水分脅迫對馬瑟蘭葡萄果實揮發性物質合成的影響

摘要：【目的】探明水分脅迫對馬瑟蘭葡萄果實揮發性風味物質的影響。【方法】以5年生馬瑟蘭葡萄為試材，根據黎明前葉片水勢設置三個水分處理：對照為無脅迫、輕度脅迫（T1）和中度脅迫（T2），通過控制灌水量使植株維持在目標范圍內。分別測定各處理葡萄果實揮發性有機化合物及其相關基因表達等指標。【結果】在馬瑟蘭葡萄成熟期，對照、輕度和中度水分脅迫分別檢測出揮發性有機化合物41、45和36種；輕度脅迫（T1）可顯著提高果實揮發性物質種類，分別較對照和中度脅迫（T2）提高了9.7%和25.0%。與對照相比水分脅迫下更有利于葡萄果實中VvCCD1 的表達，但不利于VvGPPS和VvHPLA的表達。

【結論】適度的水分脅迫可以促進果實中揮發性有機化合物種類和含量的增加。

關鍵詞：葡萄；水分脅迫；揮發性化合物；基因表達

中圖分類號：S663.1 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）08-1592-14

水分是限制農業生產的重要因素之一[1]，我國釀酒葡萄栽培區主要集中在西北干旱半干旱地區，大量研究表明水分脅迫會導致植物在形態和生理生化方面發生差異性變化[2-4]。如在一定水分脅迫下可以有效地限制葡萄枝葉徒長[5]、提高果實品質[6- 8]等。果實品質不僅包括果實在生長和成熟過程中顏色、風味和質地的變化[9-10]，也包括果實釋放出來的揮發性有機物質[11-12]；香氣是葡萄果實品質之一，其種類、含量和感官閾值決定了葡萄品種香氣的典型性[13-14]。適度的水分脅迫對葡萄的揮發性物質有影響，且對不同種類的香氣產生不同的影響。Brillnate等[15]的研究顯示‘西拉’葡萄進行70%水分灌溉降低了漿果的質量，從而導致果樹兩年的產量和作物負載量降低，但是70%水分灌溉使果實的花青素、丹寧和總酚含量增加，果實香氣（萜烯類化合物、β-大馬酮和降碳倍半萜及其衍生物）的含量提高。70%水分脅迫處理可能有助于改善漿果果皮和葡萄酒酚類物質，并在實現高產的同時減少葡萄酒中的甲氧基吡嗪（IBMP）。Ju 等[16]對葡萄進行代謝分析的結果表明，漿果在水分脅迫后（E）-2-己醛和3-己醛含量顯著升高。通過多元統計分析，結果表明葡萄果實中脯氨酸、過氧化氫酶、丙二醛和超氧化物歧化酶與青葉醛和3-己烯醛的含量相關性較強。因此，水分脅迫可以與活性氧自由基清除系統協同作用，調節漿果揮發物的積累，尤其是（E）-2-己醛和3-己醛。這些化合物將用作信號化合物，以對抗水分脅迫對葡萄藤的影響。葡萄潛在香氣在輕度水分脅迫和中度氮供應狀態下含量最高，重度水分脅迫和缺氮會減弱葡萄香氣[17]。

葡萄香氣合成具有多種途徑，萜烯類合成途徑是合成葡萄果實中揮發性有機化合物的主要途徑，萜類化合物以游離態化合物和糖苷結合態化合物的形式存在，是葡萄漿果和葡萄酒香氣中最重要的芳香化合物的來源[18]。研究表明，異戊二烯類化合物及其衍生物是果實中重要的一類揮發性化合物，這類化合物是類胡蘿卜素在類胡蘿卜裂解雙加氧酶（CCDs）作用下氧化分解而成[19]，Zhang 等[20]研究發現，在果實成熟過程中，類胡蘿卜素類香氣揮發性化合物含量增加，尤其是β-紫羅蘭酮含量顯著增加，并鑒定出可能參與這些化合物生物合成的CCD1 基因。單萜合成代謝途徑中期的關鍵基因是香葉基二磷酸合成酶基因（VvGPPS），GPPS 基因表達量上調，對響應合成單萜物質有促進作用[21]。植物脂氫過氧化物裂解酶（hydropenoxide lyase，HPL）作為植物不飽和脂肪酸氧化途徑中的關鍵酶，與植物的特有香氣、抗逆反應及信號傳導和老化等生理過程有關，醛類進而氧化生成酸或經醇脫氫酶（ADH）作用生成醇，最后在醇酰基轉移酶（AAT）催化下生成酯類[22-23]。馬瑟蘭（Marselan）是赤霞珠（Cabernet Sauvignon）和黑歌海娜（Grenache Noir）的雜交品種。經過雜交選出的馬瑟蘭既具有歌海娜的耐熱性又兼備赤霞珠的細致感[24-25]，用馬瑟蘭釀制的干紅葡萄酒品質優良，酒色紫黑不透光，香氣濃郁，單寧含量高，適合長期陳釀[26]。目前，國內外對赤霞珠葡萄果實的香氣組分研究的報道較多，而對馬瑟蘭葡萄的香氣組分研究較少。本試驗中以馬瑟蘭葡萄為試材，探究不同水分脅迫程度對馬瑟蘭葡萄果實中揮發性有機化合物及其相關基因的變化，以期為馬瑟蘭葡萄栽培中的水分利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗設計

