基于SLAF-seq 技術的不同類型越橘遺傳變異和群體結構研究

摘要：【目的】利用越橘屬栽培品種及野生資源在全基因組范圍內篩選差異SNP分子標記，分析其遺傳變異，了解不同類型群體間的遺傳變異、基因交流、群體結構，為越橘種質創新提供遺傳背景依據。【方法】以越橘屬9 個種的62 份種質資源為材料，利用特異性位點擴增片段測序技術（SLAF-seq）獲得的基因組SNP標記比對到品種Draper 參考基因組上，進行供試材料遺傳研究。【結果】測序獲得169.87 Mb reads 數據，平均Q30值94.99%，包含172 513 個多態性SLAF標簽，篩選到高質量SNP標記4 133 595 個，均勻分布在越橘12 條染色體上。基于SNP標記的系統進化樹準確反映了供試野生、北高叢和南高叢類群遺傳差異以及品種間系譜遺傳關系，反映出野生類型與栽培品種遺傳差異顯著，供試野生種具有獨立的遺傳背景且種間無基因交流發生，但野生種到栽培種存在單向的基因流；栽培品種類群存在明顯的亞群結構，亞群間存在普遍的基因交流；半高叢品種北陸和南高叢品種軍號與北高叢類型緊密聚類，矮叢品種美登、半高叢品種北村、黑珍珠遺傳背景傾向于野生種。【結論】栽培品種近親雜交和骨干親本高頻率使用導致品種間基因交流頻繁、同質性高、遺傳基礎狹窄，野生種具有獨立的遺傳背景，但存在野生種到栽培種的單向基因流，應加大野生資源發掘利用以拓寬越橘遺傳基礎。

關鍵詞：越橘；SLAF-seq技術；SNP；遺傳群體結構

中圖分類號：S663.9 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）08-1534-12

越橘，又名藍莓（blueberry），果實富含花青苷、超氧化物歧化酶（SOD）、黃酮和其他酚類化合物等功能性營養成分，有助于提高視力、增強抗癌能力和降低心臟病發生等，備受市場關注和消費者青睞[1- 2]。種植高效益和巨大的市場潛力使越橘成為目前全球發展最快的果樹樹種，到2020年，全球越橘栽培總面積20.567萬hm2，中國由2008年的0.12萬hm2快速增加到2016 年的2.20 萬hm2 后，又增加到2020 年的6.64 萬hm2，總產量34.72 萬t，產量和面積躍居全球第一位[3]，在中國經濟發展中發揮了重要作用。

越橘為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vacciniumspp.）植物，全世界越橘屬植物約有400 個種[4]，染色體倍性多樣性豐富。高叢越橘（Vaccinium corymbosum）、兔眼越橘（V. ashei）、矮叢越橘（V. augustifolium）是世界范圍內主要的商品化栽培種，其中高叢越橘品種（包括半高叢、北高叢和南高叢類型）為四倍體（2n=4x=48），而兔眼藍莓是六倍體（2n=6x=72）[5-6]，篤斯越橘（V. uliginosum）、紅豆越橘（V. vitisidaea）、蔓越橘（V. macrocarpon）等野生種為二倍體（2n=2x=24）[7]類型。最新研究發現，四倍體越橘基因組大小高達1.68 Gb，雜合度高，整個基因組上包含128 559 個基因，每個單倍型染色體上平均有32 140 個蛋白質編碼基因[8]，是目前組裝質量最好的四倍體越橘基因組，為高通量測序獲取大規模SNP（single nucleotide polymorphisms）標記深入挖掘遺傳變異信息、群體遺傳進化和遺傳多樣性研究奠定了條件基礎。

SLAF-seq 技術（特異長度擴增片段測序，Specific-locus amplified fragment sequencing）是一種新的簡化基因組測序技術，它具有測序深度高、可避免大量重復序列、能獲得大量SNP 標記和In-Del 標記等優點[9]，已成功應用在高雜合度木本植物中，而在越橘上鮮見相關報道。

筆者實驗室通過前期開發的越橘EST-SSR 標記[7]已初步掌握了我國越橘種質資源存在與抗寒性、低溫需冷量等對應的遺傳差異[10]。開展科學系統的種質資源評價、特異資源篩選及野生資源利用，離不開遺傳多樣性及遺傳結構的精準鑒定。然而，我國越橘種質資源研究中不同類型的越橘群體間遺傳變異、基因交流、群體結構問題仍不明確，導致越橘遺傳多樣性背景不清晰，無法為越橘育種提供有效參考依據。為此，筆者在本研究中以越橘屬多種類型（栽培種和野生種）、不同倍性（二倍體、四倍體和六倍體）越橘為試材，通過SLAF-seq 技術獲得大量SNP標記分析遺傳變異和群體結構，探討遺傳背景及開發利用途徑，為科學開展新品種選育提供參考和依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試越橘種質資源材料取自遼寧省果樹科學研究所越橘種質資源圃，其中包括野生類型11 份，從國外引進栽培品種51 份，涉及越橘屬9 個種（species）和北高叢、南高叢、半高叢、矮叢、兔眼5 個栽培類型（表1）。

