果為梨火疫病菌在香梨枝條上接種試驗提供了接種濃度和接種方法的參考。Sedlák 等[19]通過傷口法接種（105 cfu·mL-1）在蘋果嫩梢上接種時發現顯癥時間（5 d）較噴霧法提前了2 d，與本研究結果相似。但枝條發病的最低病原菌濃度對比本試驗結果（106 cfu 穖L-1）略低，可能由選用寄主植物的抗性、接種方法差異所致。筆者在本研究中發現，接種病原菌濃度顯著影響其在香梨枝條組織中的擴展速率，病原菌侵染枝條產生的壞死病斑的擴展速率隨病原菌濃度的增加而提高，108 cfu 穖L-1的病原菌濃度接種處理的病斑擴展速度最快，遷移速率可達3.95 cm？ d-（1 針刺接種）和4.06 cm？ d-（1 噴霧接種）。結果可見，外界的菌源量是影響病害侵染和發生程度的重要因素。

研究表明，在2 年生枝條上，針刺法與噴霧法接種下的梨火疫病菌的擴展速度慢，在1年生的枝條上擴展速度快，二者有顯著差異。分析認為，1 年生枝條生長旺盛，組織柔軟，有利于病原菌侵染；病原菌進入皮層薄壁組織，此部位細胞分布疏散、細胞間隙大，其中幼嫩多汁、富含淀粉，有利于病原菌的繁殖并隨運輸有機物的篩管遷移；而2年生枝條組織的次生木質化程度較高，對病原菌擴展起到了一定的阻隔作用，減緩和縮小了病原菌擴展遷移的速度和距離。

梨火疫病菌從寄主幼嫩枝條入侵，如控制不當不僅會造成病原菌迅速擴展進入大枝、主枝甚至主干，引起整株死亡，而且還是重要的侵染源，對病害的發生、傳播和流行至關重要[20]。對發病果樹在生長期和冬季休眠期及時修剪病枝，不僅能阻止其在樹體中的遷移擴展，還能從源頭上大大降低病原菌的菌源量，減少其傳播和擴散，對病害防治能達到事半功倍的效果。在生產中對病枝修剪，既要做到將帶有病原菌的枝條組織徹底清除，又要盡可能地保留健康組織，明確病枝條修剪的位置、長度、范圍及時間等是一個關鍵的技術問題。筆者在本研究中采用梨火疫病菌GFP標記菌株，通過選擇培養基分離培養結合熒光菌落鑒別，以及采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，明確病原菌在枝條中的定殖部位、定殖量及存活時間。結果表明，梨火疫病菌入侵后主要存在于維管系統中，大量分布于皮層薄壁細胞和韌皮部薄壁細胞間隙，少量存在于木質部導管中，與國外已報道病原菌的分布一致[21]。韌皮部在植物中起到運輸養料的作用，可雙向上下運輸，其中含有蔗糖等營養物質，適于病原菌生長和繁殖，是入侵病原菌在寄主組織中繁殖和定殖的主要部位，也是病原菌迅速擴展的重要原因。有研究認為，進入到木質部導管中的病原菌可在樹體內多年存活，一定條件下從木質部導管中擴散再次侵入皮層薄壁組織或侵入砧木，造成病害的再次暴發流行。這也是梨火疫病菌一旦入侵寄主樹體，在其中定殖造成病害難以控制和根除的重要原因之一。測定入侵病原菌在香梨發病枝條中的定殖指標，結果顯示，病健交接部位的活菌數量最高，可達到108 cfu ·g-1；枝條未顯癥部位0～10 cm 處病原菌最高可達到105 cfu ·g-1，在40 d 時壞死病斑部位仍能分離出活菌，但在香梨枝條病斑外未顯癥部位10～15 cm 處均未分離出病原菌。

Wilson 等[22]研究認為，在可見病變下方15～45 cm處修剪能有效控制病害，Clarke 等[23]建議在超過可見癥狀的20～25 cm處修剪，但未提出明確的依據。本研究結果證實了他們的結論，建議在梨火疫病感病的香梨枝條可見病斑20～30 cm處修剪病枝，能有效清除病源，是安全有效的修剪長度。對在室溫下保存的發病香梨離體枝條中的病原菌活菌數的檢測結果顯示，存放6 個月的病枝中檢出的梨火疫病菌活菌數為105 cfu·g-1數量級的病原菌。結果可見，病原菌可在發病枝條等組織中長時期存活，保持其侵染活性。如不及時修剪果園中的發病枝條或不及時清理出果園，則病殘體就成為重要的侵染源，通過風、雨、氣溶膠等傳播，造成病害的再次發生流行。因此及時修剪病枝和清園銷毀病枝等病殘體是病害防治的重要環節。

4 結論

梨火疫病菌侵染枝條產生的壞死病斑的擴展速率隨病原菌濃度的增加而提高；病原菌入侵枝條后主要存在于皮層薄壁細胞和韌皮部薄壁細胞間隙，少量存在于木質部導管中；病斑外未顯癥部位10～15 cm處均未分離出病原菌，建議在可見病斑外20～30 cm處修剪病枝，能有效清除病源。

參考文獻References：

[1] 胡白石，許志剛，周國梁，易建平，焦國堯. 梨火疫病的進境風險分析[J]. 植物保護學報，2001，28（4）：303-308.

