柿多倍體育種研究進展

摘要：柿是中國重要的經濟林樹種之一，絕大部分栽培品種為六倍體，極少數日本品種為九倍體。通過自然選育或人工創(chuàng)制培育的柿九倍體品種，憑其優(yōu)良的綜合性狀表現，展現出極大的利用價值和發(fā)展?jié)摿Γ瑫r表明多倍體育種是柿創(chuàng)新優(yōu)異種質、選育突破性良種的重要途徑。通過對國內外利用2n 配子、體細胞染色體加倍、胚乳培養(yǎng)、原生質體融合等途徑誘導柿多倍體的育種研究進展，以及形態(tài)學、染色體計數、流式細胞儀法等倍性鑒定方法的應用情況進行綜述，總結了近年來柿多倍體育種成果。就目前柿多倍體育種技術中存在的問題進行了討論，并對未來研究方向進行了展望，以期為其他經濟林樹種多倍體育種提供有益的啟示。

關鍵詞：柿；多倍體育種；2n 配子；胚乳培養(yǎng)；倍性鑒定

中圖分類號：S665.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）08-1741-09

多倍體是指含有3 套或者3 套以上完整染色體組的生物體，自然界中大部分植物都經歷過多倍化事件，如小麥、棉花、油菜等重要的糧棉油作物，蘋果、獼猴桃、香蕉等果樹，果桑、油茶、柿等經濟林樹種都是典型的多倍體。多倍體植物通常會表現出生長迅速、細胞及部分器官巨大、新陳代謝旺盛、某些生化成分含量提高、育性降低、少籽或無籽、生活力強、對環(huán)境的適應性增強等特點[1]。多倍體育種已成為果樹育種的重要方法之一，并取得了顯著成效，如三倍體蘋果喬納金、四倍體葡萄巨峰、九倍體柿平核無等，在國內外的栽培種中占據著重要地位。

柿（Diospyros kaki Thunb.）絕大部分栽培品種為六倍體（2n=6x=90），極少數栽培品種為九倍體（2n=9x=135），目前未見有關柿種內單倍體的報道。柿可能為同源多倍體，或部分同源異源多倍體[2]，但其起源和進化過程仍是未解之謎。柿的多倍體育種已取得重要進展。九倍體品種平核無是通過實生選育獲得的，是日本第一主栽澀柿品種[3]（圖1），具有樹勢強，花芽多、落果少、豐產，適應性強等特點，在應對較差的立地條件和極端的環(huán)境變化方面表現突出；且其果實易脫澀，耐儲存，脫澀后果肉無褐斑、肉質脆、汁多、味甜，深受廣大消費者喜歡，在鮮食和加工方面具有顯著優(yōu)勢。秋王是日本經人工培育獲得的世界首例九倍體無核完全甜柿新品種，通過太秋未減數（2n）花粉與富有正常卵雜交獲得，其口感似太秋，但著色更好且果面裂紋少，綜合品質優(yōu)于太秋，被評為日本最佳甜柿品種[4]。自然選育或人工創(chuàng)制培育的九倍體品種，憑其優(yōu)良的綜合性狀表現，展現出極大的利用價值和發(fā)展?jié)摿Γ瑫r表明多倍體育種是柿創(chuàng)新優(yōu)異種質、選育突破性良種的重要途徑。筆者在本文中通過對國內外利用2n 配子、體細胞染色體加倍、胚乳培養(yǎng)、原生質體融合等途徑誘導柿多倍體的育種進展，以及形態(tài)學、染色體計數、流式細胞儀法等倍性鑒定方法的應用情況進行綜述，總結近年來柿多倍體育種成果，以供柿育種研究人員參考。

1 柿倍性育種技術研究進展

普通栽培柿品種為六倍體，受高倍性限制，在此基礎上開展柿多倍體育種，目前應用的技術主要包括利用2n 配子誘導柿九倍體、理化誘導體細胞染色體加倍誘導多倍體、胚乳培養(yǎng)誘導柿多倍體，以及原生質體融合創(chuàng)制柿多倍體等。

