MALDI-TOF MS在不同禽肉動物源性成分檢測中的研究

方志娟 李曉芹 張雪婧 沈麒亮 金萍 葉湖

摘要 ［目的］建立基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術檢測不同禽肉動物源性成分的方法，構建不同禽肉蛋白質分子指紋圖譜標準數據庫，對不同禽肉進行鑒別。［方法］樣品用磷酸鹽緩沖液提取，凈化后用MALDI-TOF MS法測定。采用ChemPattern軟件對不同禽肉蛋白圖譜進行化學計量學分析，建立識別模型。［結果］雞、鴨、鵝3種不同禽肉之間具有明顯差異。首次建立不同禽肉蛋白質分子指紋圖譜標準數據庫，可一次性對每個樣品中雞、鴨、鵝等肉源性成分進行同時分析。［結論］建立的基于蛋白質組學的雞、鴨、鵝源性成分鑒定系統具有簡便、穩定、準確、重現性好的優點，適用于不同禽肉中雞鴨鵝動物源性成分的鑒別。

關鍵詞 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜；動物源；成分；檢測；禽肉

中圖分類號 TS 251.7? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）07-0189-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.07.043

Study on Detection of Animal-derived Components in Different Poultry Meat by MALDI-TOF MS

FANG Zhi-juan，LI Xiao-qin，ZHANG Xue-jing et al

（Suzhou Food Inspection and Testing Center，Suzhou，Jiangsu 215104）

Abstract ［Objective］Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS） was used to detect the animal-derived components of different poultry meat.The standard database of protein molecular fingerprints was established to identify different poultry meat.［Method］Samples were extracted with phosphate buffer and determined by MALDI-TOF MS.ChemPattern software was used to carry out chemometric analysis on protein profiles of different poultry meat，and then an identification model was established.［Result］There are obvious differences among three kinds of poultry meat （chicken，duck and goose）.It was the first time to establish a standard database of protein molecular fingerprints of different poultry meat，which could be used for simultaneous analysis of chicken，duck，goose and other meat derived components in each sample at one time.［Conclusion］The identification system of chicken，duck and goose based on proteomics has the advantage of simplicity，stability，accuracy and good reproducibility.It is suitable for the identification of animal-derived components of chicken，duck and goose.

Key words Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS）; Animal-derived;Component;Detection; Poultry

基金項目 江蘇省市場監督管理局科技計劃項目（KJ21125003）；江蘇省市場監管重點實驗室

項目“食品安全快檢技術與產品評價”。

作者簡介 方志娟（1987—），女，江蘇南通人，工程師，碩士，從事食品檢驗研究。通信作者，高級工程師，從事食品檢驗與質量控制研究。

收稿日期 2022-09-01

隨著生活水平的提高，人們對肉類的需求越來越大，同時對肉類品質也提出了更高的要求［1］。“鴨肉冒充羊肉”等一系列事件，讓消費者對肉類摻假問題越來越重視［2］。肉類摻假主要是為了有目的地獲得產品的表觀價值或降低產品的成本，這種欺詐行為嚴重損害了消費者的權利和健康，擾亂了市場公平交易機制［3-5］。因此，開發高效、靈敏、快速的肉類鑒別技術和體系，有利于打擊肉類摻假和欺詐行為，具有非常重要的實用價值和社會意義［6-8］。

目前鑒別肉類摻假的方法很多，有實時熒光PCR法［9-11］、酶聯免疫分析法［12］、電子鼻結合統計學分析技術［13-15］、核磁共振技術［16-18］、近紅外特征光譜技術［19-21］等。MALDI-TOF MS技術是基質輔助激光解吸電離（MALDI）技術與飛行時間質譜（TOF MS）的結合，具有快速、穩定、準確、重復性好的特點［22-24］。近年來，已被越來越多地應用于微生物鑒定等各領域［25-29］。研發低成本、高通量的MALDI-TOF MS技術可能成為肉類摻假鑒別方法的主流趨勢和發展方向。該研究利用MALDI-TOF MS技術分析不同禽肉如雞、鴨、鵝的蛋白質譜圖，首次建立不同禽肉蛋白質分子指紋圖譜標準數據庫；配合ChemPattern先進化學計量學分析，建立基于蛋白質組學的雞、鴨、鵝源性成分鑒定系統，為雞、鴨、鵝3種不同禽肉動物源性成分的鑒別提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磷酸鹽緩沖液（PBS）、SA IV型蛋白、多肽提取或純化試劑，融智生物科技（青島）有限公司。禽肉樣品（16批次雞、25批次鴨、15批次鵝），均購自當地超市。

1.2 儀器與設備

BagMixer 400拍打式均質器，法國Interscience公司；QUAN TOF 1質譜儀，融智生物科技（青島）有限公司；AL 204電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IQ7000 超純水機，密理博（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 禽肉蛋白質的提取。