1.2 基因組DNA提取

供試材料幼葉利用液氮速凍后存于-80 ℃冰箱備用。用改良CTAB法[7]提取基因組DNA，用Nanodrop2000C超微量核酸蛋白測定儀（Thermo Fisher）和Qubit 2.0 熒光計（Thermo Fisher）進行DNA 的質量和濃度檢測，所提基因組DNA OD260與OD280的比值分布在1.8～2.0，DNA質量濃度達到30 ng?μL-1，達到測序文庫構建要求。

1.3 酶切建庫與測序評估

根據酶切片段在基因組上是否均勻分布、大小是否與實驗體系相吻合等原則[11]，采用SLAF-predict軟件利用四倍體越橘品種Draper 作為參考基因組（http：//gigadb.org/dataset/100537）[8]，以Hae Ⅲ 、RsaⅠ、RsaⅠ＋Hae Ⅲ和RsaⅠ＋RsaⅡ 4 種酶切方案進行電子酶切預測實驗，根據開發的標簽數等確定酶切方案。選擇水稻品種日本晴（Oryza sativa ssp. japonica）（http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/）作為對照，同步進行平行試驗，利用SOAP[12]軟件對日本晴-水稻測序數據和水稻基因組數據進行比對，進行酶切效益評估，確保試驗的準確性。

1.4 SLAF標簽獲得、SNP標記與驗證

文庫質檢合格后用Illumina 測序，供試不同倍性的越橘測序數據依照參考基因組倍性（2n=2x=24）統一標準進行分析。利用BWA軟件（v0.7.17）將測序reads 比對到參考基因組上，使用GATK（v4.1.7.0）[13]和SAMtools[14]分別進行數據質控，以兩種方法得到的SNP 標記交集作為最終可靠的SNP標記數據集，用于進一步的數據統計和分析。使用vcftools（v0.1.16）軟件，剔除缺失率大于20%或MAF小于0.05的標記。使用SNPhylo 軟件（v 20140701）對SNP 進行過濾，過濾標準為：-p 10 -c 3 -l 0.2 -M 0.2（深度低于3的樣本比例小于10%，且缺失率小于20%），連鎖不平衡R2大于0.2，將vcf 文件轉置為phy 格式后，用Phy-ML3.0軟件的最大似然法（maximum likelihood，ML）構建系統發育樹，并進行1000 次bootstrap 分析（-mHKY85 -b 1000），使用iTOL（v6.6）進行進化樹的可視化分析。

1.5 群體遺傳結構分析

在進行群體遺傳結構分析之前，先使用plink 軟件（v1.90b）用滑窗法過濾掉連鎖不平衡位點，滑窗窗口大小50 kb，滑窗步長10 個SNP，連鎖不平衡R2閾值0.2（--indep -pairwise 50 10 0.2），根據所篩選出的SNP位點17 747 個，占總數0.4%，采用Admixture軟件（v1.3.0）進行遺傳結構分析（for K in 1 2 3 4 5 67；do admixture -- cv file.bed $K | tee log ${K}.out;done）。利用R（v4.2.1）中的軟件包SNP Relate（v1.30.1）進行PCA（principal component analysis）分析，首先使用snpgdsVCF2GDS函數將目標vcf文件轉成gds格式，之后用snpgdsPCA函數對文件進行PCA分析，并使用ggplot2（v3.3.6）進行可視化分析。

2 結果與分析

2.1 酶切方案與建庫評估

HaeⅢ、RsaⅠ+RsaⅡ、RsaⅠ＋HaeⅢ和RsaⅠ不同酶切方案產生的SLAF標簽存在差異，其中RsaⅠ酶切產生的SLAF 標簽最多，共計148 190 個，片段長度在414～416 bp，在基因組上均勻分布，確定為最終酶切方案。將水稻日本晴的測序reads 與其參考基因組進行比對，結果顯示雙端比對效率為97.26%，酶切效率為92.76%（表2），SLAF建庫正常。所有供試越橘屬植物測序共獲得169.87 Mbreads數據，各種質樣品獲得的讀長數目在1 722 285～6 413 536 bp，其中篤斯越橘數據量最小，N6 數據量最大。不同樣品測序Q30在93.92%～95.98%，平均為94.99%，GC含量占38.91%～40.93%，平均為40.24%（表3），表明測序堿基錯誤率低，獲得的數據可靠，可用于后期分析。

