基于Box-Benhnken響應(yīng)面法對銀柴胡繼代快繁培養(yǎng)基的優(yōu)化

李天順 張倩 代曉華

摘要 ［目的］解決銀柴胡種苗繁殖周期長、受外界環(huán)境影響大等問題。［方法］以銀柴胡不定芽為試驗材料，采用單因素試驗及Box-Benhnken響應(yīng)面法，對比繼代快繁培養(yǎng)基中6-BA、NAA、蔗糖濃度對銀柴胡不定芽生長的影響，探究最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)配方。［結(jié)果］通過回歸模型方程的分析并結(jié)合實際驗證，MS+ 6-BA 2.04 mg/L+ NAA 0.27 mg/L+蔗糖18.54 g/L為銀柴胡繼代快繁最佳培養(yǎng)基。［結(jié)論］以優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行繼代快繁，銀柴胡不定芽生長評分可達(dá)86.70，繼代快繁效果較好，可為銀柴胡種苗高質(zhì)量、短周期快繁提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 銀柴胡；組培；繼代培養(yǎng)基；Box-Benhnken響應(yīng)面法

中圖分類號 S 567.7+9? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）07-0179-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.07.041

Optimization of Subculture Medium for Rapid Propagation of Stellaria dichotoma Based on Box-Benhnken Response Surface Method

LI Tian-shun，ZHANG Qian，DAI Xiao-hua

（School of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan，Ningxia 750000）

Abstract ［Objective］To solve the problems of Stellaria dichotoma seedling with long propagation cycle and great influence from external environment.［Method］Using Stellaria dichotoma adventitious shoots as experimental materials，the single factor test and Box-Benhnken response surface method were designed to compare the effects of 6-BA，NAA and sucrose concentrations in the subculture medium on the growth of Stellaria dichotoma adventitious shoots，and to explore the optimal culture medium formula.［Result］Through the analysis of the regression model equation and the actual verification，the optimal medium for Stellaria dichotoma rapid propagation was MS+ 2.04 mg/L 6-BA + 0.27 mg/L NAA+18.54 g/L sucrose.［Conclusion］With the optimized medium for rapid subculture，the growth score of Stellaria dichotoma adventitious shoots can reach 86.70，and the effect of rapid subculture is good，which can provide a basis for the rapid propagation of Stellaria dichotoma seedlings with high quality and short period.

Key words Stellaria dichotoma;Tissue culture;Subculture medium;Box-Benhnken response surface method

基金項目 寧夏重點研發(fā)計劃項目（2019BBF02029）。

作者簡介 李天順（1996—），男，湖北應(yīng)城人，碩士研究生，研究方向：作物栽培學(xué)與耕作學(xué)。通信作者，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事作物栽培學(xué)與耕作學(xué)研究。

收稿日期 2022-08-28

藥材銀柴胡為石竹科植物銀柴胡（Stellaria dichotoma L.var.lanceolata Bge.）的干燥根［1］，藥用價值較高，富含甾醇類、環(huán)肽類、黃酮類、生物堿類、酚酸類、揮發(fā)類等物質(zhì)［2］，其多生長在海拔1 250～3 100 m的石質(zhì)山坡或石質(zhì)荒漠草原，在我國主要分布在寧夏、甘肅、陜西、內(nèi)蒙古、遼寧等省（區(qū)）［3］。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為銀柴胡有清虛熱、除疳熱的功能；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，銀柴胡不僅具有清熱涼血功能，還具有抗炎、治療過敏性疾病、抗癌、擴張血管等作用［4］。隨著銀柴胡藥用功能的進(jìn)一步開發(fā)，國內(nèi)外的需求量迅速增長，然而由于對野生銀柴胡的濫采濫挖以及其生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變，使得銀柴胡的野生資源明顯減少，既滿足不了市場需求，又破壞了當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)的多樣性。

