3 個不同類型西瓜品種果實發育過程中游離氨基酸的積累分析

摘要：【目的】探討3 個不同類型西瓜果實中游離氨基酸含量和積累模式的差異及游離氨基酸在西瓜種質分類中的潛在價值。【方法】以3 個不同類型的西瓜品種為試材，對不同發育時期果實中游離氨基酸進行測定分析。【結果】共檢測到24 種游離氨基酸，發現瓜氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸在3 個類型西瓜中含量（w，后同）較高，為0.1～0.5 g·kg-1，且含量差異較大；精氨酸僅在冰糖脆中含量高，為0.12 g·kg-1；其余游離氨基酸含量均低于0.05 g·kg-1。在游離氨基酸含量的積累模式中，PI532726 中17 種呈拋物線型，6 種呈上升型，1 種為其他形式；寧夏紅籽瓜中13 種呈上升型，6 種呈拋物線型，5 種為其他形式；冰糖脆中11 種呈“N”型，13 種為其他形式。PI532726 和寧夏紅籽瓜中游離氨基酸含量和積累模式相似。【結論】3 個類型西瓜果實中瓜氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺含量高，且差異顯著，精氨酸僅在冰糖脆中含量高；PI532726 和寧夏紅籽瓜中游離氨基酸含量和積累模式相似，與冰糖脆差異顯著；對多種游離氨基酸含量和積累模式的結合分析可能在西瓜種質分類中發揮作用。

關鍵詞：西瓜；發育時期；游離氨基酸；積累模式；高效液相色譜

中圖分類號：S651 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）08-1651-15

西瓜（Citrullus lanatus）屬葫蘆科1 年生蔓生植物，原產非洲，是我國重要的經濟作物，在我國的栽培面積和產量均居世界第一[1]。西瓜有7 個種，且屬內栽培類型繁多[2]，具有一定栽培規模的有黏籽西瓜、籽用西瓜和普通（栽培）西瓜。黏籽西瓜是西非國家的重要經濟作物[3]，果肉白色、質地硬且味苦不可食，以食用種子為主。籽用西瓜是我國西北旱區的主要經濟作物[4]，籽瓜籽具有較高的營養價值和經濟價值，瓜瓤有利尿、潤肺、益肝和健脾等功效[5]。普通西瓜即鮮食甜西瓜，果實甘甜可口，富含多種營養物質。西瓜果實中含有多種游離氨基酸[6]，它們在西瓜的生長發育中發揮重要作用[7-8]；部分游離氨基酸自身為呈味氨基酸或參與風味物質的形成，且在人體中發揮重要作用，極大提高了西瓜的營養和風味價值[9]。對不同類型西瓜果實在動態發育過程中的游離氨基酸進行研究，既可以全面了解其含量和積累模式的差異，也可以針對特定游離氨基酸進行遺傳改良以選育出高目標游離氨基酸含量的西瓜新品種，同時還能在代謝組協助種質分類中呈現潛在價值。代謝組學主要研究分子質量小于1 ku的代謝物[10]。目前，代謝組學檢測技術已經在水稻[11]、黃瓜[12]、番茄[13-15]和辣椒[16]等多種作物的研究中發揮重要作用，為研究植株生長、代謝物合成、品種馴化改良和遺傳機制揭示等提供了新的手段。游離氨基酸代謝物參與植物生長發育、細胞生長和分化、能量代謝、次生代謝、轉錄和翻譯、調控及抗性等形成過程。通過代謝組學檢測技術鑒定出多種游離氨基酸，有助于了解各游離氨基酸之間的差異，同時有助于發掘植物中游離氨基酸的營養價值[9]。對植物果實游離氨基酸代謝物的研究也有助于種質分類。袁平麗等[6， 17]研究表明代謝組差異和表型差異均可以作為區分西瓜品種的重要依據，有助于充分了解和利用西瓜種質資源；劉圓等[18]表明不同甜瓜品種特有的香氣物質及特征性酯類種類和含量均不同，這些差異構成了各品種甜瓜特有的典型性香氣。西瓜果實中含有豐富的游離氨基酸，但目前相關研究主要集中在含量較其他水果或蔬菜更高的瓜氨酸和精氨酸方面[19-20]。李蒙蒙等[21]研究了嫁接對西瓜果實中瓜氨酸含量的影響；Davis 等[22]通過測定多個西瓜品種中瓜氨酸含量，選擇出高瓜氨酸含量的品種；Assefa 等[23]研究了瓜氨酸、精氨酸含量與可溶性固形物含量及瓤色的相關性。目前，對西瓜果實中其他游離氨基酸的研究報道較少。雖然對西瓜果實中含量較高的游離氨基酸的研究已經存在一定的基礎，但不同類型西瓜果實中多種游離氨基酸的組分和含量及發育過程中的積累模式并未被完全揭示和詳細報道。筆者在本研究中采用果實表型差異明顯的黏籽西瓜、籽用西瓜和普通西瓜3 個類型的西瓜為試材，系統測定和分析了3個類型西瓜果實中多種游離氨基酸的組分及含量和積累模式的差異，明確3個類型西瓜果實中差異積累的游離氨基酸組分和含量及積累模式的差異，并結合前人研究將游離氨基酸含量和積累模式特征與品種類型聯系在一起進行分析。通過對PI532726、寧夏紅籽瓜和冰糖脆3 個不同類型的西瓜果實在生長發育過程中游離氨基酸的含量構成及積累模式差異情況的探究，為西瓜營養、西瓜風味、抗逆評價和西瓜種質分類提供數據支撐和參考，并為西瓜遺傳育種和西瓜中游離氨基酸的遺傳機制研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料種子由中國農業科學院鄭州果樹研究所國家西甜瓜中期庫和多倍體西瓜遺傳育種課題組提供。根據種質特點選取PI532726（黏籽品種）、寧夏紅籽瓜（籽瓜品種）及冰糖脆（栽培品種）3 個種質類型的西瓜品種作為試驗材料（表1）。