1.1 利用2n配子創(chuàng)制柿九倍體

2n 配子在植物多倍化過程中發(fā)揮著至關重要的作用，利用自發(fā)或誘發(fā)獲得的2n 配子與正常配子雜交，可獲得綜合了雜種優(yōu)勢和倍性優(yōu)勢的種內三倍體，是植物育種工程中能獲得期望性狀最佳的倍性育種途徑之一。柿九倍體實為種內三倍體，理論上是由未減數配子（2n）與正常配子（n）融合形成的，表現出植物三倍體的染色體行為和偽單性結實特性，生長發(fā)育正常，且其天然無核，該特性使其在鮮食，尤其是加工方面均具有很重要的應用價值。平核無等自然九倍體的存在，表明柿種質可自然形成2n 配子。前期研究表明，部分柿品種可自然形成2n 花粉，如禪寺丸（4.8%）、Yamato- gosho（6.3%）、Ama-yotsumizo（15.5%）等[5]。買旖旎等[6]對38 份柿雄性種質天然2n 花粉含量進行了評價，發(fā)現716 號和中柿4 號種質2n 花粉得率分別可達到7.17%和6.8%。但是，不同品種在不同年份產生2n花粉的比例不同，表明2n 花粉的自然形成受到環(huán)境和基因型的雙重影響。此外，有研究表明日本甜柿品種藤原御所可以自然形成高頻率的2n 卵[7-8]。利用自然形成的2n 花粉或2n 卵進行雜交有望創(chuàng)制出九倍體新種質。Sugiura 等[5]利用禪寺丸2n 花粉與次郎雜交，結合幼胚挽救，獲得九倍體新種質；Yamada 等[9]和房劍鋒[10]均利用禪寺丸與藤原御所雜交，獲得九倍體和十二倍體新種質；Chijiwa 等[11]利用富有和太秋雜交，通過對發(fā)育不完全的種子進行胚培養(yǎng)，獲得了九倍體新種質，經多年品種試驗，審定了甜柿新品種福岡1 號-秋王，該品種為目前品質最佳的甜柿品種；Sun 等[12]通過基因分型，證實秋王來源于太秋2n花粉與富有正常雌配子雜交。

自然形成的2n 配子受環(huán)境和基因型影響，2n 花粉比例相對較低且與正常花粉存在競爭關系，導致多倍體誘導效率較低，不能滿足以創(chuàng)制九倍體甜柿新種質為目標的育種需求。因此，通過理化方法人工誘導更高比例的柿2n 花粉有望提高多倍體育種效率。用秋水仙堿等化學誘變劑處理，以及溫度脅迫處理等均可誘導植物2n 配子的形成。谷曉峰等[13]利用秋水仙堿處理柿雄花芽誘導2n 花粉，結果表明在雄花芽小孢子母細胞處于前期Ⅰ的雙線期至終變期時，以0.3%～0.5%的秋水仙堿間隔6～7 h 注射3 次，2n 花粉比例可達到40.6%。Yamada 等[14]利用低溫4 ℃處理48 h 柿雄花芽，在處理后15～17 d 和17～18 d 收集花粉，2n 花粉比例顯著提高。Mai 等[15]在掌握柿樹雄花芽小孢子母細胞減數分裂進程的基礎上，對處于減數分裂前期的雄花芽施加42 ℃高溫處理4 h，顯著提高了2n 花粉比例（22%）；隨后改進措施，通過間隔多次處理，結合分批次收集花粉，顯著提高2n 花粉比例達46%。目前研究成果主要是通過理化處理誘導出高比例柿2n 花粉，但未有利用誘導獲得的2n 花粉雜交創(chuàng)制出柿九倍體新種質的報道。此外，未見有利用理化處理的方法誘導柿2n雌配子的相關研究。

1.2 體細胞染色體加倍誘導柿多倍體

植物體細胞在受到外界環(huán)境刺激時可引起有絲分裂異常，進而造成體細胞染色體數目變異。有絲分裂異常可發(fā)生在合子或幼胚、分生組織及普通薄壁細胞中，合子或幼胚體細胞染色體加倍可形成完全多倍性的組織，而分生組織和薄壁細胞體細胞染色體加倍往往易形成嵌合體[16]。通過理化處理體細胞染色體加倍誘導柿多倍體已取得一定進展。