銀柴胡人工栽培地主要集中在寧夏、內(nèi)蒙古、陜西等省（區(qū)），寧夏銀柴胡種植面積約為5 533.3 hm2，僅寧夏同心縣的銀柴胡人工種植面積就達(dá)3 333.3 hm2［5］，固原、西吉、海原、平羅、彭陽、隆得等縣也有一套較為完整的銀柴胡栽培產(chǎn)業(yè)，栽培面積較大。寧夏銀柴胡的栽培年限一般是3～4年，平均鮮根產(chǎn)量約為5 342 kg/hm2，而內(nèi)蒙古的錫林郭勒盟、烏蘭察布市，陜西的定邊縣等地區(qū)仍處于銀柴胡人工栽培的試栽階段，種植面積較小，管理較為粗放，內(nèi)蒙古東蘇旗5年生銀柴胡的產(chǎn)量為9 121 kg/hm2，陜西定邊的4年生銀柴胡產(chǎn)量為4 253 kg/hm2［6］。馬偉寶等［3］利用中藥材產(chǎn)地適宜性地理信息分析系統(tǒng)（TCMGIS）對野生銀柴胡產(chǎn)地適宜性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古地區(qū)適宜種植銀柴胡的面積最大，新疆其次，說明這些地區(qū)未來銀柴胡種苗市場較為廣闊。

目前生產(chǎn)上獲得銀柴胡種苗的方式仍是以種子繁殖為主，但是種子繁殖存在種源混雜、種子質(zhì)量參差不齊、受環(huán)境影響大、繁殖周期長等問題［7］。 植物組織培養(yǎng)可以使用從母體上采集的根、莖、葉等器官作為材料進(jìn)行大規(guī)模快速繁殖，有效地解決了種子繁殖發(fā)芽率低、受外界環(huán)境影響大等問題，新生植株也可保留母體的優(yōu)良性狀。因此，銀柴胡組培快繁體系的建立是滿足市場需求，保護銀柴胡種質(zhì)資源，實現(xiàn)規(guī)模化高效繁殖，促進(jìn)人工栽培銀柴胡產(chǎn)業(yè)可持續(xù)、高質(zhì)量、規(guī)模化發(fā)展的重要依托。

現(xiàn)階段國內(nèi)外關(guān)于銀柴胡組培快繁研究的報道較少，姚寧等［8］通過器官直接發(fā)生型途徑成功建立了銀柴胡植株再生體系，以銀柴胡莖節(jié)為材料，通過添加植物生長調(diào)節(jié)劑直接誘導(dǎo)其分化出不定芽與不定根，最終獲得再生植株。吳曉玲等［9-10］基于器官間接發(fā)生型途徑對銀柴胡組培快繁進(jìn)行研究，結(jié)果暫時停滯于外植體誘導(dǎo)愈傷組織、愈傷組織誘導(dǎo)毛狀根這一階段，未見后續(xù)由此途徑建立植株再生體系成功的報道。此外，體細(xì)胞發(fā)生型途徑的研究仍處于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)階段［11-12］，尚未有通過此途徑成功建立再生植株體系的研究結(jié)果。上述研究均以提升初代培養(yǎng)中誘導(dǎo)芽、根等器官的成功率為主，關(guān)于其繼代快繁培養(yǎng)基配方配比的研究仍尚未涉及，因此該試驗以銀柴胡初代組織培養(yǎng)中形成的不定芽為材料，采用單因素試驗結(jié)合Box-Benhnken響應(yīng)面法優(yōu)化分析得出最適于銀柴胡繼代快繁的培養(yǎng)基，以期促進(jìn)人工栽培銀柴胡產(chǎn)業(yè)可持續(xù)、高質(zhì)量、規(guī)模化的發(fā)展，為銀柴胡種質(zhì)資源的保護提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用組培苗材料來源于寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院溫棚示范基地內(nèi)銀柴胡種植區(qū)的人工栽培3年生銀柴胡。試驗所用MS培養(yǎng)基（不含瓊脂和糖）為杭州百思生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；瓊脂為北京范德生物科技有限公司生產(chǎn)；蔗糖為天津大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；6-芐基腺嘌呤（6-BA）為上海麥克林生化科技有限公司生產(chǎn)；萘乙酸（NAA）為上海阿拉丁生化科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 不定芽的獲得。