供試材料于2019 年春季種植于中國農業科學院新鄉綜合試驗基地大棚中，種子統一破殼處理，清水浸泡2.5 h，置于培養箱中32 ℃條件下催芽，芽長0.5 cm 時播種于營養缽中，苗期統一管理。實生苗播種后35 d 移栽至大棚，隨機區組設計，雙蔓整枝，行間距1.5 m，株間距0.5 m，田間管理一致。花期人工自交授粉，在第二雌花節位留瓜，并懸掛吊牌標記授粉日期。根據授粉日期，在果實分別發育至10、18、26、34 d 時根據品種發育特征，每個品種選取長勢良好、均勻一致的6 個西瓜，縱切后對每2 個西瓜果實的果肉進行5 點混合取樣作為1 個生物學重復，共3 個生物學重復。對樣品進行液氮速凍，隨后使用冷凍干燥機進行冷凍干燥。

1.2 游離氨基酸含量的檢測

1.2.1 標準溶液與樣品溶液的配制氨基酸標準品：L-丙氨酸（Ala）、L-精氨酸（Arg）、L-瓜氨酸（Cit）、L- 鳥氨酸（Orn）、L- 天冬酰胺（Asn）、L- 天冬氨酸（Asp）、L-胱氨酸（Cys）、γ-氨基丁酸（GABA）、L-谷氨酰胺（Gln）、L-谷氨酸（Glu）、L-甘氨酸（Gly）、L-組氨酸（His）、L-異亮氨酸（ILe）、L-亮氨酸（Leu）、L-賴氨酸（Lys）、L-甲硫氨酸（Met）、L-苯丙氨酸（Phe）、L-脯氨酸（Pro）、L-羥脯氨酸（HYP）、L-絲氨酸（Ser）、L-蘇氨酸（Thr）、L-酪氨酸（Tyr）、L-纈氨酸（Val）、肌氨酸（Sar）和L-茶氨酸（The），純度均≥98%，購自鄭州盛百欣生物科技有限公司。將各標準品分別配制成5000、2500、1250、625、312.5 mmol · L- 1 5 個濃度梯度，于-20 ℃保存待測。

取1.00 g 冷凍干燥的果肉樣品研磨成細粉狀，使用100 mL的沸水沖泡，隨后放入95 ℃水浴鍋水浴10 min，期間攪拌混勻5 次，水浴結束趁熱使用0.22 μm水相濾膜進行抽濾，冷卻至室溫后定容至125 mL，置于-20 ℃保存待測。

1.2.2 高效液相色譜條件采用島津公司的高效液相色譜儀對游離氨基酸進行測定，色譜儀型號：LC-20AD；色譜條件，熒光檢測器A Ex：250 nm，Em：395 nm；色譜柱：C18，5 μm，4.6 mm × 250 mm。流動相A（95 mL 800 mmol ·L- 1 磷酸二氫鉀溶液+ 5 mL800 mmol·L-1磷酸氫二鈉溶液+ 10 mL 1 mol·L-1鹽酸三乙胺溶液+ 55 mL乙腈+ 835 mL水）；流動相B（100 mL 800 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液+ 500 mL乙腈+ 400 mL超純水）；流速1 mL·min-1；二元梯度高壓：泵A+泵B 總濃度為100%，洗脫梯度為泵A 濃度：0～25 min（100%），25～40 min（97%），40～55 min（81%），55～68 min（74%），68～88 min（0%）。