HU Baishi，XU Zhigang，ZHOU Guoliang，YI Jianping，JIAOGuoyao. Primary risk analyses of import of erwinia amywvorato China[J]. Journal of Plant Protection，2001，28（4）：303-308.

[2] ZHAO Y Q，TIAN Y L，WANG L M，GENG G M，ZHAO W J，HU B S，ZHAO Y F. Fire blight disease，a fast- approachingthreat to apple and pear production in China[J]. Journal of IntegrativeAgriculture，2019，18（4）：815-820.

[3] 李洪濤，張靜文，盛強，唐章虎，張祥林，張春竹，羅明. 我國20個梨品種（種質）對國外梨火疫病菌的抗病性評價[J]. 果樹學報，2019，36（5）：629-637.

LI Hongtao，ZHANG Jingwen，SHENG Qiang，TANG Zhanghu，ZHANG Xianglin，ZHANG Chunzhu，LUO Ming. Resistanceevaluation of 20 pear varieties （germplasms） in China to foreignstrains of Erwinia amylovora[J]. Journal of Fruit Science，2019，36（5）：629-637.

[4] 中華人民共和國農業農村部. 農辦農（2021）12 號：全國農業植物檢疫性有害生物分布行政區名錄[EB/OL]. （2021-04-22）[2022-05-15]. https：//www.moa.gov.cn/nybgb/2021/202105/202-110/t20211021_6380164.htm.

Ministry of Agriculture and Rural Affairs of the People’s Republicof China. Agricultural Office of Agriculture （2021）No. 12：National agricultural plant quarantine pests distribution of theadministrative list[EB/OL]. （2021- 04- 22） [2022- 05- 15]. https：//www.moa.gov.cn/nybgb/2021/202105/202110/t20211021_6380-164.htm.[5] MALNOY M，MARTENS S，NORELLI J L，BARNY M A，SUNDIN G W，SMITS T H M，DUFFY B. Fire blight：Appliedgenomic insights of the pathogen and host[J]. Annual Review ofPhytopathology，2012，50：475-494.

[6] DOOLOTKELDIEVA T，BOBUSHEVA S. Fire blight diseasecaused by Erwinia amylovora on Rosaceae plants in Kyrgyzstanand biological agents to control this disease[J]. Advances in Microbiology，2016，6（11）：831-851.

[7] MARINOVA-TODOROVA M，RANTA J，HANNUNEN S. Thesuitability of Finnish climate for fire blight （Erwinia amylovora）epidemics on apple[J]. Agricultural and Food Science，2015，24（1）：59-66.

[8] AZEGAMI K，TSUKAMOTO T，MATSUURA T，OHARA T，INOUE Y，MIZUNO A，YOSHIDA K，BESSHO H，KIMURAS，GOTO M. Invasion and colonization of mature apple fruit byErwinia amylovora tagged with bioluminescence genes[J]. Jour- nal of General Plant Pathology，2004，70（6）：336-341.

[9] SANTANDER R D，CATALà-SENENT J F，FIGàS-SEGURAà，BIOSCA E G. From the roots to the stem：Unveiling pear rootcolonization and infection pathways by Erwinia amylovora[J].FEMS Microbiology Ecology，2020，96（12）：fiaa210.

[10] 賈娜娜，翟立峰，白晴，陳曉忍，王彩霞，洪霓，王國平. 腐爛病菌的GFP 標記及其在梨葉片組織中的侵染和擴展觀察[J]. 果樹學報，2015，32（6）：1195-1200.

JIA Nana，ZHAI Lifeng，BAI Qing，CHEN Xiaoren，WANGCaixia，HONG Ni，WANG Guoping. Marking of Valsa pyri withGFP and observing the infection and extension of markedstrains in pear leaf tissues[J]. Journal of Fruit Science，2015，32（6）：1195-1200.

[11] 陳卓，肖熙鷗，陳曙，李可，鄒華芬，金輝. 利用GFP 標記的Ralstonia solanacearum 鑒定馬鈴薯青枯病抗性[J]. 中國瓜菜，2021，34（1）：35-41.