剪取長勢良好、生長健壯、無病蟲害的銀柴胡幼嫩的莖節(jié)為組培外植體，流水沖洗20 min左右，用蒸餾水沖洗干凈噴灑75%乙醇后置于潔凈工作臺中，使用75%乙醇浸泡消毒30 s后，再浸入0.1% HgCl2溶液消毒60 s，消毒完畢后無菌水沖洗3次，剪除葉片，將莖節(jié)切為約0.5 cm的小段接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L）中，光照強度2 500 lx，光照時長12 h/d，溫度25 ℃，培養(yǎng)20 d后即可獲得［8］。

1.2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制。

精準(zhǔn)稱量MS培養(yǎng)基4.74 g、瓊脂7.0 g、蔗糖30 g，加入100 ℃蒸餾水玻璃棒攪拌至完全溶解，調(diào)pH至6.0，定容至1 L。每組培瓶分裝50 mL培養(yǎng)基，置入高壓蒸汽滅菌器內(nèi)121 ℃滅菌30 min，滅菌完成后放入潔凈工作臺中冷卻備用。

1.2.3 不定芽的接種與培養(yǎng)條件。

將“1.2.1”中獲得的不定芽于潔凈工作臺上用滅菌水洗凈，切除其老葉及過長部分，分割為單獨的植株并接種到繼代快繁培養(yǎng)基中，每處理接種4瓶，每瓶2苗，重復(fù)3次，總計12瓶，24株。培養(yǎng)條件設(shè)置為光照強度2 500 lx、光照時長12 h/d、溫度25 ℃，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.4 不定芽生長情況的評價。

根據(jù)銀柴胡不定芽繼代后的實際生長狀況，結(jié)合參考同種類型植物組培繼代的評價標(biāo)準(zhǔn)［13-14］，制定以不定芽繼代增殖倍數(shù)（增殖倍數(shù)=上代單芽體增殖芽數(shù)/產(chǎn)生不定芽上代單芽體數(shù)）、植株高度、葉片數(shù)、葉片顏色、是否褐化等生長性狀為標(biāo)準(zhǔn)的評分機制。按照其重要性等級，分別賦分：不定芽繼代增殖倍數(shù)30%、植株高度20%、葉片數(shù)20%、葉片顏色20%、是否褐化10%，滿分100分，詳情如表1所示。

1.2.5 單因素試驗設(shè)計。

1.2.5.1 6-BA濃度對銀柴胡叢生芽繼代培養(yǎng)的影響。以MS+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L為基礎(chǔ)，分別向基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-BA（表2），其他成分與處理方式不變。操作方法同“1.2.3”。

1.2.5.2 NAA濃度對銀柴胡叢生芽繼代培養(yǎng)的影響。以MS+瓊脂7 g/L+蔗糖30 g/L為基礎(chǔ)，分別向基本培養(yǎng)基中加入不同濃度的NAA（表2），其他成分與處理方式不變。操作方法同“1.2.3”。

1.2.5.3 蔗糖濃度對銀柴胡叢生芽繼代培養(yǎng)的影響。以MS+瓊脂7 g/L為基礎(chǔ)，分別向基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的蔗糖（表2），其他成分與處理方式不變。操作方法同“1.2.3”。