試驗在寧夏農墾集團玉泉營農場國家葡萄產業技術體系水分生理與節水栽培崗位試驗基地（38.28°N，106.24°E）進行，供試材料為5 年生馬瑟蘭葡萄，東西行向，株行距0.6 m ×3 m，采用傾斜獨龍蔓整形。水分脅迫從花后50 d 至采收期進行，采用滴灌方式灌溉，每個處理均裝有控水閥門，通過不同灌水量使各處理黎明前葉片基礎水勢值達到各脅迫參考范圍，實現輕度、中度水分脅迫，以無水分脅迫作為對照，設置3 個處理。對照澆灌時長12 h，輕度脅迫澆灌時長4 h，中度脅迫澆灌時長2 h。每3 d 測量1 次水勢，通過控制灌水量使植株維持在目標范圍內。試驗從水分脅迫開始每10 d 采樣一次，每次取樣部位為陰、陽兩面及上中下，每個處理隨機采取100 粒果實，立刻用液氮速凍，用塑封袋裝好放在-80 ℃的冰箱中保存待測（表1）。

"1.2 黎明前葉片水勢測定

于黎明前分別摘取各處理葡萄植株新梢中部健康的功能葉，每個處理隨機選取3 株葡萄，每株葡萄隨機采3 枚葉片。立即利用水勢壓力室（美國SoilMoisture Equipment 公司）測定葉片的水勢值，并讀數記錄。

1.3 葡萄果實揮發性有機化合物的測定

采用頂空固相微萃取（HS-SPME）結合氣質聯用（GC-MS）方法。游離態香氣的提取。在離心管加入破碎成粉末的果實樣品15 g，加入1 g 交聯聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）和0.5 g D-葡萄糖酸內酯。將離心管置于4 ℃冰箱浸提120 min。然后4 ℃、10 000 r ·min-1離心15 min，得到澄清葡萄汁。

頂空固相微萃取（HS-SPME）。取葡萄汁5 mL于15 mL 頂空瓶中，加入1 g 氯化鈉、5 μL 內標物2-辛醇和磁力轉子后迅速擰緊瓶蓋，將萃取頭插入樣品頂空瓶，置于磁力攪拌器于60 ℃吸附40 min。吸附后將萃取頭取出插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解析5 min。

氣相色譜分離條件。色譜柱：HP-INNO-Wax 毛細管柱（長30 m，內徑0.25 mm，液膜厚度0.25 μm），載氣He（99.99%），流速1.0 mL·min-1；進樣口溫度：250 ℃，解析5 min；程序升溫為50 ℃ 下1 min 后，以3 ℃· min-1的速度升溫到220 ℃并保持5 min；質譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離的方式為EI，電離能是70 eV，掃描范圍為30～350 amu。定性分析與定量分析。利用質譜全離子掃描模式下的總離子流圖譜，對采集的總離子圖流用NIST08 和RTLPEST3 兩個譜庫檢索及資料分析，結合保留指數（Retention Index，RI）和參考文獻確定揮發性香氣組分。采用內標法相對定量，以2-辛醇作為內標來確定相對含量，計算公式為香氣組分的相對含量（w）（μg · kg- 1）=[各組分的峰面積/內標峰面積×內標質量（μg）]/樣品質量（kg）。

1.4 總RNA提取及熒光定量PCR

用RNA提取試劑盒（離心柱型）提取葡萄果實（不含種子）RNA。利用TranScript 試劑盒反轉錄合成cDNA。以Actin 為內參基因進行熒光定量PCR，在GeneBank 中，查找VvGPPS、VvHPLA 和VvCCD1的特異性序列，由上海生工進行引物設計和合成。引物序列如表2所示。采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

"1.5 數據分析

試驗數據采用Microsoft office excel 2010、Origin2018和SPSS Statistics 23.0 進行繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 水分脅迫對馬瑟蘭葡萄果實揮發性化合物的影響