Tamura 等[17]用0.1%秋水仙堿處理次郎的原生質體細胞6 d，處理后接種到培養(yǎng)基中誘導愈傷，最終獲得十二倍體植株。谷曉峰等[18]以羅田甜柿試管苗離體葉片為材料，0.3%秋水仙堿處理4～6 d，誘導獲得同質十二倍體。陳緒中等[19-20]以鄂柿1 號和秋焰甜柿離體葉片為外植體，0.5%秋水仙素處理4 d 后接種到培養(yǎng)基中，誘導獲得了十二倍體再生植株；以羅田甜柿離體莖尖為外植體，0.08%秋水仙堿處理2 d后接種到培養(yǎng)基中，誘導獲得了嵌合體植株。符昂等[21]以羅田甜柿組培苗為材料，25 μmol·L-1氟樂靈浸泡莖尖48 h 處理的存活率為53.3%，誘變率為25.0%；50 μmol ·L-1的氟樂靈浸泡莖尖處理48 h 存活率為80.0%，誘變率為12.5%，獲得的變異植株均為六倍體和十二倍體的嵌合體。此外，通過秋水仙堿處理剛萌發(fā)的柿種子，也可高效誘導出十二倍體新種質，誘導率可達10%（未發(fā)表數據）。通過體細胞染色體加倍獲得十二倍體植株，再與六倍體柿進行雜交，是獲得九倍體新種質的有效途徑，因此，十二倍體植株也是重要的育種親本材料。

1.3 胚乳培養(yǎng)誘導柿多倍體

被子植物的胚乳是雙受精產物，屬三倍體組織，理論上通過胚乳培養(yǎng)可直接獲得種內三倍體植株。在胚乳培養(yǎng)時，供體植株的基因型、胚乳發(fā)育程度、胚因子、基本培養(yǎng)基類型、激素種類及用量、碳源、附加成分、培養(yǎng)條件等都會影響胚乳愈傷組織誘導率、分化率等；其中供體基因型是主要因素。前期科研人員在不同柿品種中進行了胚乳培養(yǎng)，取得一些進展。莊東紅等[22]對黑柿、長良品種的胚乳進行培養(yǎng)，通過愈傷組織獲得再生植株，經檢測再生植株根尖染色體數目為2n=90（6x）或180（12x），但未獲得九倍體植株。陳緒中等[23]對羅田甜柿自然授粉后70 d的胚乳進行了培養(yǎng)，采用不同的細胞分裂素和生長素組合，最終獲得十二倍體植株。此外，蒲婷婷等對富有雜交種子的胚乳進行培養(yǎng)，通過優(yōu)化愈傷誘導培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基，成功獲得九倍體1 株，十二倍體2 株（未發(fā)表數據）。以上研究結果表明胚乳愈傷組織細胞在培養(yǎng)過程中發(fā)生了染色體數量的變化，易獲得十二倍體或嵌合體，而獲得理想的九倍體新種質較為困難。

1.4 原生質體融合創(chuàng)制柿多倍體

原生質體融合技術可獲得多倍體植株，目前通過PEG 或電融合法已獲得多種果樹的體細胞雜種或胞質雜種[24]。六倍體柿與其他柿屬植物存在很大的種間或倍性間雜交障礙，通過原生質體融合進行體細胞雜交，可以產生特殊倍性的種間雜種。Tamura 等[25-26]建立了日本柿的體細胞雜交技術，利用電融合技術將次郎和駿河2 個六倍體品種的原生質體進行融合，并獲得了種內十二倍體雜種（2n =12x=180）；隨后又將D. glandulosa（2n=2x=30）與六倍體次郎的原生質體進行融合，獲得149 個愈傷系，其中63 個分化獲得植株，通過根尖染色體計數觀察，證實獲得的體細胞雜種均為八倍體（2n=8x=120）。谷曉峰等[27]以羅田甜柿休眠芽莖尖誘導的愈傷組織為材料，進行了原生質體分離、純化、培養(yǎng)等條件優(yōu)化，初步建立中國甜柿原生質體分離培養(yǎng)技術體系。通過柿與其近緣種進行原生質體融合，可將近緣種的一些重要性狀引入到柿中，比如增強柿的抗病性、抗旱性、抗寒性等。

1.5 其他途徑

芽變是柿種質創(chuàng)新的重要途徑，日本已登記的新品種有66 個，其中25 個是芽變品種。九倍體柿品種平核無是一個重要的突變體材料，其芽變品種有早熟芽變、大果芽變、小果芽變等。Yakushiji 等[28]發(fā)現一株平核無矮化的芽變植株，其莖長、節(jié)間長、葉片、花、果實等均小于平核無，且其可以形成正常的種子，經倍性鑒定后證實為八倍體（2n=8x=120），八倍體植株恢復形成正常種子的能力可能是其倍性由各奇倍性（9x）突變?yōu)榕急缎裕?x）所致。

