基于Box-Benhnken響應面法對銀柴胡繼代快繁培養基的優化

李天順 張倩 代曉華

摘要 ［目的］解決銀柴胡種苗繁殖周期長、受外界環境影響大等問題。［方法］以銀柴胡不定芽為試驗材料，采用單因素試驗及Box-Benhnken響應面法，對比繼代快繁培養基中6-BA、NAA、蔗糖濃度對銀柴胡不定芽生長的影響，探究最佳培養基培養配方。［結果］通過回歸模型方程的分析并結合實際驗證，MS+ 6-BA 2.04 mg/L+ NAA 0.27 mg/L+蔗糖18.54 g/L為銀柴胡繼代快繁最佳培養基。［結論］以優化后的培養基進行繼代快繁，銀柴胡不定芽生長評分可達86.70，繼代快繁效果較好，可為銀柴胡種苗高質量、短周期快繁提供依據。

關鍵詞 銀柴胡；組培；繼代培養基；Box-Benhnken響應面法

中圖分類號 S 567.7+9? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）07-0179-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.07.041

Optimization of Subculture Medium for Rapid Propagation of Stellaria dichotoma Based on Box-Benhnken Response Surface Method

LI Tian-shun，ZHANG Qian，DAI Xiao-hua

（School of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan，Ningxia 750000）

Abstract ［Objective］To solve the problems of Stellaria dichotoma seedling with long propagation cycle and great influence from external environment.［Method］Using Stellaria dichotoma adventitious shoots as experimental materials，the single factor test and Box-Benhnken response surface method were designed to compare the effects of 6-BA，NAA and sucrose concentrations in the subculture medium on the growth of Stellaria dichotoma adventitious shoots，and to explore the optimal culture medium formula.［Result］Through the analysis of the regression model equation and the actual verification，the optimal medium for Stellaria dichotoma rapid propagation was MS+ 2.04 mg/L 6-BA + 0.27 mg/L NAA+18.54 g/L sucrose.［Conclusion］With the optimized medium for rapid subculture，the growth score of Stellaria dichotoma adventitious shoots can reach 86.70，and the effect of rapid subculture is good，which can provide a basis for the rapid propagation of Stellaria dichotoma seedlings with high quality and short period.

Key words Stellaria dichotoma;Tissue culture;Subculture medium;Box-Benhnken response surface method

基金項目 寧夏重點研發計劃項目（2019BBF02029）。

作者簡介 李天順（1996—），男，湖北應城人，碩士研究生，研究方向：作物栽培學與耕作學。通信作者，教授，碩士，碩士生導師，從事作物栽培學與耕作學研究。

收稿日期 2022-08-28

藥材銀柴胡為石竹科植物銀柴胡（Stellaria dichotoma L.var.lanceolata Bge.）的干燥根［1］，藥用價值較高，富含甾醇類、環肽類、黃酮類、生物堿類、酚酸類、揮發類等物質［2］，其多生長在海拔1 250～3 100 m的石質山坡或石質荒漠草原，在我國主要分布在寧夏、甘肅、陜西、內蒙古、遼寧等省（區）［3］。傳統中醫認為銀柴胡有清虛熱、除疳熱的功能；現代醫學研究發現，銀柴胡不僅具有清熱涼血功能，還具有抗炎、治療過敏性疾病、抗癌、擴張血管等作用［4］。隨著銀柴胡藥用功能的進一步開發，國內外的需求量迅速增長，然而由于對野生銀柴胡的濫采濫挖以及其生態環境發生改變，使得銀柴胡的野生資源明顯減少，既滿足不了市場需求，又破壞了當地生態的多樣性。