1.2.6 Box-Benhnken響應(yīng)面法試驗設(shè)計。

在以上單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，每因素選取較為優(yōu)秀的濃度范圍，以6-BA濃度、NAA濃度、蔗糖濃度為自變量，銀柴胡繼代快繁產(chǎn)生不定芽的生長評分為因變量，使用Design-expert 8.0.6軟件，基于Box-Benhnken Design（BBD）原理，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，運用數(shù)據(jù)分析擬合出的模型精準(zhǔn)性，并由此推斷出最優(yōu)培養(yǎng)基的配方配比，最后實際試驗印證。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 以上試驗繼代20 d后統(tǒng)計結(jié)果并評分，數(shù)據(jù)使用Microsoft Office Excel 2020進(jìn)行統(tǒng)計，利用Design-expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)的方差分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 各單因素最適范圍的選擇

2.1.1 6-BA濃度的選擇。從表3可以看出，銀柴胡不定芽的生長評分隨著6-BA濃度增加而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)6-BA濃度達(dá)到2.00 mg/L時，銀柴胡不定芽的生長評分最高，總分為57.7，其增殖倍數(shù)達(dá)到最大值（3.67），而植株高度與葉片數(shù)也較為合適，葉片顏色為淡綠色，褐化率為33%，生長情況最好；在6-BA濃度小于2.00 mg/L時，表現(xiàn)為細(xì)胞分裂不夠旺盛，不定芽出芽緩慢，增殖倍數(shù)低于3.67，植株高度偏低，葉片發(fā)黃，生長評分不高，達(dá)不到快繁的要求；在6-BA濃度大于2.00 mg/L時，則表現(xiàn)為細(xì)胞分裂素濃度過大，不定芽生長受到抑制，增殖倍數(shù)反而下降為2.82，褐化率上升為50%。所以將6-BA濃度2.00 mg/L設(shè)置為基礎(chǔ)試驗濃度，以1.5、2.0、2.5 mg/L 3個濃度梯度作為6-BA的響應(yīng)面預(yù)設(shè)值。

2.1.2 NAA濃度的選擇。

從表4可以看出，銀柴胡不定芽的生長評分隨著NAA濃度的增加也呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。當(dāng)NAA濃度達(dá)到0.20 mg/L時，銀柴胡不定芽的生長評分最高，總分為56.9，增殖倍數(shù)達(dá)到最大（3.17），植株高度較高、葉片數(shù)較多，葉片顏色為綠色，褐化率為0；在NAA濃度小于0.20 mg/L時，表現(xiàn)為植株生長緩慢，增殖倍數(shù)小于3.00，不定芽葉片較少、較弱，褐化率較高，生長評分低；當(dāng)NAA濃度大于0.20 mg/L時，則表現(xiàn)為生長素濃度過大，不定芽生長受限，增殖倍數(shù)下降為3.00以下，植株高度與葉片數(shù)變化較小，葉片顏色也從綠色變?yōu)榈G色。所以將NAA濃度0.20 mg/L設(shè)置為基礎(chǔ)試驗濃度，以0.10、0.20、0.30 mg/L 3個濃度梯度作為NAA的響應(yīng)面預(yù)設(shè)值。

2.1.3 蔗糖濃度的選擇。從表5可以看出，蔗糖作為培養(yǎng)基中的碳源，是不定芽生長的能量來源，其濃度也影響著銀柴胡不定芽的生長評分。隨著蔗糖濃度的增加，銀柴胡不定芽的生長評分先上升再下降，最終趨于平緩。在蔗糖濃度達(dá)到10 g/L時，銀柴胡不定芽的生長評分最高（47.7），增殖倍數(shù)較高（1.92），苗壯葉綠，無褐化；蔗糖濃度低于10 g/L時，銀柴胡不定芽表現(xiàn)為生長遲緩，增殖倍數(shù)僅為1.20，葉少莖細(xì)，褐化率達(dá)到100%，低于快繁的基本要求；而蔗糖濃度高于10 g/L時，增殖倍數(shù)有所提升，最高為2.58，植株高度與葉片數(shù)也有提升，但表現(xiàn)為繼代前期銀柴胡不定芽生長迅速，中后期則出現(xiàn)黃葉褐化甚至死亡的現(xiàn)象。因此以蔗糖濃度10 g/L為基礎(chǔ)試驗濃度，將0、10、20 g/L 3個濃度梯度作為蔗糖的響應(yīng)面預(yù)設(shè)值。