2 柿倍性鑒定技術研究進展

2.1 形態(tài)鑒定

形態(tài)鑒定可以依據植株莖粗細、葉形指數、生長快慢、花果和種子大小等指標來進行鑒定。陳緒中[19]在比較秋水仙素處理得到的十二倍體與六倍體對照中發(fā)現，多倍體甜柿植株與其他作物多倍體類似，莖干粗壯、節(jié)間較短、葉片較大，氣孔大小與倍性具有相關性，但在多倍體間氣孔密度上沒有明顯差異。房劍鋒[10]在利用2n 卵培育出的六倍體和九倍體新種質的研究中觀察到葉片氣孔大小與倍性呈正相關，而與氣孔密度呈負相關。張永芳等[29]觀察柿屬8 種植物發(fā)現四倍體德陽柿花粉粒大小介于二倍體與六倍體之間。

2.2 染色體計數

通過細胞學方法進行染色體計數最直接、準確，相比于形態(tài)觀察縮短了周期且更為準確。目前柿屬植物染色體計數通常用壓片法來進行。1980 年，李懋學[30]以對二氯苯為預處理試劑報道了染色體數2n=90 的柿材料。1990 年，Zhuang 等[31]檢測平核無、刀根早生染色體數目為2n=135，且發(fā)育不成熟和退化的種胚植株中包含染色體數目106～114 的非整倍體。1999 年，楊勇等[32]對中國絕大多數柿產區(qū)及日本原產柿品種進行染色體計數，在次郎種子中同樣觀察到染色體數目為83 或87 的非整倍體。2000年，唐仙英等[33]對20 個無核柿品種進行染色體計數，并通過種子發(fā)育分析認為中國柿品種的無核與染色體倍性沒有相關性。

2.3 流式細胞術

運用流式細胞儀可測定植物基因組大小并進行倍性鑒定，其優(yōu)點是快速、簡單、高效，重復性好。早在1998 年，Tamura 等[26]就運用流式細胞儀檢測了柿品種次郎及雜交后代等的核DNA含量，進一步鑒定次郎為六倍體、D. glandulosa 為二倍體等，同時也發(fā)現了倍性為八倍體和十二倍體的嵌合體。陳緒中等[20]等運用流式細胞儀初步證實了秋水仙素誘導鄂柿1 號離體葉片獲得的變異株為十二倍體。

Yakushiji等[28]運用流式細胞術測得2005 年日本發(fā)現主栽品種九倍體澀柿平核無芽變產生的矮化品種Hasshu 的DNA含量介于六倍體次郎與九倍體平核無之間，結合染色體計數，證實其為八倍體。但是，在對柿新種質進行流式細胞儀檢測時，發(fā)現同一種質不同葉片部位的樣品在檢測時的出峰位置不同，影響其倍性的判定。這可能是由于柿子葉片富含多糖、單寧、酚類物質等，造成細胞內黏性過高，黏性物質致使細胞質和細胞核緊密黏在一起，影響分離的細胞核純度，并加速細胞核老化，阻礙流式細胞儀中鞘液的流動，以致于不能準確鑒定樣品的倍性[34]。因此，需要進一步篩選適合柿的裂解液，并改進樣品制備的處理方法。

對于柿倍性鑒定而言，其染色體多且小，用染色體計數方法需考慮合適的材料，如根尖和莖尖等有絲分裂較為活躍的組織，這些組織相對流式細胞術所需的葉片較難獲得，且壓片需要掌握一定的技巧，操作難度較大，費時費力。因此，可以通過流式細胞術對大批材料的倍性進行初步鑒定，再結合染色體計數法對重點候選材料進行精準倍性鑒定。

3 問題與展望

2n 配子在有性多倍化、高頻率傳遞雜合性和上位性等方面有其他育種方法無法比擬的優(yōu)勢。相對于細胞學特征難以觀察的2n 雌配子，2n 花粉檢測簡單易行，在植物倍性育種方面應用更為廣泛。但是2n 花粉在應用方面也存在一些問題：首先，為滿足雜交育種對2n花粉量的需求，需要提高2n 花粉的產生頻率，即建立高效的2n 花粉理化誘導技術；其次，2n 花粉萌發(fā)相對遲緩，導致其與正常花粉競爭力差，因此為提高倍性育種效率，需要建立有效的2n花粉分離技術，目前已報道的2n 花粉分離方法主要有篩選法[35-36]、靜電分離法[37]、速度沉降法[38]和流式細胞儀法[39]等，而柿的2n 花粉分離僅有篩選法的報道，可以嘗試其他更方便并能保證其活力的分離方法；再次柿2n 花粉與正常配子雜交后，因胚乳不平衡會出現種子胚乳敗育現象，需要結合幼胚組織培養(yǎng)對其進行挽救，胚挽救獲得的組培苗通過試管苗嫁接可以縮短育種周期，但目前報道的嫁接成活率最高為45%[40]，需要進一步優(yōu)化嫩枝嫁接技術。

