慢性阻塞性肺疾病急性加重痰熱壅肺證尿液代謝組學研究※

劉 銳 劉付昌盛 盧夢月 田 智

(1.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院呼吸內科,廣西 南寧 530000;2.廣西中醫藥大學2018級碩士研究生,廣西 南寧 530000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructivepulmonary disease,COPD)是一種常見的以持續氣流受限為特征的慢性呼吸系統疾病,其中COPD急性加重(AECOPD)是指患者出現超越日常狀況的持續惡化,短期內咳嗽、咯痰、氣短和/(或)喘息加重,痰量增多,呈膿性或黏膿性,可伴發熱等炎癥明顯加重的表現,并需改變基礎COPD常規用藥。AECOPD屬中醫學“喘證”“肺脹”等范疇,認為其發病多是由于感受外邪、痰濁內蘊、情志失調等因素導致肺宣降功能失調所引起。中醫診療過程講究“理法方藥,辨證論治”,其中“證”是對疾病過程中所處階段病位、病因、病性及病勢等所作的病理性概括[1]。目前,中醫辨證均以癥狀、體征、舌象、脈象等為依據,但在辨證過程中往往會因個人經驗豐淺不同而致使辨證結果不一致,這就導致了不同醫生對同一患者的證候診斷難以重復,因此目前對于“證”的判斷最大的問題就是太多主觀指標,而缺乏全面、準確的客觀指標來輔助診斷。先前有學者通過代謝組學技術探討了AECOPD痰熱壅肺證的血清代謝組學情況,都取得了很好的成果[2]。本研究通過運用最新代謝組學技術液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)對比AECOPD痰熱壅肺證患者與健康人的尿液差異,尋找其可能的尿液代謝標志物,并分析其代謝通路,以為中醫“證”的判斷提供更加科學的依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020年1月至2020年12月在廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院呼吸內科和老年病科住院的10例AECOPD痰熱壅肺證患者為試驗組,男5例,女5例,年齡(55.40±4.71)歲,第1秒用力呼氣容積/用力肺活量(FEV1/FVC)(68±0.77)%,FEV1占預計值的百分比(FEV1%pred)(69±1.18)%。另選取10例同期體檢健康者為空白組,男5例,女5例,年齡(53.40±2.36)歲。設置試驗組為A組,10名患者標記為a1、a2、a3……a10,設置空白組為Z組,10名健康者標記為z1、z2、z3……z10。

1.2 病例選擇

1.2.1 診斷標準

1.2.1.1 AECOPD 西醫診斷參照《慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)診治中國專家共識(2014年修訂版)》中AECOPD的診斷標準[3]。中醫診斷參照《慢性阻塞性肺疾病中醫證候診斷標準(2011版)》中AECOPD痰熱壅肺證的辨證診斷標準[4]。

1.2.1.2 健康 參照《中醫體質分類與判定(ZYYXH/T157-2009)》[5]標準進行中醫體質辨識為平和質,且經臨床醫生判定為健康。

1.2.2 納入標準 符合上述AECOPD的中、西醫診斷及健康標準;年齡40～75歲,AECOPD病情分級為Ⅰ～Ⅱ級;入選前3個月內未參加其他藥物干預的臨床研究;自愿接受試驗,并簽署相關的知情同意書。

1.2.3 排除標準 診斷為慢性支氣管炎,但未達到COPD標準者;COPD穩定期患者;合并有支氣管擴張、彌漫性泛細支氣管炎、肺栓塞、肺性腦病及其他慢性肺部疾病者;合并有結核、真菌感染或其他肺部疾病引起的咳嗽、咯痰、喘息者;合并有循環系統、神經系統、消化系統、造血系統等嚴重疾病者;合并有精神病、智力低下、認知功能缺陷、癲癇等疾病者。

1.3 研究方法

1.3.1 主要儀器與試劑 數據采集儀器系統主要包括串聯質譜(美國SCIEX公司)和超高效液相色譜(美國SCIEX公司)。試劑包括甲醇、乙腈(級別:色譜純,德國Merck公司)、標準品(級別:色譜純,美國Sigma-Aldrich公司)。

1.3.2 樣品采集與保存 2組均需清淡飲食而且空腹8 h后,于次日早上留取晨尿10 mL,然后將標本放在4 ℃環境下靜置10 min,再抽取1 ml尿液進行離心,10 000轉/min,溫度4 ℃,離心5 min,離心后吸取上層尿液800 μL,并將樣本儲存于-80 ℃冰箱,備用。

1.3.3 液相條件與質譜條件

1.3.3.1 液相條件 ①色譜柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C181.8 μm,2.1 mm×100 mm。②流動相:A相為超純水(0.1%的甲酸),B相為乙腈(0.1%的甲酸)。③洗脫梯度:水/乙腈0 min為(95∶5V/V),11.0min為(10∶90V/V),12.0 min為(10∶90V/V),12.1 min為(95∶5V/V),14.0 min為(95:5V/V)。④流速0.4 mL/min,柱溫40 ℃,進樣量2 μL。