2.1.1 水分脅迫對馬瑟蘭葡萄果實揮發性化合物種類數量的影響馬瑟蘭葡萄成熟期時對照、輕度脅迫和中度脅迫分別檢測出揮發性有機化合物41、45和36種，如表3 所示，輕度脅迫可顯著增加果實揮發性物質種類，分別較對照和中度脅迫增加了9.7%和25.0%，中度脅迫和對照相比較，中度脅迫處理使果實內揮發性化合物種類和數量均減少，較對照減少了13.8%。表4 所示證明輕度水分脅迫下馬瑟蘭葡萄果實內醇類和醛類揮發性物質的含量均較對照有所提高，而中度脅迫下各類揮發性物質含量較對照均降低。

2.1.2 水分脅迫對馬瑟蘭葡萄發育過程中主要的醇類和酯類化合物含量的影響醇類為馬瑟蘭葡萄果實香氣貢獻很大，本次試驗檢測出12 種醇類。如表5 所示，主要的醇類含量隨著葡萄果實的發育而上升。例如正己醇是一種具有水果香氣的醇類化合物，在三種脅迫處理下正己醇均能被檢測出來，與對照和中度脅迫處理相比輕度脅迫處理所檢測出來的正己醇含量最高，花后120 d，輕度水分脅迫果實中正己醇的含量較對照和中度水分脅迫分別高出54.7%和60.9%。圖1 顯示正己醇、芳樟醇、α-松油醇、苯甲醇及正壬醇隨著果實發育其相對含量增加；且輕度脅迫處理下含量最高。而十二醇、2-乙基己醇和1-辛烯-3-醇其相對含量隨果實發育而降低。由此可得出適度的水分脅迫（T1）可以提高香氣物質的相對含量。

酯類揮發性化合物在葡萄的品種香氣中不是很突出，一般在經酵母發酵后的葡萄酒中表現出種類和含量很高。酯類的相對含量較低，本次試驗中共檢測出9 種酯類。其中癸酸乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二乙酯和丙位庚內酯是馬瑟蘭葡萄果實中主要的酯類揮發性物質。在表5 中可以發現，花后77 d 具有椰子香氣和麥芽氣味的丙位庚內酯不能被檢測出來，而具有芳香氣味的鄰苯二甲酸二乙酯在花后110 d 才能被檢測出。

2.1.3 水分脅迫對馬瑟蘭葡萄發育過程中主要的醛類和酮類化合物含量的影響本次試驗共檢測出醛類12種，如表6 所示，主要醛類揮發性物質隨著馬瑟蘭葡萄果實的發育其相對含量升高。正己醛具有青草和蘋果的香氣，在整個發育過程中均能被檢出，且其相對含量是醛類揮發物中最高的。2-己烯醛具有濃郁新鮮水果的香氣，在7 個時期中均能被檢測出，且與對照相比輕度水分脅迫下2-己烯醛的相對含量最高，而中度水分脅迫2-己烯醛的相對含量降低。花后120 d，2-己烯醛的相對含量在輕度水分脅迫下較對照提高了40.3%；在中度水分脅迫下較對照降低了43.4%。由此得出，輕度水分脅迫促進2-己烯醛含量的升高，但中度水分脅迫降低其含量。部分醛類物質在果實發育前期未能被檢出，但在果實發育后期能被檢出，如山梨醛在花后87 d 后才能被檢測出。

如圖2 所示，2-甲基苯甲醛、反式-2，4-庚二烯醛和2，5-二甲基苯甲醛在果實發育前期各水分脅迫下均可被檢出，但在果實成熟期其相對含量極低。但正己醛、苯甲醛、5-羥甲基糠醛、山梨醛及正壬醛的相對含量隨果實發育而增加，呈上升趨勢。酮類揮發性物質共檢測出10 種，大馬士酮有強烈的玫瑰花香氣，在7 個時期中均存在，隨果實的發育其相對含量也隨之增加。花后120 d，輕度和中度水分脅迫下大馬士酮的含量均低于對照。說明水分脅迫不利于大馬士酮物質的積累。

2.1.4 水分脅迫對馬瑟蘭葡萄發育過程中主要的酸類、酚類及其他類化合物含量的影響共檢測出12種酸類揮發性物質，正壬酸具有令人不愉快的刺激氣味，隨著果實發育其含量呈上升趨勢，花后110 d，輕度和中度水分脅迫下正壬酸的含量均比對照高40.0%和51.4%，表明水分脅迫會加劇正壬酸帶來的劣質香氣；表中還顯示，在馬瑟蘭果實發育前期能被檢測出來的酸類揮發性物質很少，到果實發育后期酸類揮發性物質種類增加（表7）。酚類物質中2，4-二叔丁基酚的相對含量最高，且在葡萄果實的全發育階段均能被檢測出來。其他類化合物中包括含氮化合物和其他烴類化合物，其中四甲基琥珀腈和2，1，3-苯并噻二唑含量最高（表7）。