2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果及可行性分析

根據(jù)Box-Benhnken Design（BBD）原理將6-BA濃度（A）、NAA濃度（B）、蔗糖濃度（C）設(shè)置為響應(yīng)因子，使用Design-expert 8.0.6設(shè)計3因素3水平試驗，試驗組合及實際響應(yīng)值見表6。

對表6中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可以得出銀柴胡繼代快繁培養(yǎng)基中6-BA濃度（A）、NAA濃度（B）、蔗糖濃度（C）與其不定芽生長評分值（Y）的回歸方程：Y=-14.54+70.29A+75.27B+2.18C+11.68AB+0.49AC+3.04BC-20.57A2-283.28B2-0.11C2，并對此回歸方程進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗，結(jié)果如表7所示。

根據(jù)表7中的數(shù)據(jù)可知，模型項的P值小于0.01，說明評分值（Y）與6-BA濃度（A）、NAA濃度（B）、蔗糖濃度（C）回歸方程的關(guān)系是極顯著的，試驗設(shè)計合理；失擬項平方和（SS=5.36）較小，對應(yīng)的P值大于0.05，說明所得回歸方程與實際擬合中非正常誤差所占比例較小；回歸方程模型判定系數(shù)R2=0.997 0，說明其擬合程度較好，使用該回歸方程來預(yù)測銀柴胡繼代不定芽的生長評分的可行性高；校正系數(shù)R2Adj=0.993 2，說明該模型方程中變異度僅為0.006 8，而99.32%的數(shù)據(jù)可用此方程解釋，方程可靠性高；各影響因子中6-BA濃度（A）、NAA濃度（B）、蔗糖濃度（C）的P值均小于0.01，說明其對銀柴胡不定芽的生長影響均極顯著，AB的P值大于0.05，AC、BC的P值均小于0.01，說明AB的交互效應(yīng)不顯著，而AC、BC之間的交互效應(yīng)極顯著；F值各項中FC>FA>FB，說明試驗中蔗糖濃度（C）對銀柴胡不定芽的生長評分影響最大，6-BA濃度（A）次之，NAA濃度（B）最小。

2.3 響應(yīng)面圖形分析與最佳培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

由于銀柴胡不定芽生長評分（Y）與6-BA濃度（A）、NAA濃度（B）、蔗糖濃度（C）回歸方程模型可靠性與擬合性較高，具有統(tǒng)計學(xué)意義，所以將其制成響應(yīng)面（RSM）圖形，以便于更直觀地反映出銀柴胡不定芽的生長情況與6-BA濃度、NAA濃度、蔗糖濃度3個因素之間的關(guān)系，并由此預(yù)測最佳培養(yǎng)基配方。如圖1～3所示，三維圖中蔗糖濃度（C）的曲線面最陡、6-BA濃度（A）較陡、NAA濃度（B）趨于平緩，表明蔗糖濃度對銀柴胡不定芽的生長情況影響最大，6-BA濃度次之，NAA濃度最小；等高線圖中的等高線形狀表現(xiàn)了兩因素之間的交互效應(yīng)強弱，趨于橢圓則強，趨于圓形則弱［15］，圖中AB交互趨近于圓形，而AC、BC則趨近于橢圓形，故AB的交互效應(yīng)弱而AC、BC之間的交互效應(yīng)強，這也與“2.2”中的方差分析相符。各三維圖均為山丘型曲面，存在極點對應(yīng)的最大值，使用軟件分析得出其評分最大值（87.552 4）時的6-BA濃度、NAA濃度、蔗糖濃度分別為2.04 mg/L、0.27 mg/L、18.54 g/L，因此當(dāng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.04 mg/L+ NAA 0.27 mg/L+蔗糖18.54 g/L時，銀柴胡不定芽生長評分達(dá)到最大值（87.552 4）。

