MALDI-TOF MS在不同禽肉動(dòng)物源性成分檢測(cè)中的研究

方志娟 李曉芹 張雪婧 沈麒亮 金萍 葉湖

摘要 ［目的］建立基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技術(shù)檢測(cè)不同禽肉動(dòng)物源性成分的方法，構(gòu)建不同禽肉蛋白質(zhì)分子指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫，對(duì)不同禽肉進(jìn)行鑒別。［方法］樣品用磷酸鹽緩沖液提取，凈化后用MALDI-TOF MS法測(cè)定。采用ChemPattern軟件對(duì)不同禽肉蛋白圖譜進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，建立識(shí)別模型。［結(jié)果］雞、鴨、鵝3種不同禽肉之間具有明顯差異。首次建立不同禽肉蛋白質(zhì)分子指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫，可一次性對(duì)每個(gè)樣品中雞、鴨、鵝等肉源性成分進(jìn)行同時(shí)分析。［結(jié)論］建立的基于蛋白質(zhì)組學(xué)的雞、鴨、鵝源性成分鑒定系統(tǒng)具有簡便、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，適用于不同禽肉中雞鴨鵝動(dòng)物源性成分的鑒別。

關(guān)鍵詞 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；動(dòng)物源；成分；檢測(cè)；禽肉

中圖分類號(hào) TS 251.7? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2023）07-0189-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.07.043

Study on Detection of Animal-derived Components in Different Poultry Meat by MALDI-TOF MS

FANG Zhi-juan，LI Xiao-qin，ZHANG Xue-jing et al

（Suzhou Food Inspection and Testing Center，Suzhou，Jiangsu 215104）

Abstract ［Objective］Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS） was used to detect the animal-derived components of different poultry meat.The standard database of protein molecular fingerprints was established to identify different poultry meat.［Method］Samples were extracted with phosphate buffer and determined by MALDI-TOF MS.ChemPattern software was used to carry out chemometric analysis on protein profiles of different poultry meat，and then an identification model was established.［Result］There are obvious differences among three kinds of poultry meat （chicken，duck and goose）.It was the first time to establish a standard database of protein molecular fingerprints of different poultry meat，which could be used for simultaneous analysis of chicken，duck，goose and other meat derived components in each sample at one time.［Conclusion］The identification system of chicken，duck and goose based on proteomics has the advantage of simplicity，stability，accuracy and good reproducibility.It is suitable for the identification of animal-derived components of chicken，duck and goose.

Key words Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS）; Animal-derived;Component;Detection; Poultry

基金項(xiàng)目 江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局科技計(jì)劃項(xiàng)目（KJ21125003）；江蘇省市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

項(xiàng)目“食品安全快檢技術(shù)與產(chǎn)品評(píng)價(jià)”。

作者簡介 方志娟（1987—），女，江蘇南通人，工程師，碩士，從事食品檢驗(yàn)研究。通信作者，高級(jí)工程師，從事食品檢驗(yàn)與質(zhì)量控制研究。

收稿日期 2022-09-01

隨著生活水平的提高，人們對(duì)肉類的需求越來越大，同時(shí)對(duì)肉類品質(zhì)也提出了更高的要求［1］。“鴨肉冒充羊肉”等一系列事件，讓消費(fèi)者對(duì)肉類摻假問題越來越重視［2］。肉類摻假主要是為了有目的地獲得產(chǎn)品的表觀價(jià)值或降低產(chǎn)品的成本，這種欺詐行為嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的權(quán)利和健康，擾亂了市場(chǎng)公平交易機(jī)制［3-5］。因此，開發(fā)高效、靈敏、快速的肉類鑒別技術(shù)和體系，有利于打擊肉類摻假和欺詐行為，具有非常重要的實(shí)用價(jià)值和社會(huì)意義［6-8］。

目前鑒別肉類摻假的方法很多，有實(shí)時(shí)熒光PCR法［9-11］、酶聯(lián)免疫分析法［12］、電子鼻結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析技術(shù)［13-15］、核磁共振技術(shù)［16-18］、近紅外特征光譜技術(shù)［19-21］等。MALDI-TOF MS技術(shù)是基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）技術(shù)與飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF MS）的結(jié)合，具有快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點(diǎn)［22-24］。近年來，已被越來越多地應(yīng)用于微生物鑒定等各領(lǐng)域［25-29］。研發(fā)低成本、高通量的MALDI-TOF MS技術(shù)可能成為肉類摻假鑒別方法的主流趨勢(shì)和發(fā)展方向。該研究利用MALDI-TOF MS技術(shù)分析不同禽肉如雞、鴨、鵝的蛋白質(zhì)譜圖，首次建立不同禽肉蛋白質(zhì)分子指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫；配合ChemPattern先進(jìn)化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，建立基于蛋白質(zhì)組學(xué)的雞、鴨、鵝源性成分鑒定系統(tǒng)，為雞、鴨、鵝3種不同禽肉動(dòng)物源性成分的鑒別提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磷酸鹽緩沖液（PBS）、SA IV型蛋白、多肽提取或純化試劑，融智生物科技（青島）有限公司。禽肉樣品（16批次雞、25批次鴨、15批次鵝），均購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

BagMixer 400拍打式均質(zhì)器，法國Interscience公司；QUAN TOF 1質(zhì)譜儀，融智生物科技（青島）有限公司；AL 204電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IQ7000 超純水機(jī)，密理博（中國）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 禽肉蛋白質(zhì)的提取。