稱取25 g禽肉樣品（分別為雞肉、鴨肉、鵝肉），用水清洗，放入無菌袋；倒入225 mL PBS到無菌袋；以4次/s的速度均質2 min；將上清倒入50 mL離心管中，4 ℃冰箱，靜置8 h。再從50 mL 離心管中取上清，即得肉浸液，放入-80 ℃冰箱備用。取2 μL肉浸液，加 18 μL SA IV型蛋白、多肽提取或純化試劑，混勻，滴加2 μL于靶點正中，干燥，待測。

1.3.2 質譜數據的采集。

將制備好的樣品靶通過檢測口放入質譜儀內部托盤并固定。啟動激光系統提供脈沖激光，打擊樣品靶點，在質荷比（m/z）2 000～34 000掃描和采集數據。 采用儀器自帶分析軟件對質譜圖進行平滑、對齊、歸一化等處理。

1.3.3 化學計量學分析。

將采集到的56組MALDI-TOF MS數據導入ChemPattern化學計量學軟件［科邁恩（北京）科技有限公司］，篩選獲得共有模式，再對雞、鴨、鵝3種禽肉的差異性進行多元統計分析。

2 結果與分析

2.1 禽肉動物源性成分指紋圖譜的建立 對56批次3種不同的禽肉進行測定，采集MALDI-TOF MS譜圖，并進行平滑、對齊、歸一化等處理，雞、鴨、鵝3種不同類型禽肉質譜圖如圖1所示。

2.2 指紋圖譜相似度分析

將質譜數據導入ChemPattern軟件進行分析，樣品圖譜經去背景、平滑等規范化前處理，以保留時間對樣品圖譜進行校正。采用歐氏距離算法分析相似度，結果發現（圖2），雞、鴨、鵝3種不同類型禽肉能夠歸屬到各自類別，同一類型產品距離共有模式的距離相當，分離效果較好。

2.3 指紋圖譜多元統計分析 多元統計分析方法常用的有系統聚類分析、主成分分析、偏最小二乘判別分析、自組織映射人工神經網絡等［30］。系統聚類分析是一組將研究對象分為相對同質的群組的統計分析技術，以距離函數的規律作模式分類，將相似的歸為一類，不相似的歸為一類［31］。主成分分析是一種有效的數據降維方法，僅用部分主成分就能表達原有變量的重要信息［32］。偏最小二乘判別分析是對多元線性回歸模型的拓展，是偏最小二乘回歸的特殊形式。自組織映射人工神經網絡廣泛適用于復雜體系數據的可視化、降維、模式識別以及數據挖掘，任意維數的原始數據都可以在保持拓撲結構不變的情況下映射到二維空間內。

雞、鴨、鵝3種不同類型禽肉的系統聚類分析如圖3所示。它按照不同對象之間的差異，利用歐式距離函數作模式進行分類。圖3b中的顏色代表歸一化法下各個峰所占的面積百分比，可以看出21、7、20號峰在3種不同類型禽肉中區別較大，是區別3種不同類型禽肉的強特征峰。系統聚類分析結果顯示3種不同類型禽肉能被很好地區分開。該分析方法為不同類型禽肉的鑒別提供了依據，可直觀地觀察每個樣品中的共有峰在樣本和自變量2個維度中所形成的聚類模式，以及其對聚類結果的影響，同時能夠清楚地反映出樣本或變量的親疏關系。

圖4～5分別為雞、鴨、鵝3種不同類型禽肉的主成分分析和偏最小二乘回歸分析，2種不同的分析方法結果完全相同；盡管鵝的樣品中49、52號樣品出現偏離現象，但從圖中可以看出，3種不同類型禽肉能很好地被分開。自組織映射神經網絡分析（圖6）顯示的樣品位置情況更為直觀，樣品分類結果與前2 種分析方法一致。

2.4 化學模式識別

將雞肉樣品作為測試集，采用PLS-DA算法進行模式識別，測試結果如表1、圖7所示。從表1和圖7可以看出，雞肉樣品全部被識別，誤識率為0、識別率達100%。因此，所建立的模型能夠提供一個穩定的評價標準，準確判定所選禽肉的類型。

3 結論

該研究采用MALDI-TOF MS技術從分子層面對不同禽肉進行鑒定，結果準確可靠。該方法前處理簡單，樣本只需進行常規肉浸液提取后即可上機檢測，每小時可處理30個以上的樣本，快速高通量。利用構建成的不同禽肉蛋白質分子指紋圖譜標準數據庫，可一次性對每個樣品中雞、鴨、鵝等肉源性成分進行同時分析。該研究不僅可以為檢驗檢測機構提供一種有效鑒別不同禽肉的檢測方法，還可以為監督執法機構提供一種有力的監督手段，維護禽肉食品市場更穩定更健康的發展。

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