2.4 最佳培養(yǎng)基配方的驗證

為對預(yù)測配方進(jìn)行驗證使其更具實際可行性，用“2.3”中得到的最佳培養(yǎng)基配方（MS+6-BA 2.04 mg/L+ NAA 0.27 mg/L+蔗糖18.54 g/L）進(jìn)行銀柴胡繼代快繁驗證，操作方式嚴(yán)格按照“1.2.1～1.2.4”方法開展，共接種24瓶，每瓶2苗。20 d后統(tǒng)計其生長評分，該培養(yǎng)基中銀柴胡不定芽的實際生長情況如圖4D所示，具體數(shù)據(jù)見表8。

從表8可以看出，最佳培養(yǎng)基配方相較于該試驗中實際評分較低的13號（MS+6-BA 2.50 mg/L+ NAA 0.20 mg/L）培養(yǎng)基（圖4A），不定芽平均增殖倍數(shù)增加78.26%，植株高度提升2.95 cm，葉片數(shù)增加3.7片，褐化率降低70百分點，植株顏色綠色；對比實際評分中等的8號（MS+ 6-BA 1.50 mg/L+NAA 0.10 mg/L+蔗糖10 g/L）培養(yǎng)基（圖4B），不定芽平均增殖倍數(shù)增加13.89%，植株高度提升0.86 cm，葉片數(shù)增加2.0片，褐化率降低20百分點，實際快繁效果提升明顯；實際評分雖然比評分最高的10號（MS+ 6-BA 2.00 mg/L+ NAA 0.30 mg/L+蔗糖20 g/L）培養(yǎng)基（圖4C）低1.51%，但株高高，褐化率低，且最佳培養(yǎng)基的實際生長評分（86.70）與預(yù)測值（87.552 4）的誤差值只有0.974%，證明該配方較為真實準(zhǔn)確，具有實際可行性。

3 結(jié)論與討論

該研究利用單因素試驗確定了銀柴胡繼代快繁培養(yǎng)基中6-BA、NAA、蔗糖的最適濃度范圍，而后基于Box-Benhnken Design（BBD）原理，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，最后優(yōu)化得出最佳配方為MS+ 6-BA 2.04 mg/L+ NAA 0.27 mg/L+蔗糖18.54 g/L。經(jīng)過實際驗證得出該配方可以使銀柴胡繼代不定芽的生長評分達(dá)到86.70，故該培養(yǎng)基可作為銀柴胡繼代快繁的繼代培養(yǎng)基，規(guī)模化生產(chǎn)銀柴胡種苗，初步解決了銀柴胡種苗繁殖周期長、受外界環(huán)境影響大等問題。

該研究中得出的最佳配方與姚寧等［8］研究結(jié)果中關(guān)于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素最適水平部分有相似之處，2個試驗結(jié)果均表明，高濃度的細(xì)胞分裂素（6-BA）、低濃度的生長素（NAA）有利于不定芽的誘導(dǎo)與生長；但該試驗最佳培養(yǎng)基使用蔗糖為18.54 g/L，姚寧等［8］研究中各部位誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基均為蔗糖30 g/L，有可能是因為銀柴胡屬于耐貧瘠植物，培養(yǎng)基中18.54 g/L的蔗糖濃度已經(jīng)滿足其營養(yǎng)需求，再添加過量的蔗糖對其生長意義不大。而對于該研究中關(guān)于銀柴胡繼代快繁培養(yǎng)環(huán)境及繼代周期的部分仍待完善，下一步應(yīng)探究其繼代快繁最適培養(yǎng)環(huán)境及繼代周期，為銀柴胡產(chǎn)業(yè)可持續(xù)、高質(zhì)量、規(guī)模化的發(fā)展打下良好基礎(chǔ)。

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