1.2.3 游離氨基酸含量的測定取10 μL樣品溶液于玻璃內襯管中，并加入20 μL衍生試劑和70 μL衍生用緩沖試劑，放入進樣瓶渦旋混合10 s，轉移至55 ℃烘箱中加熱10 min，取出樣品瓶放置于高效液相色譜樣品瓶架上，開啟檢測按鈕，重復測定3 次。

1.3 數據處理

以3 次生物學重復測定結果的平均值作為最終含量值。采用Excel 對試驗數據進行平均數、標準差和相對標準偏差分析處理和作圖。使用TBtools軟件進行熱圖繪制，利用IBM SPSS Statistics 26 軟件的因子模型對數據進行主成分分析，使用Origin2018 64 Bit繪制主成分分析圖。

2 結果與分析

2.1 3 個類型西瓜果實發育過程中游離氨基酸含量分析

參考4個發育時期中游離氨基酸的最高含量，發現瓜氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺在3 個類型西瓜果實中含量均較高，且存在顯著差異；瓜氨酸在PI532726中為0.11 g·kg-1，在寧夏紅籽瓜中為0.12 g·kg-1，而在冰糖脆中為0.39 g · kg-1。精氨酸（0.1～0.2 g · kg-1）僅在冰糖脆中含量較高（0.12 g · kg-1），而在PI532726和寧夏紅籽瓜中分別為0.018 和0.068 g · kg-1。γ-氨基丁酸、谷氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺和苯丙氨酸在3 個不同類型西瓜果實中含量均在0.01～0.06 g·kg-1之間，茶氨酸、羥脯氨酸、酪氨酸、肌氨酸、丙氨酸、亮氨酸、鳥氨酸和半胱氨酸在3 個類型西瓜果實中含量均低于0.01 g·kg-1。其余幾種游離氨基酸在3個不同類型西瓜中含量差異顯著，脯氨酸和甲硫氨酸在冰糖脆中含量分別為0.028 和0.013 g·kg-1，而在PI532726和寧夏紅籽瓜中含量均低于0.01 g·kg- 1。絲氨酸在寧夏紅籽瓜和冰糖脆中含量為0.011 和0.015 g·kg-1，而在PI532726中含量均低于0.01 g·kg-1（表2，圖1）。

對3 個類型品種西瓜4 個發育時期果實中的24個指標標準化后進行主成分分析，提取特征值＞1的2 個主成分。其中，PI532726 特征值分別為14.503、5.511，寧夏紅籽瓜特征值分別為19.006、3.368，冰糖脆特征值分別為10.73、9.79，累計方差貢獻率均大于83%，具有較強信息代表性，達到分析要求。PCA 載荷圖（loading plot）可用來尋找差異變量，距離原點越遠表示對樣本貢獻率越大。從載荷圖（圖2）可以看出，對PI532726 貢獻率較大的游離氨基酸是甘氨酸和谷氨酰胺，對寧夏紅籽瓜貢獻率較大的游離氨基酸是甘氨酸、瓜氨酸和谷氨酰胺，對冰糖脆貢獻率較大的游離氨基酸是甘氨酸、瓜氨酸、精氨酸和谷氨酰胺。聚類熱圖（圖3）分析能夠清晰地看出3 個品種西瓜果實中的甘氨酸、瓜氨酸、精氨酸和谷氨酰胺存在顯著差異的積累量與積累模式，而游離氨基酸進化樹也能清晰地呈現出3 個類型品種之間的差異，其中，PI532726 和寧夏紅籽瓜中游離氨基酸的代謝特征更相似。綜上可以看出，在3 個類型的西瓜中存在含量顯著差異的游離氨基酸，可能在不同種質類型的西瓜品種中作為區分種質的標志性差異代謝物存在。

將檢測到的24 種游離氨基酸作為總游離氨基酸。PI532726 發育過程中甘氨酸（26%～34%）、谷氨酰胺（12%～24%）、瓜氨酸（8%～23%）和γ-氨基丁酸（4%～9%）含量占比較大。寧夏紅籽瓜中甘氨酸（20%～35%）、谷氨酰胺（12%～28%）、瓜氨酸（9%～15%）、谷氨酸（4%～12%）和精氨酸（4%～9%）含量占比較大。冰糖脆中瓜氨酸（23%～45%）、谷氨酰胺（21%～35%）、甘氨酸（4%～19%）和精氨酸（5%～11%）含量占比較大。不同發育時期中，3 個類型西瓜中多種游離氨基酸比例情況存在顯著差異（圖4），表明3 個類型西瓜果實中存在含量比例始終較大的游離氨基酸，且存在顯著差異。這些游離氨基酸在果實發育中的積累情況可能與西瓜的品種和種質類型有關。