2.2 SLAF標簽、SNP分子標記統計

樣品平均測序深度為10.65×，通過對序列進行分析，從62 份越橘材料中共檢測到319 590 個SLAF標簽，通過BWA軟件將SLAF標簽定位到參考基因組上，多態性SLAF 標簽172 513 個，利用GATK 和SAMtools 兩種方法共得到76 299 105 個群體SNP標記，根據完整度＞0.8、次要等位基因頻率（MAF）＞0.05 過濾，共篩選得到4 133 595 個群體SNP 標記，占SNP 總量的5.08%，各樣品完整度為12.92%～44.30%，平均為29.77%，雜合率為3.06%～9.78%，平均為5.44%，說明供試樣品基因組雜合度較高（表4）。根據SLAF 標簽和SNP 標記在染色體上的分布，繪制染色體分布圖，SLAF標簽和SNP標記比較均勻的分布在越橘12 條染色體上（圖1），其中在第6 號染色體上有SNP的集中分布區域。

2.3 SNP標記驗證

筆者在本研究中利用基于SNP 標記的系統進化樹是否能準確反映供試材料的類群劃分和親緣關系來驗證SNP標記的有效性（表5，圖2）。如圖2（聚類圖中心）所示，在系統進化樹中，包括野生種和栽培種在內的越橘屬9 個種62 份試材主要形成3 個類群。Cluster Ⅰ（綠色）：野生種類群，系統進化樹的最原始端，包含供試的所有二倍體野生種、六倍體兔眼越橘，矮叢品種美登、半高叢品種北村、黑珍珠等品種在野生種群中形成分支，反映了從野生中馴化而來的進化過程；Cluster Ⅱ（藍色）：北高叢越橘品種為主的栽培類群；Cluster Ⅲ（紅色）：南高叢越橘品種為主的栽培類群，其中藍豐、瑞卡、努益3 個北高叢品種分屬在該類群上。

為了更清晰、更明確地體現SNP標記反映的品種間親緣關系，本研究列出了品種系譜（表5），系譜比對分析發現，在選育過程中擁有相同親本及互為親子關系的品種，如庫帕與海岸擁有相同父母本，斯巴坦和藍片擁有相同父本，瑞卡與藍豐、陶柔與早藍、藍鳥與伯克利、奧羅拉與埃利奧特等系親子關系，均在圖2 中彼此緊密聚類；骨干親本的雜交后代聚為一類，如早藍、達柔、康維爾等為親本的后代多數聚為類群A，斯坦雷、藍豐、澤西、先鋒、伯克利、維口等為親本的后代聚為類群B，以美國農業部US系列親本及佛羅里達大學Florida 系列親本的雜交后代聚為類群C。綜上，基于SNP 的系統進化樹和聚類分析能夠較準確地反映供試材料的植物學分類和親緣關系等遺傳信息。

2.4 群體遺傳結構分析

2.4.1 越橘群體結構分析基于篩選獲得的4 133595 個SNP 位點，根據K-1 數的Q值分布，設定類群數目（K 值）為1～10 進行聚類，當交叉驗證錯誤率（CV error）最低時為最優分群數，結果顯示K=2 時為最優結果，選擇可以反映供試越橘主要群體結構變化的K值范圍，即K=2～7的群體結構結果見圖3。K=2時供試材料形成兩個清晰完整的類群，類群Ⅰ包含篤斯越橘、蔓越橘、紅豆越橘、云南越橘、烏飯樹、Sparkleberry，歸類為野生群簇，類群Ⅱ由南高叢越橘、北高叢越橘、半高叢越橘、兔眼越橘、矮叢越橘等組成，歸類為栽培群簇，表明野生類型與栽培品種在遺傳信息組成上存在明顯差異，部分栽培品種中嵌合野生資源基因，即存在從野生種到栽培種的單向基因流，但不存在栽培種到野生種的反方向基因流；矮叢品種美登，兔眼品種精華、粉藍、粉紅佳人始終保持著較高比重的野生種遺傳背景。隨著K值的增大，野生種群簇無亞群劃分，說明不同來源的野生資源具有獨立的遺傳背景，種間不存在基因交流，而栽培種群簇存在明顯的亞群結構，說明該群簇內部及與野生種群簇間存在普遍基因交流現象，當K≥5時栽培類群亞群劃分趨于平穩，軍號、黑珍珠、美登、北村、精華、粉藍、粉紅佳人及N6始終包含大于等于K-2個亞群遺傳組分，遺傳背景相對復雜，表現為高度雜合，而北藍、早藍、北陸、陶柔、布里吉塔、N2、齊佩瓦、北極星、瑞卡、藍豐、酷帕、海岸、夏普藍、明星、萊格西等品種亞群間無基因交流或基因交流極少，表現為遺傳背景單一。