銀柴胡人工栽培地主要集中在寧夏、內蒙古、陜西等省（區），寧夏銀柴胡種植面積約為5 533.3 hm2，僅寧夏同心縣的銀柴胡人工種植面積就達3 333.3 hm2［5］，固原、西吉、海原、平羅、彭陽、隆得等縣也有一套較為完整的銀柴胡栽培產業，栽培面積較大。寧夏銀柴胡的栽培年限一般是3～4年，平均鮮根產量約為5 342 kg/hm2，而內蒙古的錫林郭勒盟、烏蘭察布市，陜西的定邊縣等地區仍處于銀柴胡人工栽培的試栽階段，種植面積較小，管理較為粗放，內蒙古東蘇旗5年生銀柴胡的產量為9 121 kg/hm2，陜西定邊的4年生銀柴胡產量為4 253 kg/hm2［6］。馬偉寶等［3］利用中藥材產地適宜性地理信息分析系統（TCMGIS）對野生銀柴胡產地適宜性進行分析，結果發現內蒙古地區適宜種植銀柴胡的面積最大，新疆其次，說明這些地區未來銀柴胡種苗市場較為廣闊。

目前生產上獲得銀柴胡種苗的方式仍是以種子繁殖為主，但是種子繁殖存在種源混雜、種子質量參差不齊、受環境影響大、繁殖周期長等問題［7］。 植物組織培養可以使用從母體上采集的根、莖、葉等器官作為材料進行大規模快速繁殖，有效地解決了種子繁殖發芽率低、受外界環境影響大等問題，新生植株也可保留母體的優良性狀。因此，銀柴胡組培快繁體系的建立是滿足市場需求，保護銀柴胡種質資源，實現規模化高效繁殖，促進人工栽培銀柴胡產業可持續、高質量、規模化發展的重要依托。

現階段國內外關于銀柴胡組培快繁研究的報道較少，姚寧等［8］通過器官直接發生型途徑成功建立了銀柴胡植株再生體系，以銀柴胡莖節為材料，通過添加植物生長調節劑直接誘導其分化出不定芽與不定根，最終獲得再生植株。吳曉玲等［9-10］基于器官間接發生型途徑對銀柴胡組培快繁進行研究，結果暫時停滯于外植體誘導愈傷組織、愈傷組織誘導毛狀根這一階段，未見后續由此途徑建立植株再生體系成功的報道。此外，體細胞發生型途徑的研究仍處于懸浮細胞培養階段［11-12］，尚未有通過此途徑成功建立再生植株體系的研究結果。上述研究均以提升初代培養中誘導芽、根等器官的成功率為主，關于其繼代快繁培養基配方配比的研究仍尚未涉及，因此該試驗以銀柴胡初代組織培養中形成的不定芽為材料，采用單因素試驗結合Box-Benhnken響應面法優化分析得出最適于銀柴胡繼代快繁的培養基，以期促進人工栽培銀柴胡產業可持續、高質量、規模化的發展，為銀柴胡種質資源的保護提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用組培苗材料來源于寧夏大學農學院溫棚示范基地內銀柴胡種植區的人工栽培3年生銀柴胡。試驗所用MS培養基（不含瓊脂和糖）為杭州百思生物技術有限公司生產；瓊脂為北京范德生物科技有限公司生產；蔗糖為天津大茂化學試劑廠生產；6-芐基腺嘌呤（6-BA）為上海麥克林生化科技有限公司生產；萘乙酸（NAA）為上海阿拉丁生化科技有限公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 不定芽的獲得。

剪取長勢良好、生長健壯、無病蟲害的銀柴胡幼嫩的莖節為組培外植體，流水沖洗20 min左右，用蒸餾水沖洗干凈噴灑75%乙醇后置于潔凈工作臺中，使用75%乙醇浸泡消毒30 s后，再浸入0.1% HgCl2溶液消毒60 s，消毒完畢后無菌水沖洗3次，剪除葉片，將莖節切為約0.5 cm的小段接種到不定芽誘導培養基（MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L）中，光照強度2 500 lx，光照時長12 h/d，溫度25 ℃，培養20 d后即可獲得［8］。

1.2.2 基礎培養基的配制。

精準稱量MS培養基4.74 g、瓊脂7.0 g、蔗糖30 g，加入100 ℃蒸餾水玻璃棒攪拌至完全溶解，調pH至6.0，定容至1 L。每組培瓶分裝50 mL培養基，置入高壓蒸汽滅菌器內121 ℃滅菌30 min，滅菌完成后放入潔凈工作臺中冷卻備用。