2.2 3 個類型西瓜果實中游離氨基酸含量分析

將檢測到的24 種游離氨基酸作為總游離氨基酸。PI532726中總游離氨基酸含量的變化呈拋物線型（上升-下降），寧夏紅籽瓜中呈上升型，而冰糖脆西瓜中呈“N”型（上升-下降-上升）。冰糖脆的4個發育時期的總游離氨基酸含量均高于PI532726 和寧夏紅籽瓜。PI532726 和寧夏紅籽瓜的總游離氨基酸積累曲線重合度較高（圖5）。

分別對各游離氨基酸積累模式進行分析。

PI532726 中瓜氨酸、γ-氨基丁酸、天冬氨酸和鳥氨酸含量的積累模式呈上升型，半胱氨酸含量呈下降型，谷氨酰胺、甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸和異亮氨酸含量的積累模式呈拋物線型。寧夏紅籽瓜中丙氨酸和半胱氨酸含量的積累模式呈下降型，谷氨酸含量呈“V”型（下降-上升），甘氨酸、亮氨酸、絲氨酸和酪氨酸含量呈拋物線型，瓜氨酸，谷氨酰胺、精氨酸、苯丙氨酸、γ-氨基丁酸、天冬氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、鳥氨酸和茶氨酸含量呈上升型。冰糖脆中甘氨酸和丙氨酸含量呈下降型，瓜氨酸和鳥氨酸含量呈上升型，天冬氨酸和γ-氨基丁酸含量呈拋物線型，谷氨酰胺、精氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸、絲氨酸、纈氨酸和甲硫氨酸含量呈“N”型（上升-下降-上升），蘇氨酸含量呈“倒N”型（下降-上升-下降）。PI532726 與寧夏紅籽瓜中多種游離氨基酸含量變化曲線重合度較高，如甘氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、γ-氨基丁酸和酪氨酸等，而PI532726 與冰糖脆中無變化曲線重合度較高的游離氨基酸，寧夏紅籽瓜和冰糖脆中僅半胱氨酸含量的變化曲線重合度較高（圖6）。進一步對所有樣本的游離氨基酸數據進行PCA 分析，發現主成分1 將PI532726 和寧夏紅籽瓜聚類在一起，將冰糖脆單獨聚為一類（圖7），表明PI532726 和寧夏紅籽瓜果實中的游離氨基酸代謝網絡和代謝形式可能更相似。

2.3 植物中的游離氨基酸代謝網絡

3 個類型西瓜品種果實中存在著特異的游離氨基酸，進一步將檢測到的游離氨基酸代謝物放置于代謝途徑中（圖8）。通過代謝路徑能夠更清晰地看出，瓜氨酸、精氨酸和鳥氨酸直接參與了植物中的鳥氨酸循環，γ-氨基丁酸、酪氨酸和天冬酰胺等參與三羧酸循環，甘氨酸和谷氨酰胺則與多種游離氨基酸建立聯系。其中，三羧酸循環是三大營養素（糖類、脂類、氨基酸）的最終代謝通路，又是糖類、脂類、氨基酸代謝聯系的樞紐；鳥氨酸循環中間產物對植物的生長發育、生物與非生物脅迫起著重要的作用，也與植物氮素利用密切相關。將一些重要目標游離氨基酸放置于復雜的氨基酸代謝途徑中，與其他游離氨基酸的代謝聯系在一起，有助于了解不同品種西瓜中的游離氨基酸積累特性，對西瓜的選育和分類有著重要的指導意義，可為品種劃分及定向育種提供參考。