2n 雌配子不存在競爭問題，授粉后即能獲得種子，利用價值更高。但因其細胞學特征難以觀察，一般只能通過對其雜交后代倍性的檢測來確定2n 雌配子的發(fā)生，嚴重限制了其在果樹倍性育種中的應用。隨著現代生物技術的發(fā)展，對2n 配子發(fā)生機制的研究日益增多[41-42]。通過對2n 配子形成機制的研究，解析相關基因和調控機制，不僅可以利用分子設計育種對現有材料進行遺傳改良，使其自發(fā)形成高比例的2n 配子，也可以開發(fā)相關連鎖分子標記，篩選2n 配子高產植株，促進2n 配子在育種中的高效利用[43]。因此，如何將分子育種技術與倍性育種相結合，加速柿遺傳改良進度，是亟須進一步探討和研究的問題，也是未來柿育種的發(fā)展方向。

體細胞染色體加倍誘導多倍體是果樹上常見的無性多倍化途徑，包括在體誘導和離體誘導兩種方式，前者主要是以秋水仙堿等誘變劑處理頂芽、腋芽，后者是處理種子、組培離體葉片和莖尖等。在體誘導往往獲得嵌合體現象嚴重，進一步純化耗時耗力；而通過種子或愈傷途徑誘導多倍體時，誘導加倍后的單細胞再生成植株，獲得純合體的概率較大[24]；通過處理離體莖尖誘導多倍體時，誘變劑浸泡處理效果優(yōu)于直接加入培養(yǎng)基中，但也易出現嵌合體[44]。柿組培體系已經建立，并通過誘導離體葉片或莖尖等成功獲得一些十二倍體材料，但是誘導效率較低。以種子為材料，通過秋水仙堿處理剛萌發(fā)的種子，十二倍體誘導效率可達10%，種子播種后可直接成苗，省時省力，是一種高效的多倍體誘導途徑，可以快速創(chuàng)制大批多倍體新種質，為優(yōu)異新品種選育提供材料基礎。

胚乳培養(yǎng)是獲得種內三倍體的重要途徑之一，但是胚乳組織在形成愈傷并進一步分化成植株的過程中，會發(fā)生染色體數目的變化，恢復成二倍性細胞或突變成四倍性細胞，導致種內三倍體的誘導效率降低。因此，以創(chuàng)制九倍體柿新種質為目的的胚乳培養(yǎng)，需要對其培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進一步優(yōu)化，并對引起胚性愈傷組織染色體數目變化的調控因子進行研究。此外，原生質體融合創(chuàng)制多倍體已在多種果樹上獲得成果，其中以柑橘原生質體融合技術最為成熟；柿在此方面也開展了部分研究，但與其他果樹相比仍然存在很大差距，需進一步加強這一方面的研究。

除多倍體育種外，果樹單倍體育種方法也日益成熟，獲得的單倍體或雙單倍體新種質進一步用于基因組測序，可以推動多年生果樹的分子生物學和遺傳學研究[45]。單倍體育種的主要途徑包括[46-47]：①種間或屬間遠緣雜交，花粉雖不能正常受精，但可以刺激卵細胞發(fā)育成胚；②物理照射或化學誘變，花粉失去活力，授粉后刺激卵細胞孤雌發(fā)育，產生單倍體；③未授粉的子房或胚珠培養(yǎng)；④花藥和花粉培養(yǎng)；⑤利用基因編輯技術CRISPR 產生單倍體。目前雖未見有關柿單倍體育種的報道，但柿與油柿、柿與美洲柿等種間遠緣雜交工作已經相繼開展，且配套的幼胚挽救技術已經成熟，因此，多種單倍體誘導途徑皆可嘗試。柿作為傳統木本糧食樹種，在中國栽培歷史悠久，但其起源與進化歷程仍不清楚，并且其六倍體基因組復雜難解，對重要經濟性狀形成的分子機制解析缺乏完整的遺傳信息，嚴重阻礙了柿分子育種的進程。因此，開展柿單倍體育種，對柿分子遺傳學相關研究具有重要意義。

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