基于網絡藥理學探討桃核承氣湯治療精索靜脈曲張的作用機制※

張 超 仲崇副 史卓卓 高兆旺△

(1.山東省中醫藥大學2020級碩士研究生,山東 濟南 250013;2.山東中醫藥大學第一附屬醫院男科,山東 濟南 250014)

精索靜脈曲張是指精索靜脈叢內靜脈盤曲、擴張,靜脈回流受阻,癥狀主要表現為小腹、睪丸重墜感或疼痛不適,陰囊潮濕,還可影響精液質量,導致不育,是男科臨床上常見的疾病,發病人群主要為中青年男性[1]。西醫臨床對于精索靜脈曲張的治療主要為手術治療,但術后部分患者癥狀減輕不明顯,且易復發[2]。精索靜脈曲張可歸屬于中醫學“筋疝”“筋瘤”等疾病范疇,認為瘀血阻滯是其發病的主要原因,治療應以活血行血為主。中醫藥在治療精索靜脈曲張方面效果顯著,能有效減輕癥狀,改善因精索靜脈曲張而降低的精液質量[3]。桃核承氣湯出自《傷寒論》,原方包括桃仁、大黃、桂枝、芒硝、甘草5味藥,是治療蓄血證的一首方劑,研究表明其在治療精索靜脈曲張方面亦有較好的療效[4]。近年來關于中藥復方治療疾病的臨床研究和實驗研究不斷深入細致,網絡藥理學作為一種新興的數據可視化預測分析方法,其通過建立“藥物-化合物-靶點-疾病”網絡圖等,預測中藥復方治療疾病的有效活性成分、作用靶點、關鍵通路等,從而探究中藥復方治療疾病的作用機制。本文利用網絡藥理學方法,探討桃核承氣湯治療精索靜脈曲張的潛在機制,以為其臨床應用提供參考和依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 桃核承氣湯活性化合物及靶點篩選 依托中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和UniProt數據庫(https://www.uniprot.org),篩選條件為口服生物利用度(OB)≥30%及類藥性(DL)≥0.18,獲得并整合桃核承氣湯中5味藥物中的4味(桃仁、大黃、甘草、桂枝)活性化合物和相關作用靶點。運用化源網(https://www.chemsrc.com)、PharmMapper數據庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper)及UniProt數據庫轉化并得到芒硝的活性化合物和相關作用靶點。

1.1.2 精索靜脈曲張疾病靶點的篩選和交集靶點獲取 在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org)中以“Varicocele”為主題詞,搜索并提取精索靜脈曲張疾病相關的靶點,整合去除重復項后,通過Venny 2.1網絡繪圖工具把桃核承氣湯作用靶點和精索靜脈曲張靶點進行取交集分析,得到藥物-疾病共同靶點并形成韋恩圖。

1.2 研究方法

1.2.1 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖 將篩選獲得的桃核承氣湯和精索靜脈曲張的交集靶點與其對應的活性成分、中藥匹配后導入Cytoscape 3.8.2軟件,繪制“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖,并對活性化合物和靶點信息進一步分析,得出Degree值,并篩選排序靠前活性化合物。

1.2.2 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建 把桃核承氣湯作用靶點和精索靜脈曲張疾病靶點交集部分導入到STRING數據庫中(https://string-db.org),將物種設定為“Homo sapiens”,選定相互作用閥值標準為“mediumconfidence=0.4”,其余設置維持不變為默認設置,得到PPI網絡,隱藏單個無聯系節點。從STRING網站將PPI網絡數據文件引入到Cytoscape 3.8.2軟件,進行網絡拓撲分析,選擇核心基因。因靶點數目較多,首先以Degree值>2倍中位值進行首次篩選,然后選取靶點的中介中心性(Betweenness centrality)、緊密中心性(Closeness centrality)、度中心性(Degree centrality)、局部邊連通性(Location area code)及鄰域連通性(Neighborhood connectivity)6個參數,分別進行>中位值篩選,最終獲取“藥物-疾病”的核心靶點信息。