2.4.2 主成分分析為了更好地分析越橘個體間的遺傳結構，對樣本材料進行主成分分析（圖4），栽培品種和野生種在空間上的分布是明顯分離的（圖4-A），說明栽培種和野生種間親緣關系遠，遺傳背景差異大，其中半高叢越橘、北高叢越橘、南高叢越橘、矮高叢越橘及兔眼越橘在PCA圖中發生集中重疊；篤斯越橘、蔓越橘、紅豆越橘、云南越橘、烏飯樹、Sparkleberry等野生種在PCA圖上分散分布，其中起源我國東北大興安嶺地區的篤斯越橘、紅豆越橘及原產北美地區的蔓越橘相對集中地分布在PCA 的中上部，而起源美國東南部的Sparkleberry 越橘及中國西南地區的云南越橘、烏飯樹彼此分離，可見野生種在PCA圖上的分布與地理起源相關，彼此因地理隔離而遺傳背景各異，與遺傳結構分析結果一致。為排除云南越橘、烏飯樹和Sparkleberry分散分布對其他試材的影響，對除這3份材料以外的其他試材進行PCA分析（圖4-B），試材按染色體倍性分別形成四倍體（A）、六倍體（B）和二倍體（C）3個類群，其中四倍體類型仍集中重疊分布，而六倍體類型分布較分散。

3 討論

3.1 基于SLAF-seq技術的越橘SNP位點應用

SNP標記是建立在基因組測序基礎上的第三代分子標記，具有多態性好、數目多、密度高、遺傳穩定、分布廣泛及可高通量檢測等優點[15-16]，是開展群體遺傳進化、基因定位、遺傳連鎖圖譜構建及全基因組關聯分析等研究的理想標記。SLAF-seq是一種對基因組特定DNA酶切片段進行簡化測序的技術[9]，非全基因組測序，可避免大量重復序列，大大降低了測序成本，已在多物種SNP位點挖掘中發揮了重要作用，得到的SNP標記五萬到幾十萬個不等[10-13]。本研究利用SLAF-seq技術對越橘屬9個種62份試材進行了平均測序深度為10.65×的簡化測序，為提高標記質量，采用GATK和SAMtools進行共篩選，得到76 299 105個群體SNP標記，通過篩選、過濾共獲得4 133 595個高質量SNP標記，足以支撐供試材料間特異性位點和差異性遺傳信息的發掘。

3.2 基因組遺傳變異揭示不同類型越橘親緣關系

筆者在本研究中通過系統進化樹和聚類分析結合品種系譜的對應關系判斷SNP標記是否有效、可靠。系統進化樹顯示：供試材料被完整劃分為野生種、北高叢品種群和南高叢品種群，與基于植物學特性的類群劃分一致；矮叢品種美登、半高叢品種北村、黑珍珠作為分支聚在野生種類群Cluster Ⅰ中，這與3 個品種從野生種馴化而來的選育過程一致。此外，基于SNP標記最大似然法的聚類圖顯示，半高叢品種北極星、齊佩瓦、北陸，南高叢品種軍號、密斯梯未按傳統分類聚類，剖析系譜發現北極星、齊佩瓦因擁有姊妹系親本而先一步緊密聚類，其中北極星是北高品種藍塔的后代，進而與藍塔聚在一起，藍塔與斯巴坦擁有同一親本早藍而優先聚類，斯巴坦與藍片為同父（US11-93）異母品種，二者緊密聚類，可見上述因品種間存在共同親本，彼此親緣關系近，故聚為一個小群，又如，藍鳥是伯克利的后代，奧羅拉是埃利奧特的后代，瑞卡是藍豐的后代等，均在聚類圖中彼此緊密聚類，說明SNP標記能有效反映供試材料的真實親緣關系。北陸原屬于半高叢品種，但從系譜可知該品種理論矮叢基因僅占25%，北高叢基因占主導，與崔健民等[17]、孫海悅等[18]的結果相一致，并且是伯克利的后代，因此脫離半高叢品種與北高叢品種聚為一類，其植物學性狀也表現出明顯的北高叢品種特性。另外，剖析軍號系譜發現，該品種是經多代雜交獲得的，但親本中藍豐、伯克利、維口等北高叢品種占多數，北高叢遺傳背景占主導，導致軍號脫離南高叢品種與北高叢聚類。所以，本研究結果結合品種系譜，筆者認為北陸和軍號劃分為北高叢品種更合理。綜上，本研究開發的SNP標記能從基因組水平準確反映品種類群劃分和親緣關系，相比較于ESTSSR標記的遺傳分析[7，10，18]，SNP 標記反映的遺傳背景信息更全面、更準確，同時也驗證了本研究開發的SNP標記的有效性和可靠性，可用于后續分析。

