長(zhǎng)鏈非編碼RNA共表達(dá)基因在卵巢上皮性癌的生物學(xué)作用

李耀威 壽堅(jiān) 陳龍

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是導(dǎo)致婦科惡性腫瘤患者死亡的主要原因，75%OC病理類(lèi)型系上皮性來(lái)源，卵巢上皮性癌（epithelial ovarian carcinoma，EOC）患者的生存率近年來(lái)未明顯提高［1］，鑒定敏感且切實(shí)有效的生物標(biāo)志物對(duì)實(shí)現(xiàn)早期診斷或有效預(yù)測(cè)EOC 患者的臨床預(yù)后有重要的現(xiàn)實(shí)意義。lncRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，越來(lái)越多證據(jù)表明lncRNA 起著癌基因、抑癌基因或兩者兼?zhèn)涞淖饔茫?-4］。然而，大多數(shù)lncRNA 的表達(dá)模式、生物學(xué)功能和臨床意義仍不甚清楚。本研究對(duì)在OC 患者中表達(dá)異常lncRNA 相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)編碼基因（protein coding gene，PCG）進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期對(duì)lncRNA 在參與OC 致病、進(jìn)展、預(yù)后等方面機(jī)制增進(jìn)了解，進(jìn)而為后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供線索。

1 資料與方法

1.1 獲取OC 組織中與lncRNA 共表達(dá)且差異表達(dá)的基因（1）差異表達(dá)mRNA 芯片數(shù)據(jù)的獲取：①在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)中心（NCBI）的Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與OC 相關(guān)的mRNA 表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集（檢索條件：研究類(lèi)型為expression profiling by array、種屬為homo sapiens、病例和對(duì)照樣本數(shù)目均≥10 例、時(shí)間為自建庫(kù)至2022 年12 月31 日），隨后下載符合納入條件的mRNA 表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集備后續(xù)分析。②R/Bioconductor 中的Limma 軟件包（3.36.5 版）用于識(shí)別OC組織和正常卵巢上皮組織之間的差異表達(dá)基因（DEG）。使用Benjamini 和Hochberg 提出的偽發(fā)現(xiàn)率（FDR）得到調(diào)整后P值糾正偽陽(yáng)性結(jié)果。P＜0.05和|log2（FC）|＞1 設(shè)置為差異基因的納入標(biāo)準(zhǔn)［注：FC表示差異倍數(shù)（fold change）］。根據(jù)下載的平臺(tái)注釋文件匹配矩陣文件中的原始探針數(shù)據(jù)為基因名稱(chēng)，通過(guò)最小P 值選擇同一基因?qū)?yīng)的多個(gè)探針的表達(dá)值作為該基因的表達(dá)值。（2）在OC 組織中與lncRNA 共表達(dá)基因的獲取。①利用關(guān)鍵詞“l(fā)ong non-coding RNA”、“l(fā)ong noncoding RNA”、“l(fā)ncRNA”、“ovarian cancer”、“ovarian carcinoma”、“ovarian neoplasm”、“ovarian tumor”、“ovarian tumors”、“ovarian tumour”、“ovarian tumours”、“ovarian malignancy”通過(guò)計(jì)算機(jī)及手工檢索Medline/PubMed、EMBASE、Web of Knowledge 數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索時(shí)間從建庫(kù)至2022 年12 月31 日。查找來(lái)源于OC 患者、經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)表達(dá)異常且明確已知其序列及結(jié)構(gòu)等注釋信息的lncRNA 納入分析。②利用perl 語(yǔ)言及R 語(yǔ)言平臺(tái)使用皮爾森相關(guān)系數(shù)和z-test 檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)lncRNA 的表達(dá)水平與每個(gè)PCG 之間的相關(guān)性。與目標(biāo)lncRNA 正或負(fù)相關(guān)的PCG 被視為與lncRNA 相關(guān)的PCG（| pearson correlation|＞ 0.4，P＜0.01 為判定標(biāo)準(zhǔn)）。（3）通過(guò)Venny 2.1.0 在線工具，取相關(guān)芯片數(shù)據(jù)差異基因（A）與lncRNA 共表達(dá)相關(guān)基因（B）的交集即獲得OC 組織中與lncRNA 共表達(dá)且差異表達(dá)的PCG。

1.2 生物學(xué)功能及通路富集分析 利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID 中GO 和KEGG 進(jìn)行生物功能及通路富集分析，F(xiàn)DR＜0.05 判定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 及hub gene 確 定 PPI 網(wǎng)絡(luò)由STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建，并使用Cytoscape 進(jìn)行可視化處理。Hub gene 是在生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要作用的基因，在相關(guān)通路中，其他基因的調(diào)控常受該基因的影響，PPI 網(wǎng)絡(luò)中degree ≥10 判定為hub gene 的納入標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 Module 分析 使用Cytoscape 軟件MCODE 軟件包進(jìn)行module 分析，設(shè)定degree cutoff=2，node score cutoff=0.2，k-core=2，and max.depth=100。使用DAVID對(duì)module 中的DEG 進(jìn)行GO 分析及KEGG 通路富集分析。

1.5 對(duì)hub gene 進(jìn)行生存分析 OncoLnc 是與mRNA、miRNA 或lncRNA 的表達(dá)數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)的可用于生存分析的在線工具。