1.3.3.2 質譜條件 電噴霧離子源(ESI)溫度500 ℃,質譜電壓5500 V(positive)-4500 V(negative),離子源氣體Ⅰ(GSⅠ)55psi,氣體Ⅱ(GSⅡ)60psi,氣簾氣(CUR)25psi,碰撞誘導電離(CAD)參數設置為高。在三重四極桿(Qtrap)中,每個離子對是根據優化的去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)進行掃描檢測。

1.4 代謝物定性與定量 基于自建靶向標品數據庫(MWDB),根據檢測標本的保留時間(RT)、子母離子對信息及二級譜數據進行定性分析,代謝物的定量是基于三重四極桿質譜多反應監測模式(MRM)的分析原理完成。

1.5 數據評估 經上述定性定量分析的數據采用正成分和聚類分析進行數據評估,采用質控樣本(QC)以確保儀器分析的數據具有重復性和可靠性。

1.6 數據結果分析 經對數據進行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)處理后篩選,篩選原則:①當差異性代謝產物屬于上調時,則按照差異倍數(FC)≥2篩選,而當差異性代謝產物屬于下調時,按照FC≤0.5篩選差異性代謝產物;②在上述的基礎上,同時選取投影的可變重要性(VIP)≥1的差異代謝物。上述篩選的代謝產物再通過京都基因與基因組百科全書(KEGG)數據庫和人類代謝組數據庫(HMDB)進行通路富集分析并篩選重要的差異代謝物。

2 結果

2.1 2組PCA分析 PCA分析可以了解2組樣本之間的總體代謝差異和組內樣本之間的變異度大小,圖中顏色范圍表示本組的95%可信區間。結果顯示2組各樣本可以得到很好區分。見圖1。

圖1 2組PCA分析圖

2.2 2組OPLS-DA分析 顏色范圍表示每組的95%可信區間。結果顯示2組的可信區間可以得到很好的區分。見圖2。

2.3 2組差異代謝物篩選結果 差異代謝物經篩選后,共篩選出143個差異代謝物,其中上調的代謝物有59個,下調的代謝物有84個,上升的是咖啡因、可可堿、1,7-二甲基尿酸等,下降的是肉毒堿、泛酸、L-半胱氨酸等,差異代謝物在2組間的差異顯著。見表1、圖3。

表3 2組部分差異代謝物篩選結果

注:圖中的每個點表示1種代謝物,橫坐標表示某代謝物在兩樣品中定量FC的對數值,縱坐標表示VIP值,綠點代表下調(Down)的差異代謝物,紅點代表上調(Up)的差異代謝物,黑色代表檢測到但差異不顯著(Insignificant)的代謝物。

2.4 2組差異代謝物通路富集分析及篩選結果 2組差異代謝物通過KEGG數據庫和HMDB數據庫進行通路富集分析并篩選顯示,主要涉及半胱氨酸和蛋氨酸代謝(Cysteine and methionine metabolism)、色氨酸代謝(Tryptophan metabolism)、纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸的降解(Valine,leucine and isoleucine degradatior)、泛酸酯和輔酶A的生物合成(Pantothenate and CoA biosynthesis)、咖啡因代謝(Caffeine metabolism)等通路,再經過篩選得出8個重要差異代謝物,即半胱氨酸、甲酰蛋氨酸、色氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、泛酸、咖啡因及可可堿。見圖4、5。

注:圖中點越大或者越紅表示富集到相應通路上的差異代謝物個數多

注:圖中點越大或者越紅表示富集到相應通路上的差異顯著代謝物個數多

3 討論

“辨證論治”是中醫診療學中精髓所在,但臨床實際“辨證”中最大的問題就是主觀性太強,而缺乏對應的全面、準確的客觀指標來輔助診斷。代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后新近發展起來的一門學科,是系統生物學的重要組成部分。王喜軍等[6]認為,中醫方證代謝組學的理論及方法有助于實現建立中國式精準醫學模式,有助于進一步提升中醫藥研發的原始創新能力。相關研究表明,AECOPD患者的代謝組學主要是氨基酸、維生素、糖類、脂肪等人體能量物質的含量發生變化,其相關代謝通路受到擾動[7-8]。本研究結果也顯示,半胱氨酸、甲酰蛋氨酸、色氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、泛酸、咖啡因及可可堿可能是AECOPD痰熱壅肺證尿液代謝標志物,涉及半胱氨酸和蛋氨酸代謝、色氨酸代謝、纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸的降解、泛酸酯和輔酶A的生物合成、咖啡因代謝等通路。