3.3 越橘資源遺傳結構分析

聚類分析能反映供試材料的親緣關系，但無法揭示個體的遺傳構成，而遺傳結構分析能夠從DNA水平上展示試材的遺傳結構和個體的遺傳構成，明確每個個體的血統來源和不同基因型間遺傳信息的交流情況，是分析多類型試材遺傳背景的有效手段，是品種遺傳多樣性、品種進化和性狀關聯分析等研究的一項基礎工作[19]。在本研究的遺傳結構分析中，K=2 時62 份材料被完整劃分為野生種群簇和栽培種群簇，且兩個類群間有單向的基因流發生，即部分栽培品種中有野生資源基因流進入，如兔眼越橘品種粉藍、精華、粉紅佳人中有≥30%的野生資源遺傳背景，矮叢品種美登，南高叢品種明星、比洛克西及優良種質N6、N5 等中有＞20%的野生資源遺傳背景，而無從栽培種到野生種的反向基因流發生。隨著K值的增大，栽培群簇存在明顯的亞群結構，說明該類群間及與野生類群間存在不同程度的基因交流，結合PCA分析，栽培品種集中重疊分布，從系譜可知這些品種選育過程中存在近親雜交和骨干親本高頻使用現象，如供試的29 個北高叢品種中有21 個品種是澤西、斯坦雷、藍豐、早藍、先鋒、維口等骨干親本的一代或多代雜交后代，這使得品種間基因同質性高，導致遺傳基礎狹窄，遺傳多樣性水平低；而篤斯越橘、蔓越橘、紅豆越橘、云南越橘、烏飯樹及Sparkleberry 越橘等野生類群始終無亞群劃分，在PCA圖上野生種分散分布、種間無重疊，并且起源高緯度地區（我國東北大興安嶺地區、北美地區）和低緯度地區（美國東南部、我國西南地區）的野生資源空間分布距離遠，說明不同來源的野生資源具有獨立的遺傳背景且種間無基因滲透，可能由地理隔離導致生殖隔離，進而保持著更高的遺傳多樣性所致。

根據本實驗室前期開展的越橘性狀規律研究[20-22]及育種實踐，在排除遠緣雜交不親和情況下，育種雙親遺傳背景差異越大，后代性狀分離越明顯，雖然單果質量、果蒂痕大小等性狀存在趨向低值親本的劣質遺傳，但超親遺傳普遍存在，而近親雜交多數表現為趨中遺傳，優選率低。本實驗篩選的優質親本N6 在果實等表型性狀上與現有品種差異大，從系譜可知該種質為V. corymbosum、V. darrowi、V. ashei、V. angustifolium、V. elliottii、V. constablaei 等多個種的雜交后代，遺傳背景復雜，這與本實驗群體結構分析結果一致。育種中發現N6作為親本配置雜交組合后代優選率高，已培育出遼藍513等[23]優良品種。筆者還發現，除N6 外，軍號、黑珍珠、美登、北村、精華、粉藍、粉紅佳人始終包含大于等于K-2個亞群遺傳組分，表現為高度雜合。綜上，建議在越橘育種親本選擇時，除表型性狀外，親本的遺傳背景應作為重點考慮的因素。

4 結論

越橘栽培品種基因交流頻繁，導致品種間基因同質性高、遺傳基礎狹窄，原因是育種中近親雜交和骨干親本的高頻率使用，而野生種地理生殖隔離種間無基因滲透，具有獨立的遺傳背景，但存在從野生種到栽培種的基因流，反映出在栽培品種選育中應用了野生資源優良基因，但遺傳結構分析顯示源自野生資源的基因占比小，應加大野生資源優良基因挖掘及利用的力度，以擴寬越橘遺傳研究領域，加快種質創新步伐。

致謝：感謝遼寧省果樹科學研究所劉碩副研究員提出的寶貴意見和對英文摘要的修改、校正。

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