1.2.3 不定芽的接種與培養條件。

將“1.2.1”中獲得的不定芽于潔凈工作臺上用滅菌水洗凈，切除其老葉及過長部分，分割為單獨的植株并接種到繼代快繁培養基中，每處理接種4瓶，每瓶2苗，重復3次，總計12瓶，24株。培養條件設置為光照強度2 500 lx、光照時長12 h/d、溫度25 ℃，培養20 d后統計結果。

1.2.4 不定芽生長情況的評價。

根據銀柴胡不定芽繼代后的實際生長狀況，結合參考同種類型植物組培繼代的評價標準［13-14］，制定以不定芽繼代增殖倍數（增殖倍數=上代單芽體增殖芽數/產生不定芽上代單芽體數）、植株高度、葉片數、葉片顏色、是否褐化等生長性狀為標準的評分機制。按照其重要性等級，分別賦分：不定芽繼代增殖倍數30%、植株高度20%、葉片數20%、葉片顏色20%、是否褐化10%，滿分100分，詳情如表1所示。

1.2.5 單因素試驗設計。

1.2.5.1 6-BA濃度對銀柴胡叢生芽繼代培養的影響。以MS+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L為基礎，分別向基本培養基中添加不同濃度的6-BA（表2），其他成分與處理方式不變。操作方法同“1.2.3”。

1.2.5.2 NAA濃度對銀柴胡叢生芽繼代培養的影響。以MS+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L為基礎，分別向基本培養基中加入不同濃度的NAA（表2），其他成分與處理方式不變。操作方法同“1.2.3”。

1.2.5.3 蔗糖濃度對銀柴胡叢生芽繼代培養的影響。以MS+瓊脂7 g/L為基礎，分別向基本培養基中添加不同濃度的蔗糖（表2），其他成分與處理方式不變。操作方法同“1.2.3”。

1.2.6 Box-Benhnken響應面法試驗設計。

在以上單因素試驗結果的基礎上，每因素選取較為優秀的濃度范圍，以6-BA濃度、NAA濃度、蔗糖濃度為自變量，銀柴胡繼代快繁產生不定芽的生長評分為因變量，使用Design-expert 8.0.6軟件，基于Box-Benhnken Design（BBD）原理，設計3因素3水平的響應面試驗，運用數據分析擬合出的模型精準性，并由此推斷出最優培養基的配方配比，最后實際試驗印證。

1.3 數據處理與分析 以上試驗繼代20 d后統計結果并評分，數據使用Microsoft Office Excel 2020進行統計，利用Design-expert 8.0.6進行響應面數據的方差分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 各單因素最適范圍的選擇

2.1.1 6-BA濃度的選擇。從表3可以看出，銀柴胡不定芽的生長評分隨著6-BA濃度增加而呈現先上升后下降的趨勢。當6-BA濃度達到2.00 mg/L時，銀柴胡不定芽的生長評分最高，總分為57.7，其增殖倍數達到最大值（3.67），而植株高度與葉片數也較為合適，葉片顏色為淡綠色，褐化率為33%，生長情況最好；在6-BA濃度小于2.00 mg/L時，表現為細胞分裂不夠旺盛，不定芽出芽緩慢，增殖倍數低于3.67，植株高度偏低，葉片發黃，生長評分不高，達不到快繁的要求；在6-BA濃度大于2.00 mg/L時，則表現為細胞分裂素濃度過大，不定芽生長受到抑制，增殖倍數反而下降為2.82，褐化率上升為50%。所以將6-BA濃度2.00 mg/L設置為基礎試驗濃度，以1.5、2.0、2.5 mg/L 3個濃度梯度作為6-BA的響應面預設值。

2.1.2 NAA濃度的選擇。

從表4可以看出，銀柴胡不定芽的生長評分隨著NAA濃度的增加也呈現出先上升后下降的趨勢。當NAA濃度達到0.20 mg/L時，銀柴胡不定芽的生長評分最高，總分為56.9，增殖倍數達到最大（3.17），植株高度較高、葉片數較多，葉片顏色為綠色，褐化率為0；在NAA濃度小于0.20 mg/L時，表現為植株生長緩慢，增殖倍數小于3.00，不定芽葉片較少、較弱，褐化率較高，生長評分低；當NAA濃度大于0.20 mg/L時，則表現為生長素濃度過大，不定芽生長受限，增殖倍數下降為3.00以下，植株高度與葉片數變化較小，葉片顏色也從綠色變為淡綠色。所以將NAA濃度0.20 mg/L設置為基礎試驗濃度，以0.10、0.20、0.30 mg/L 3個濃度梯度作為NAA的響應面預設值。