CHEN Zhuo，XIAO Xiou，CHEN Shu，LI Ke，ZOU Huafen，JINHui. Identification of potato bacterial wilt resistance using GFPlabeledRalstonia solanacearum[J]. China Cucurbits and Vegetables，2021，34（1）：35-41.

[12] BOGS J，BRUCHMüLLER I，ERBAR C，GEIDER K. Colonizationof host plants by the fire blight pathogen Erwinia amylovoramarked with genes for bioluminescence and fluorescence[J].Phytopathology?，1998，88（5）：416-421.

[13] HEYENS K，VALCKE R. Fluorescence imaging of the infectionpattern of apple leaves with Erwinia amylovora[J]. Acta Horticulturae，2006（704）：69-74.

[14] 王穎. 生防芽孢桿菌ZA1 的GFP 基因標記及其定殖動態研究[D]. 蘭州：甘肅農業大學，2015.

WANG Ying. Study on labeling biocontrol bacteria BacillusZA1 with GFP and its colonization[D]. Lanzhou：Gansu AgriculturalUniversity，2015.

[15] 任嘉紅，劉輝，姜楠，魏玉宏，張冰，王瑩. GFP 標記溶磷草木樨中華根瘤菌CHW10B 及其定殖[J]. 林業科學，2015，51（1）：74-79.

REN Jiahong，LIU Hui，JIANG Nan，WEI Yuhong，ZHANGBing，WANG Ying. Sinorhizobium meliloti CHW10B strainGFP-labelling and its colonization associated with Taxus chinensisvar. mairei[J]. Scientia Silvae Sinicae，2015，51（1）：74-79.

[16] 董愛菊，邱慧珍，董莉，周洋子，陳蘭蘭，王友玲，王川. 類芽孢桿菌QHZ11-gfp 在馬鈴薯植株上的定殖特征及促生效果[J].微生物學通報，2021，48（11）：4075-4086.

DONG Aiju，QIU Huizhen，DONG Li，ZHOU Yangzi，CHENLanlan，WANG Youling，WANG Chuan. The colonization characteristicsof Paenibacillus jamilae QHZ11-gfp in potato plantsand its growth-promoting effect[J]. Microbiology China，2021，48（11）：4075-4086.

[17] 馮永君，宋未. 水稻內生優勢成團泛菌GFP 標記菌株的性質與標記丟失動力學[J]. 中國生物化學與分子生物學報，2002，18（1）：85-91.

FENG Yongjun，SONG Wei. Characteristics and label loss dynamicsof Pantoea agglomerans，predominant endophytic bacteriaisolated from rice plant[J]. Chinese Journal of Biochemistryand Molecular Biology，2002，18（1）：85-91.

[18] 張昕，張炳欣，喻景權，張震，沈衛峰，陳振宇，石江. 生防菌ZJY-1 及ZJY-116 的GFP 標記及其在黃瓜根圍的生態適應性[J].應用生態學報，2005，16（11）：2144-2148.

ZHANG Xin，ZHANG Bingxin，YU Jingquan，ZHANG Zhen，SHEN Weifeng，CHEN Zhenyu，SHI Jiang. Labeling of biocontrolagents ZJY-1 and ZJY-116 gfp gene and its ecological adaptabilityin cucumber rhizosphere[J]. Chinese Journal of AppliedEcology，2005，16（11）：2144-2148.

[19] SEDLáK J，PAPR?TEIN F，KORBA J，?ILLEROVá J. Developmentof a system for testing apple resistance to Erwinia amylovorausing in vitro culture techniques[J]. Plant Protection Science，2015，51（1）：1-5.

[20] PARK D H，YU J G，OH E J，HAN K S，YEA M C，LEE S J，MYUNG I S，SHIM H S，OH C S. First report of fire blight diseaseon Asian pear caused by Erwinia amylovora in Korea[J].Plant Disease，2016，100（9）：1946.

[21] KUNIEDA T，KUBO T. In vivo gene transfer into the adult honeybeebrain by using electroporation[J]. Biochemical and BiophysicalResearch Communications，2004，318（1）：25-31.

[22] WILSON R A. Six years of testing streptomycin oxytetracyclinefor control of fire blight of bartlett pear[J]. Plant Disease Reporter，1962，46（6）：397-400.[23] CLARKE G G，HICKEY K D，TRAVIS JW. Recovery of Erwinia

amylovora from excised infected apple shoots and subsequentdevelopment of symptoms on pruning stubs in the orchard as influencedby pruning methods[J]. Phytopathology，1991，62（1）：81-121.