半胱氨酸是人體的條件必需氨基酸和生糖氨基酸,具有抗氧化、抗炎等多種作用,不僅能夠明顯抑制炎性反應中活性氧對核因子κB(NF-κB)通路的活化,而且減少了炎癥因子的轉錄和表達[9],同時半胱氨酸的衍生物乙酰半胱氨酸、半胱氨酸甲酯等為呼吸道黏液溶解劑,并具有促進受損支氣管黏膜修復的作用。半胱氨酸可由體內的甲酰蛋氨酸轉化而來,半胱氨酸和甲酰蛋氨酸均下降可促進炎性反應的發生,加快炎癥因子的轉錄和表達[10]。

色氨酸是5-羥色胺的前體,是人體中重要的神經遞質,相關研究表明色氨酸參與了AECOPD的發生發展,機制可能通過參與抗氧化應激和炎性反應有關[11]。色氨酸代謝途徑主要分為合成組織蛋白質和分解代謝,經氧化后可轉變為煙酸。煙酸屬于維生素B族[12],又稱尼克酸、維生素B3,具有防止細菌侵襲及炎性反應的作用,煙酸的減少可導致人體防止細菌侵襲及炎性反應的作用降低,而且影響了機體氧化還原反應,煙酸下降還可加重色氨酸的下降,導致AECOPD痰熱壅肺證患者氧化應激與抗氧化應激失衡,炎性反應加重。

異亮氨酸、亮氨酸為人體必需氨基酸,主要存在于肌肉和腎、腦等重要器官中。異亮氨酸、亮氨酸及纈氨酸都是支鏈氨基酸,通過氨基酸的氧化作用為機體供能,能夠更快地分解轉化為葡萄糖,可為組織長時間持續運動提供能量,其下降說明機體攝入減少或機體消耗能量增加,引起呼吸肌功能下降,導致肺的呼吸肌疲勞和呼吸衰竭,進而誘發COPD急性加重的發作[13]。

泛酸又叫維生素B5,有多種生物功能,如提供能量、提供活性物質、激活免疫功能等[14]。泛酸在人體內可轉變成輔酶A,參與脂肪酸代謝反應。輔酶A在新陳代謝中主要發揮酰基載體的功能,參與蛋白質和能量代謝等多種生物活動,還可以通過修飾蛋白質來影響蛋白質的定位、穩定性及活性,輔酶A為生物體提供了90%的能量。泛酸也可以通過增加谷胱甘肽的生物合成,從而減緩細胞凋亡和損傷,可以對損傷的細胞具有很好的保護作用。泛酸的下降影響了泛酸酯和輔酶A的生物合成代謝通路,導致人體能量下降,加快細胞的損傷,從而引起COPD的急性發作。

可可堿能抑制嗜中性粒細胞黏附和激活,抑制促炎因子的產生和釋放,促進抑炎因子的生成,對肺功能損傷恢復有一定的保護作用[15]。可可堿甲基化后即為咖啡因,咖啡因在肝臟中被分解產生3種代謝產物,分別是副黃嘌呤、可可堿及茶堿,其中茶堿具有舒張呼吸肌作用。此外咖啡因不僅有抗氧化、舒張血管、松弛平滑肌等作用,還具有緩解COPD患者呼吸肌疲勞的作用[16]。AECOPD患者體內的咖啡因和可可堿均上升,可能是機體為了對抗自身炎癥和緩解呼吸肌疲勞代償性升高導致的。

COPD是一種破壞性的肺部疾病,是以不完全可逆的氣流受限為特征的疾病,氣流受限通常呈進行性發展并與肺對有害顆粒或氣體的異常炎癥反應有關[17-18]。COPD是一種可以預防和治療的慢性氣道炎癥性疾病,COPD雖然是氣道的疾病,但對全身的系統影響也不容忽視[19-20]。綜上所述,AECOPD痰熱壅肺證患者較健康人相比可見氨基酸、維生素等人體能量物質含量的變化,其中半胱氨酸和蛋氨酸代謝、色氨酸代謝及咖啡因代謝通路異常可引起患者氧化應激與抗氧化應激失衡,炎性反應加重,導致機體抵抗力降低,如感染細菌、病毒等,從而引起患者氣喘、咳嗽、咯痰等癥狀;纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸的降解、泛酸酯和輔酶A的生物合成代謝通路異常,反映了AECOPD痰熱壅肺證患者患病日久,正氣損傷,衛氣不足,以致體內蛋白質等能量物質相應的損耗增多,能量代謝異常,從而引起患者呼吸肌疲勞,導致呼吸困難、乏力等癥狀。總之,分析研究差異代謝物和異常代謝通路為探索AECOPD痰熱壅肺證的本質提供了可能,可為疾病早期中醫診斷、預防及治療提供依據,而且隨著代謝組學技術的發展,可以更好地從代謝組學層面研究探討中醫,搭建中醫與現代醫學的橋梁,促進中醫的發展,為人類的健康更好地服務。