2.2 水分脅迫對馬瑟蘭葡萄果實揮發性化合物合成相關基因的影響

香葉基二磷酸合成酶基因（VvGPPS）為單萜合成代謝途徑中期的關鍵基因，如圖3 所示，VvGPPS表達量隨著馬瑟蘭葡萄果實的發育呈現先下降隨后上升的趨勢，花后87 d 前，T2 處理下VvGPPS 表達量顯著高于對照和T1；成熟期時，對照處理下VvGPPS 表達量高于T1 和T2。表明水分脅迫會降低該基因的表達量。

如圖4 所示，在馬瑟蘭葡萄果實整個發育過程中，各處理下VvHPLA表達量呈下降趨勢，但是花后87 d 時T1 的VvHPLA 表達量最高。花后67～120 d對照的相對表達量均處于較低水平，T1 和T2 的表達量高于對照。說明水分脅迫可以促進VvHPLA表達量升高，但是總體來說成熟期的表達量降低。如圖5 所示，在馬瑟蘭葡萄果實發育過程中，VvCCD1 表達量呈現出下降趨勢，但中度水分脅迫處理（T2）的葡萄果實VvCCD1 表達量始終高于對照組，花后87 d 觀察到輕度水脅迫處理（T1）的VvCCD1 表達量顯著高于對照組和中度水分脅迫。

結果表明，水分脅迫處理可以有效提高馬瑟蘭葡萄果實VvCCD1 的表達量。

3 討論

環境因素通過影響植物基因的表達及植物體內的生理生化反應，進而調控植物的生長和次生代謝產物的變化[26-27]。水分是一切生物維持生命活動不可或缺的因素，水分匱乏已成為影響經濟植物生長及產量形成的決定性環境因素[28-29]。水分不足會損害葡萄生長，降低產量，水分嚴重不足時會影響葡萄和葡萄酒的質量[30]。

據報道，調虧灌溉可以提高葡萄的水分利用率和抑制葡萄的營養生長，這可能會影響果實的生長和品質，特別是多酚和香氣[30]。本研究中輕度水分脅迫的香氣總量顯著高于其他兩個處理；成熟期時馬瑟蘭葡萄果實內醛類揮發性化合物的含量高于其他種類。本研究表明，輕度水分脅迫下馬瑟蘭葡萄果實內醇類和醛類揮發性物質的含量均較對照有所提高，而中度脅迫下各類揮發性物質含量較對照均降低。果實成熟過程中大多數萜醇類物質含量呈上升趨勢[31]。本研究顯示正己醇和芳樟醇是馬瑟蘭葡萄果實發育過程中含量最高的兩種萜醇類化合物，二者分別具有水果和玫瑰的香氣。其中正己醇的含量隨水分脅迫程度的增高而增加，由此表明，水分脅迫可以提高馬瑟蘭葡萄果實內正己醇的含量。大馬士酮是馬瑟蘭葡萄果實中含量最高的酮類物質，與對照相比，輕度和中度脅迫處理的果實中大馬士酮含量分別降低了27.3%和43.7%，說明水分脅迫不利于大馬士酮在馬瑟蘭葡萄果實中的積累。綜上，為提高釀酒葡萄果實品質，可在實際生產中應用節水灌溉如滴灌等措施。

香葉基二磷酸合成酶基因（VvGPPS）為單萜合成代謝途徑中期的關鍵基因[20]，本研究中馬瑟蘭葡萄果實中的VvGPPS 表達量隨果實成熟表現出先下降后上升的趨勢，且水分脅迫使VvGPPS 表達量下調。表明水分脅迫不利于VvGPPS 的表達。研究表明異戊二烯類化合物及其衍生物是果實中一類重要的揮發性化合物，這些揮發性化合物是類胡蘿卜素在類胡蘿卜裂解雙加氧酶（CCDs）作用下氧化分解而成的[18]，這些類胡蘿卜素衍生物的C13-降異戊二烯化合物在許多植物的花、果實和葉片中存在且具有不同的生物學作用[32]。本研究顯示，整體VvCCD1 表達量呈現出下降趨勢且水分脅迫下VvCCD1 表達量顯著高于對照。植物脂氫過氧化物裂解酶（HPL）作為植物不飽和脂肪酸氧化途徑中的關鍵酶，與植物的特有香氣、抗逆反應及信號傳導和老化等生理過程有關[33-34]；本研究HPLA基因表達前期，輕度和中度脅迫處理下表達量呈上升趨勢，而對照逐漸下降，花后120 d，輕度脅迫表達量最高，水分脅迫可以促進HPLA基因表達量的升高；與花后52 d相比，其表達量降低。

4 結論

綜上所述，適度的水分脅迫可顯著增加馬瑟蘭葡萄果實中揮發性有機化合物的種類和相對含量。與對照相比水分脅迫不利于VvGPPS 和VvHPLA 的表達，但有利于VvCCD1 的表達。

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