2.1.3 蔗糖濃度的選擇。從表5可以看出，蔗糖作為培養基中的碳源，是不定芽生長的能量來源，其濃度也影響著銀柴胡不定芽的生長評分。隨著蔗糖濃度的增加，銀柴胡不定芽的生長評分先上升再下降，最終趨于平緩。在蔗糖濃度達到10 g/L時，銀柴胡不定芽的生長評分最高（47.7），增殖倍數較高（1.92），苗壯葉綠，無褐化；蔗糖濃度低于10 g/L時，銀柴胡不定芽表現為生長遲緩，增殖倍數僅為1.20，葉少莖細，褐化率達到100%，低于快繁的基本要求；而蔗糖濃度高于10 g/L時，增殖倍數有所提升，最高為2.58，植株高度與葉片數也有提升，但表現為繼代前期銀柴胡不定芽生長迅速，中后期則出現黃葉褐化甚至死亡的現象。因此以蔗糖濃度10 g/L為基礎試驗濃度，將0、10、20 g/L 3個濃度梯度作為蔗糖的響應面預設值。

2.2 響應面試驗設計結果及可行性分析

根據Box-Benhnken Design（BBD）原理將6-BA濃度（A）、NAA濃度（B）、蔗糖濃度（C）設置為響應因子，使用Design-expert 8.0.6設計3因素3水平試驗，試驗組合及實際響應值見表6。

對表6中數據進行分析可以得出銀柴胡繼代快繁培養基中6-BA濃度（A）、NAA濃度（B）、蔗糖濃度（C）與其不定芽生長評分值（Y）的回歸方程：Y=-14.54+70.29A+75.27B+2.18C+11.68AB+0.49AC+3.04BC-20.57A2-283.28B2-0.11C2，并對此回歸方程進行方差分析及顯著性檢驗，結果如表7所示。

根據表7中的數據可知，模型項的P值小于0.01，說明評分值（Y）與6-BA濃度（A）、NAA濃度（B）、蔗糖濃度（C）回歸方程的關系是極顯著的，試驗設計合理；失擬項平方和（SS=5.36）較小，對應的P值大于0.05，說明所得回歸方程與實際擬合中非正常誤差所占比例較小；回歸方程模型判定系數R2=0.997 0，說明其擬合程度較好，使用該回歸方程來預測銀柴胡繼代不定芽的生長評分的可行性高；校正系數R2Adj=0.993 2，說明該模型方程中變異度僅為0.006 8，而99.32%的數據可用此方程解釋，方程可靠性高；各影響因子中6-BA濃度（A）、NAA濃度（B）、蔗糖濃度（C）的P值均小于0.01，說明其對銀柴胡不定芽的生長影響均極顯著，AB的P值大于0.05，AC、BC的P值均小于0.01，說明AB的交互效應不顯著，而AC、BC之間的交互效應極顯著；F值各項中FC>FA>FB，說明試驗中蔗糖濃度（C）對銀柴胡不定芽的生長評分影響最大，6-BA濃度（A）次之，NAA濃度（B）最小。