稱取25 g禽肉樣品（分別為雞肉、鴨肉、鵝肉），用水清洗，放入無菌袋；倒入225 mL PBS到無菌袋；以4次/s的速度均質(zhì)2 min；將上清倒入50 mL離心管中，4 ℃冰箱，靜置8 h。再從50 mL 離心管中取上清，即得肉浸液，放入-80 ℃冰箱備用。取2 μL肉浸液，加 18 μL SA IV型蛋白、多肽提取或純化試劑，混勻，滴加2 μL于靶點(diǎn)正中，干燥，待測(cè)。

1.3.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集。

將制備好的樣品靶通過檢測(cè)口放入質(zhì)譜儀內(nèi)部托盤并固定。啟動(dòng)激光系統(tǒng)提供脈沖激光，打擊樣品靶點(diǎn)，在質(zhì)荷比（m/z）2 000～34 000掃描和采集數(shù)據(jù)。 采用儀器自帶分析軟件對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行平滑、對(duì)齊、歸一化等處理。

1.3.3 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析。

將采集到的56組MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)導(dǎo)入ChemPattern化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件［科邁恩（北京）科技有限公司］，篩選獲得共有模式，再對(duì)雞、鴨、鵝3種禽肉的差異性進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 禽肉動(dòng)物源性成分指紋圖譜的建立 對(duì)56批次3種不同的禽肉進(jìn)行測(cè)定，采集MALDI-TOF MS譜圖，并進(jìn)行平滑、對(duì)齊、歸一化等處理，雞、鴨、鵝3種不同類型禽肉質(zhì)譜圖如圖1所示。

2.2 指紋圖譜相似度分析

將質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入ChemPattern軟件進(jìn)行分析，樣品圖譜經(jīng)去背景、平滑等規(guī)范化前處理，以保留時(shí)間對(duì)樣品圖譜進(jìn)行校正。采用歐氏距離算法分析相似度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），雞、鴨、鵝3種不同類型禽肉能夠歸屬到各自類別，同一類型產(chǎn)品距離共有模式的距離相當(dāng)，分離效果較好。

2.3 指紋圖譜多元統(tǒng)計(jì)分析 多元統(tǒng)計(jì)分析方法常用的有系統(tǒng)聚類分析、主成分分析、偏最小二乘判別分析、自組織映射人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等［30］。系統(tǒng)聚類分析是一組將研究對(duì)象分為相對(duì)同質(zhì)的群組的統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)，以距離函數(shù)的規(guī)律作模式分類，將相似的歸為一類，不相似的歸為一類［31］。主成分分析是一種有效的數(shù)據(jù)降維方法，僅用部分主成分就能表達(dá)原有變量的重要信息［32］。偏最小二乘判別分析是對(duì)多元線性回歸模型的拓展，是偏最小二乘回歸的特殊形式。自組織映射人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)廣泛適用于復(fù)雜體系數(shù)據(jù)的可視化、降維、模式識(shí)別以及數(shù)據(jù)挖掘，任意維數(shù)的原始數(shù)據(jù)都可以在保持拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不變的情況下映射到二維空間內(nèi)。

雞、鴨、鵝3種不同類型禽肉的系統(tǒng)聚類分析如圖3所示。它按照不同對(duì)象之間的差異，利用歐式距離函數(shù)作模式進(jìn)行分類。圖3b中的顏色代表歸一化法下各個(gè)峰所占的面積百分比，可以看出21、7、20號(hào)峰在3種不同類型禽肉中區(qū)別較大，是區(qū)別3種不同類型禽肉的強(qiáng)特征峰。系統(tǒng)聚類分析結(jié)果顯示3種不同類型禽肉能被很好地區(qū)分開。該分析方法為不同類型禽肉的鑒別提供了依據(jù)，可直觀地觀察每個(gè)樣品中的共有峰在樣本和自變量2個(gè)維度中所形成的聚類模式，以及其對(duì)聚類結(jié)果的影響，同時(shí)能夠清楚地反映出樣本或變量的親疏關(guān)系。

圖4～5分別為雞、鴨、鵝3種不同類型禽肉的主成分分析和偏最小二乘回歸分析，2種不同的分析方法結(jié)果完全相同；盡管鵝的樣品中49、52號(hào)樣品出現(xiàn)偏離現(xiàn)象，但從圖中可以看出，3種不同類型禽肉能很好地被分開。自組織映射神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析（圖6）顯示的樣品位置情況更為直觀，樣品分類結(jié)果與前2 種分析方法一致。

2.4 化學(xué)模式識(shí)別

將雞肉樣品作為測(cè)試集，采用PLS-DA算法進(jìn)行模式識(shí)別，測(cè)試結(jié)果如表1、圖7所示。從表1和圖7可以看出，雞肉樣品全部被識(shí)別，誤識(shí)率為0、識(shí)別率達(dá)100%。因此，所建立的模型能夠提供一個(gè)穩(wěn)定的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確判定所選禽肉的類型。

3 結(jié)論

該研究采用MALDI-TOF MS技術(shù)從分子層面對(duì)不同禽肉進(jìn)行鑒定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。該方法前處理簡單，樣本只需進(jìn)行常規(guī)肉浸液提取后即可上機(jī)檢測(cè)，每小時(shí)可處理30個(gè)以上的樣本，快速高通量。利用構(gòu)建成的不同禽肉蛋白質(zhì)分子指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫，可一次性對(duì)每個(gè)樣品中雞、鴨、鵝等肉源性成分進(jìn)行同時(shí)分析。該研究不僅可以為檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供一種有效鑒別不同禽肉的檢測(cè)方法，還可以為監(jiān)督執(zhí)法機(jī)構(gòu)提供一種有力的監(jiān)督手段，維護(hù)禽肉食品市場(chǎng)更穩(wěn)定更健康的發(fā)展。

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