3 討論

游離氨基酸作為植物體內重要的組分之一，是植物體完成生命活動的必要保證，廣泛參與植物發育及各種代謝途徑。甘氨酸是植物體內重要氮源，同時對干旱、寒冷和化感脅迫均有緩解甚至抵消作用[7]；谷氨酰胺作為植物體中重要氮源，可以分解為谷氨酸、天冬氨酸、丙酮酸、乳酸、丙氨酸和檸檬酸等，參與多種生化反應；瓜氨酸在植物的抗逆過程中起到重要的作用；精氨酸在植物中是重要的氮素儲藏營養物，也是重要的信使分子多胺（polyamine，PA）和一氧化氮（NO）等合成的前體物質，參與植物生長發育、抗逆等在內的幾乎所有生理生化過程[8]；游離脯氨酸是細胞質中重要的滲透劑和防脫水劑，對植物體內的酶和膜結構有保護作用，能增強植株的抗旱性[24]，目前多數研究都以測定葉片中游離脯氨酸的含量來研究植物的抗旱性[25]；植物體內的賴氨酸和亮氨酸能夠激發轉氨酶和脫氫酶的活性[26]；組氨酸與植物抵抗重金屬脅迫有關[27]；天冬酰胺具有螯合Cd、Pb 和Zn的能力，能夠降低這些重金屬的毒性[28]；半胱氨酸是甲硫氨酸、谷胱甘肽和植物螯合肽的合成前體物質，有助于植物抗氧化脅迫、抗重金屬毒害、抵抗外界病原菌侵入和植物免疫[29-30]。游離氨基酸也可以抑制植物生長，如體外低微摩爾級的谷氨酸對擬南芥根系負向調控，形成主根短而分枝側根多的根部形態[31]；高濃度芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸）會抑制擬南芥種子萌發和幼苗生長[32]。綜上所述，游離氨基酸在植物體內的積累及代謝網絡等是今后研究的重點。筆者在本研究中針對西瓜中游離氨基酸進行研究分析，對了解西瓜氨基酸的生理機制意義重大，研究中發現谷氨酰胺、瓜氨酸、甘氨酸和精氨酸含量很高，這可能與西瓜物種特異的代謝調節通路有密切的關系，對植物的生化與遺傳機制研究有很大的參考價值。

游離氨基酸不僅在植物生長發育中發揮重要作用，同時也可以作為重要的營養和風味物質。甘氨酸在動物體中具有抗炎、免疫調節和細胞保護等作用[33]；谷氨酰胺是人體中含量最豐富的循環性氨基酸，是免疫細胞基因表達的重要組成部分[34]；瓜氨酸對治療男性疾病有著很好的效果[18]；精氨酸在人體多個器官系統中發揮重要作用[35]。游離氨基酸還能通過多種代謝途徑形成有機酸、糖類、香氣物質等風味營養物質[36-37]。草莓香氣產生與纈氨酸有關[38]；甜瓜[39-41]、草莓[42-43]、香蕉[44-45]、蘋果[46]等果實中異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸和丙氨酸等與果實中重要風味物質酯類物質的形成密切相關；番茄中部分揮發性物質形成的前體是甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸等氨基酸[47]；番木瓜的芳香組分中的酯類化合物由脂肪酸和氨基酸轉化而來[48]。筆者在本研究中測得了多種游離氨基酸的含量，其中瓜氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺和精氨酸含量高且都有很高的營養價值，也有很大的研究價值。本研究結果為西瓜中營養物種和風味物質的研究提供了參考。

不同種質類型西瓜的育種目標差異會造成果實表型的差異，代謝物也發生著變化，育種過程中可能很多代謝物被正向選擇或被負向選擇。研究表明，代謝組學可以作為表型和基因組的橋梁，放大表型或者基因組差異，可以幫助科研人員找到不同種質之間表型和基因差異之外的差異性狀，探尋不同種質間的區別[49]。部分代謝物的變化甚至能夠直接或者間接影響生物部分性狀[50-51]。游離氨基酸代謝途徑復雜且參與多種生化途徑。本研究基于不同發育時期多種游離氨基酸的數據，顯示籽用西瓜和普通西瓜在發育過程中游離氨基酸代謝物方面的明顯差異，這為西瓜種質分類的研究提供了參考。在筆者研究的基礎上，相關研究可以擴大代謝物的測定量，與基于植株表型和DNA分子標記的植物分類鑒定相互補充，并結合基因組、轉錄組等數據分析西瓜不同栽培類群的關系，輔助西瓜分類；同時也可以參考本研究數據進一步在自然群體中對目標游離氨基酸進行檢測，開展基于代謝組的全基因組關聯分析（metabolome genome- wide association study，mGWAS），挖掘調控目標游離氨基酸積累的關鍵候選基因。通過代謝組學mGWAS分析和遺傳圖譜定位等方式對游離氨基酸的遺傳機制進行進一步的研究，可以逐步解析西瓜果實游離氨基酸的生化和遺傳機制，從而為代謝組學輔助西瓜育種奠定基礎。

4 結論

3 個類型的西瓜果實中含有高含量的瓜氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺（0.1～0.5 g·kg-1），且含量差異較大，精氨酸僅在冰糖脆中含量高（0.12 g·kg-1）；PI532726和寧夏紅籽瓜中游離氨基酸含量和積累模式相似，與冰糖脆差異顯著；對多種游離氨基酸含量和積累模式結合分析可能在西瓜種質分類中發揮作用。

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