1.2.3 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 基于Metascap平臺(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)對5味中藥與精索靜脈曲張交集靶點分別進行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析,物種輸入輸出均選擇“Homo sapiens”,默認設置P<0.05,最小富集基因數為3,分別將結果導出,探討靶點基因富集的效用和中藥靶點作用的通路,利用Omicshare云工具(https://www.omicshare.com)把結果可視化并導出氣泡圖。

1.2.4 “藥物-化合物-靶點-信號通路”網絡圖構建 參照KEGG富集通路信息,設置P<0.05,選取前20個KEGG信號通路及其靶點信息,通過核心靶點與信號通路上富集的靶點相互匹配,取得相互交集的富集靶點,最后導入Cytoscape 3.8.2軟件繪制“藥物-化合物-靶點-信號通路”網絡圖。

2 結果

2.1 桃核承氣湯的活性化合物及作用靶點 經相關數據庫篩選共獲得141個活性化合物,其中桃仁23個,桂枝7個,大黃16個,芒硝3個,甘草92個,并得到以上活性化合物所對應的靶點,將靶點導入UniProt數據庫進行基因標準化轉化,去掉重復靶點,取得230個化合物靶點。

2.2 精索靜脈曲張靶點篩選及與活性化合物交集靶點篩選 從GeneCards數據庫中搜索精索靜脈曲張疾病相關靶點,并進行多層篩選,除去重復靶點后共得到208個疾病靶點。將上述獲得到的208個疾病靶點與230個桃核承氣湯有效化合物靶點進行交集整合分析,得出40個交集靶點。

2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡構建 利用Cytoscape構建桃核承氣湯治療精索靜脈曲張的“藥物-成分-靶點-疾病”網絡圖。經綜合分析得出β-谷甾醇(β-sitosterol,Degree值39)、槲皮素(quercetin,Degree值34)、山萘酚(kaempferol,Degree值17)、蘆薈大黃素(aloe-emodin,Degree值10)、常春藤皂甙元(hederagenin,Degree值8)等可能是桃核承氣湯治療精索靜脈曲張的重要有效藥物成分,其中β-谷甾醇為桃仁、桂枝、大黃共有的活性成分。見圖1。

注:VC為精索靜脈曲張

2.4 PPI核心網絡圖構建和核心靶點篩選 把40個交集靶點導入STRING數據庫進行分析,將STRING數據庫分析結果通過Cytoscape 3.8.2軟件進一步分析和可視化,并建立相應PPI網絡圖,并進行Degree值分析,共涉及38個節點,413條邊,其中節點直徑和顏色深淺表示Degree值的大小,直徑越大,顏色越深,對應的Degree值越大,反映為藥效作用更強的蛋白質,邊的粗細反映結合率大小的評分。排名前10的節點為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤蛋白p53 (TP53)、胱天蛋白酶3(CASP3)、前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)、人雌激素受體1(ESR1)、白細胞介素6(IL-6)、IL-1β、同源性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)、熱休克蛋白90AA1(HSP90AA1)。見圖2、3。

圖2 藥物活性化合物與疾病交集靶點PPI網絡圖

圖3 “藥物-疾病”核心靶點篩選過程圖

2.5 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 將40個交集靶點導入Metascape平臺進行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析,并利用Omicshare平臺對結果進行可視化,篩選條件為P<0.05。GO功能富集分析共得到2268個數據條目,其中生物過程(BP)1970個、細胞組分(CC)109個、分子功能(MF)189個,主要對涉及的BP分析顯示,桃核承氣湯治療精索靜脈曲張疾病的靶點重點密集于對含氧化物的反應(response to oxygen-containing compound)、凋亡過程的調控(regulation of apoptotic process)、程序性細胞死亡的調節(regulation of programmed cell death)、細胞凋亡過程(regulation of cell death)、細胞對化學應激的反應(cellular response to chemical stimulus)等。KEGG通路富集分析共得到129條代謝通路,選排名前20條信號通路進行富集分析并作圖,結果顯示桃核承氣湯治療精索靜脈曲張的主要通路有癌癥相關通路(Pathways in cancer)、流體剪切應力和動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、乙型肝炎(Hepatitis B)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、糖尿病并發癥中的晚期糖基化產物-晚期糖基化終末產物受體(AGE-RAGE)信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)等。見圖4、5。