2.3 響應面圖形分析與最佳培養基配方的優化

由于銀柴胡不定芽生長評分（Y）與6-BA濃度（A）、NAA濃度（B）、蔗糖濃度（C）回歸方程模型可靠性與擬合性較高，具有統計學意義，所以將其制成響應面（RSM）圖形，以便于更直觀地反映出銀柴胡不定芽的生長情況與6-BA濃度、NAA濃度、蔗糖濃度3個因素之間的關系，并由此預測最佳培養基配方。如圖1～3所示，三維圖中蔗糖濃度（C）的曲線面最陡、6-BA濃度（A）較陡、NAA濃度（B）趨于平緩，表明蔗糖濃度對銀柴胡不定芽的生長情況影響最大，6-BA濃度次之，NAA濃度最小；等高線圖中的等高線形狀表現了兩因素之間的交互效應強弱，趨于橢圓則強，趨于圓形則弱［15］，圖中AB交互趨近于圓形，而AC、BC則趨近于橢圓形，故AB的交互效應弱而AC、BC之間的交互效應強，這也與“2.2”中的方差分析相符。各三維圖均為山丘型曲面，存在極點對應的最大值，使用軟件分析得出其評分最大值（87.552 4）時的6-BA濃度、NAA濃度、蔗糖濃度分別為2.04 mg/L、0.27 mg/L、18.54 g/L，因此當培養基為MS+6-BA 2.04 mg/L+ NAA 0.27 mg/L+蔗糖18.54 g/L時，銀柴胡不定芽生長評分達到最大值（87.552 4）。

2.4 最佳培養基配方的驗證

為對預測配方進行驗證使其更具實際可行性，用“2.3”中得到的最佳培養基配方（MS+6-BA 2.04 mg/L+ NAA 0.27 mg/L+蔗糖18.54 g/L）進行銀柴胡繼代快繁驗證，操作方式嚴格按照“1.2.1～1.2.4”方法開展，共接種24瓶，每瓶2苗。20 d后統計其生長評分，該培養基中銀柴胡不定芽的實際生長情況如圖4D所示，具體數據見表8。

從表8可以看出，最佳培養基配方相較于該試驗中實際評分較低的13號（MS+6-BA 2.50 mg/L+ NAA 0.20 mg/L）培養基（圖4A），不定芽平均增殖倍數增加78.26%，植株高度提升2.95 cm，葉片數增加3.7片，褐化率降低70百分點，植株顏色綠色；對比實際評分中等的8號（MS+ 6-BA 1.50 mg/L+NAA 0.10 mg/L+蔗糖10 g/L）培養基（圖4B），不定芽平均增殖倍數增加13.89%，植株高度提升0.86 cm，葉片數增加2.0片，褐化率降低20百分點，實際快繁效果提升明顯；實際評分雖然比評分最高的10號（MS+ 6-BA 2.00 mg/L+ NAA 0.30 mg/L+蔗糖20 g/L）培養基（圖4C）低1.51%，但株高高，褐化率低，且最佳培養基的實際生長評分（86.70）與預測值（87.552 4）的誤差值只有0.974%，證明該配方較為真實準確，具有實際可行性。

3 結論與討論

該研究利用單因素試驗確定了銀柴胡繼代快繁培養基中6-BA、NAA、蔗糖的最適濃度范圍，而后基于Box-Benhnken Design（BBD）原理，設計3因素3水平的響應面試驗，最后優化得出最佳配方為MS+ 6-BA 2.04 mg/L+ NAA 0.27 mg/L+蔗糖18.54 g/L。經過實際驗證得出該配方可以使銀柴胡繼代不定芽的生長評分達到86.70，故該培養基可作為銀柴胡繼代快繁的繼代培養基，規模化生產銀柴胡種苗，初步解決了銀柴胡種苗繁殖周期長、受外界環境影響大等問題。

該研究中得出的最佳配方與姚寧等［8］研究結果中關于不定芽誘導培養基激素最適水平部分有相似之處，2個試驗結果均表明，高濃度的細胞分裂素（6-BA）、低濃度的生長素（NAA）有利于不定芽的誘導與生長；但該試驗最佳培養基使用蔗糖為18.54 g/L，姚寧等［8］研究中各部位誘導的最佳培養基均為蔗糖30 g/L，有可能是因為銀柴胡屬于耐貧瘠植物，培養基中18.54 g/L的蔗糖濃度已經滿足其營養需求，再添加過量的蔗糖對其生長意義不大。而對于該研究中關于銀柴胡繼代快繁培養環境及繼代周期的部分仍待完善，下一步應探究其繼代快繁最適培養環境及繼代周期，為銀柴胡產業可持續、高質量、規模化的發展打下良好基礎。

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