圖4 桃核承氣湯治療精索靜脈曲張交集靶點的GO功能富集分析

2.6 “藥物-化合物-靶點-信號通路”網絡圖 篩選整合KEGG通路富集分析排名前20的信號通路,將桃核承氣湯中中藥活性化合物與疾病的交集靶點和篩選出的信號通路導入Cytoscape 3.8.2,構建“藥物-化合物-靶點-信號通路”網絡圖,共有167個節點,1372條邊。根據Degree值設定每個節點大小,節點圖形越大、顏色越深代表該通路的靶點數和信號通路越多。見圖6。

圖5 桃核承氣湯治與精索靜脈曲張交集靶點的KEGG通路富集分析

注:菱形為靶點信息,圓形為藥物有效化合物,正六邊形為信號通路,正方形為中藥。

3 討論

中醫學認為,血瘀貫穿精索靜脈曲張疾病的始終,在以行氣活血治療的同時應根據證型的不同兼以補腎、疏肝、清熱等治法[5]。郭軍教授依據臟腑關系辨證,認為精索靜脈曲張的病機主要為肝郁腎虛,瘀血是主要的病理因素和外在表現,腎虛是根本,肝郁血瘀為標[6]。高兆旺等[7]從研究瘀血與靜脈曲張的關系入手,認為治療精索靜脈曲張的關鍵是化瘀通絡。樊金卿等[8]主張精索靜脈曲張病位在腎,腎氣虛無力推動血行,“氣行則血行”,故應活血補腎標本兼治。杜寶俊等[9]認為,精索靜脈曲張的病機在于肝失疏泄,肝氣不利,血瘀為標,治療上應從調肝活血論治。桃核承氣湯屬于理血劑,方中桃仁活血化瘀;大黃配芒硝通下瀉熱,大黃配桃仁活血行血瀉熱;桂枝通陽理氣,以防過多寒性藥使血行滯緩甚至凝血,同時助大黃、芒硝、桃仁行氣活血瀉熱;甘草守護中焦脾胃,安中緩峻,和解諸藥。五藥相伍,使瘀血得以行散,邪熱經下瀉而走。精索靜脈曲張可導致血液回流不暢,瘀阻脈絡,瘀久易化熱形成瘀熱,即為下焦蓄血,而桃核承氣湯正是治療蓄血證的代表方劑,故對精索靜脈曲張有很好療效[10]。

通過網絡藥理學研究分析,共獲得桃核承氣湯活性化合物141個,通過重要程度排列分析得出槲皮素(quercetin)、山萘酚(kaempferol)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)、常春藤皂甙元(hederagenin)等可能是桃核承氣湯治療精索靜脈曲張的重要有效藥物化合物。槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗癌、保護心血管等作用,主要通過抑制炎癥細胞因子合成和相關蛋白酶活性來發揮抗炎作用,對于精索靜脈曲張引發的血管炎癥性疼痛,可通過降低IL-1R、CC趨化因子配體8(CCL8)、IκB激酶(IKK)及信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)這些特定炎癥因子的基因表達來發揮抗炎作用[11]。槲皮素還具有抗氧化作用,增加一氧化氮(NO)含量和外周血總抗氧化能力(TAOC)來發揮抗氧化作用,有效保護血管內皮細胞[12]。相關動物實驗研究表明,山萘酚具有抗凝和防止血栓形成的作用,因此能有效促進精索內靜脈血液回流,預防靜脈血栓[13]。山萘酚的分子對接研究顯示,山萘酚與核因子κB(NF-κB)抑制劑MG-132等靶蛋白具有相似的結合能和類似的對接姿勢,而NF-κB抑制劑在抗炎和抗癌作用中至關重要,可通過下調NF-κB通路來抑制IL-4和環氧化酶2(COX-2)的表達[14],因而山萘酚對精索靜脈曲張引起的慢性炎癥也有一定的抗炎作用。Liao P等[15]經過研究證實,β-谷甾醇主要通過抑制表皮細胞、巨噬細胞中炎癥小體NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)的激活,減緩絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的活化,從而使細胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8產生減少,從而發揮抗炎作用。Gogoi D等[16]研究證實,β-谷甾醇可以通過非競爭性抑制凝血酶的活性來發揮抗凝作用,因此能有效防止精索內靜脈血栓形成,促進靜脈血液回流。相關實驗研究表明,蘆薈大黃素能通過減少由脂多糖誘導RAW264.7細胞釋放的NO、TNF-α、IL-1β,從而降低炎性反應[17-18]。蘆薈大黃素還具有清除氧自由基的作用,使其可能具有潛在的調血脂功用,降低血液黏度,降低血管疾病發生的風險[19],同時還有保肝、抗癌等作用[20]。Lu S H等[21]通過研究表明,常春藤皂甙元具有治療高脂血癥、抗血小板聚集、保肝、抗炎等多種藥理活性,其可通過調節脂質代謝紊亂和減少脂質沉積對血管壁形成保護,還可通過抑制誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)的釋放,增加內皮型一氧化氮合成酶(eNOS)含量,來糾正內皮功能失衡,減少IL-6、IFN-γ、TNF等炎癥因子的釋放。

通過分析藥物活性化合物與疾病交集靶點PPI網絡圖顯示,桃核承氣湯治療精索靜脈曲張的靶點主要有AKT1、PTGS2、TNF、TP53、IL-6、CASP3、ESR1等。AKT1可調節細胞代謝、生長、血管生成等過程,AKT1基因缺少會引起血管內皮細胞代謝功能紊亂[22]。AKT1介導的肌肉生長是通過增強鄰近細胞中血紅素氧合酶1(HO-1)的表達,來改善血管缺血后的血流恢復[23]。PTGS2是前列腺素生物合成中的關鍵酶,也是非甾體抗炎藥(NSAID)的靶標,通過抑制PTGS2可減輕炎癥、疼痛及發熱,長期使用這些藥物可預防血栓[24-25]。TNF-α是一種重要的細胞炎癥因子,主要通過直接作用或刺激發熱強效熱原IL-1分泌產生,并參與惡病質的誘導,在某些條件下可以刺激細胞生成且誘導細胞分化,同時能使大量白細胞在炎癥部位會集,誘導殺滅炎癥部位聚集的細菌[26]。TNF-α通過與IL-1β、IL-6協同誘導血管內皮生長因子(VEGF)的產生,在血管生成過程中發揮重要作用[27]。TP53是一個轉錄因子和腫瘤抑制因子,參與細胞凋亡和細胞周期的調控過程,根據生理環境和細胞類型誘導細胞生長停滯或細胞凋亡[28]。IL-6是在免疫、組織再生和代謝方面具有多種功能的細胞因子,通過“反式信號轉導”并與IL-1β和TNF-α協同誘導VEGF的產生,通過誘導VEGF直接或間接作為促進血管生長的重要因素,能減輕精索內靜脈盤曲、擴張的血管病理狀態[26]。CASP3可參與細胞凋亡、壞死及炎癥的信號通路,在細胞凋亡階段起著關鍵作用,可促進死亡細胞代謝[29],降低精索內靜脈局部的炎性反應。ESR1在細胞增殖、分化的多個信號通路中發揮作用,能擴張微血管,加強血管舒張功能,加快血液回流,減少血管炎性反應,從而能有效保護精索內血管[30]。

通過對藥物活性化合物與疾病交集靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析,GO功能富集分析結果表明,桃核承氣湯治療精索靜脈曲張主要通過對含氧化物的反應、凋亡過程的調控、程序性細胞死亡的調節、細胞凋亡過程等與細胞凋亡代謝有關的生物過程發揮治療作用。KEGG通路富集分析結果表明,桃核承氣湯治療精索靜脈曲張的關鍵通路主要有癌癥通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、IL-17信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路等,這些通路作用于精索內擴張的靜脈血管,可促進血管內皮細胞生成代謝,但也可引起炎癥反應,可能引起血管炎的發生。

綜上所述,桃核承氣湯治療精索靜脈曲張具有多成分、多靶點、多通路的作用特點,通過抑制炎性反應、促進血管再生、調節細胞生長等以達到治療精索靜脈曲張的效果。