2 結(jié)果

2.1 OC 組織中與lncRNA 共表達(dá)且差異表達(dá)基因的獲得（1）OC 組織中差異表達(dá)基因的獲得：由GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得GSE14407 和GSE18520 兩個(gè)mRNA 表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集。GSE14407 和GSE1852 芯片數(shù)據(jù)集分別由12、53 個(gè)上皮性O(shè)C 組織和12、10 個(gè)正常卵巢上皮組織構(gòu)成。從GSE14407、GSE18520 數(shù)據(jù)集中分別識(shí)別出2328 和9590 個(gè)DEG。（2）lncRNA 數(shù)據(jù)的獲得：通過(guò)檢索文獻(xiàn)共獲得9 種lncRNA（分別是LINC01088［5］、SNHG3［6］、SPRY4-IT1［7］、CPS1-IT1［8］、CDKN2BAS1（又 名ANRIL）［9］、MALAT1［10］、FAM215A［11］、LINC00472［11］和HOTAIR［12］，以上均已知序列及結(jié)構(gòu)等注釋信息）供作者進(jìn)行生物信息學(xué)分析研究。利用皮爾森相關(guān)系數(shù)和z-test 檢驗(yàn)9 種lncRNA 的表達(dá)水平與每個(gè)PCG 之間的相關(guān)性后發(fā)現(xiàn)，9 種lncRNA 共表達(dá)的PCG 數(shù)目（去重后）總和為15,965 個(gè)。（3）利用在線工具venny 將GSE18520、GSE14407 數(shù)據(jù)集所得DEG同與lncRNA 共表達(dá)的PCG 取交集得到與lncRNA 共表達(dá)且屬差異表達(dá)的基因共1,421 個(gè)。

2.2 與lncRNA 共表達(dá)且屬差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能分析 GO分析發(fā)現(xiàn)許多共表達(dá)差異基因參與了DNA replication、cell division、cell proliferation、extracellular exosome 及protein binding 等功能富集過(guò)程；KEGG 分析發(fā)現(xiàn)在這些共表達(dá)基因中有49 個(gè)基因參與了pathways in cancer 信號(hào)通路。見(jiàn)表1。

表1 與lncRNA共表達(dá)的差異表達(dá)基因的GO及KEGG分析

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和hub gene 確定及互作分析 經(jīng)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建后，滿足與lncRNA 共表達(dá)且屬差異表達(dá)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)由979 nodes 和5,060 edges 組成。隨后篩選出滿足條件的hub gene 共274 個(gè)。

2.4 Module 確定和功能富集分析 用Cytoscape 軟件中的MCODE 應(yīng)用程序分析互作網(wǎng)絡(luò)后，獲得2 個(gè)重要module，標(biāo)記為module 1 和module 2，分別包括46、35個(gè)nodes 和917、290 個(gè)edges。對(duì)module 1 進(jìn)行GO 分析表明，這些基因參與cell cycle、cell division、ATP binding、nucleoside binding、nucleotide binding、microtubule motor activity 等生物學(xué)過(guò)程；KEGG 分析發(fā)現(xiàn)參與Cell cycle及Oocyte meiosis 信號(hào)通路。對(duì) module 2 進(jìn)行GO 分析表明，這些基因參與modification-dependent macromolecule catabolic process、modification-dependent protein catabolic process、cellular protein catabolic process、protein ubiquitination、ubiquitin-protein ligase activity、actin binding 等生物學(xué)過(guò)程，KEGG 分析表明參與Ubiquitin mediated proteolysis 信號(hào)通路。

2.5 hub gene 表達(dá)水平對(duì)OC 患者總體生存情況的影響 由于hub gene 在生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要作用，在相關(guān)通路中，其他基因的調(diào)控常受到hub gene 影響，因此，檢驗(yàn)hub gene 與OC 患者預(yù)后轉(zhuǎn)歸情況有重要臨床意義。利用OncoLnc 評(píng)估了所得的274 個(gè)hub gene與OC 患者預(yù)后相關(guān)性的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)水平的CDCA3、IQGAP1、BTRC、UBR4、FBXL3、FGF2、SYT1、TRIM4、REPS1、AGFG1、PCNT、POLK、PTGER3和QKI 與OC 患者的總體生存率（OS）降低顯著相關(guān)（P＜0.05）；低表達(dá)水平的EXO1、MCM3、POLR2D、ANAPC11、SPC24、KLHL25、LSM4、PUF60 和EIF3M與OC 患者的OS 降低顯著相關(guān)（P＜0.05）。

3 討論

據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)表明，大約70%的OC 患者在首次明確診斷時(shí)已屬腫瘤晚期（III 或IV 期），其5 年生存率＜30%；然而，能早期（I 或II 期）明確診斷的患者5年生存率高達(dá)70%～90%［13］，故開(kāi)發(fā)敏感且可靠的生物標(biāo)志物以早期診斷OC進(jìn)而制定有效防治策略具有重要意義。相關(guān)研究表明異常表達(dá)的lncRNA 與包括OC 在內(nèi)的惡性腫瘤的發(fā)生、耐藥及診斷預(yù)后密切相關(guān)［14-15］。

在本研究中，作者對(duì)已發(fā)表的有關(guān)OC 患者異常表達(dá)lncRNA 相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分析，得到目前已知序列及結(jié)構(gòu)等注釋信息的lncRNA 共9 種，隨后通過(guò)與GSE14407、GSE18520 數(shù)據(jù)集取交集獲得在OC 組織中與上述差異lncRNA 相關(guān)的差異表達(dá)基因共1,421 個(gè)。這些差異基因由478 個(gè)上調(diào)基因和943 個(gè)下調(diào)基因組成。這些差異基因在細(xì)胞組成（CC）方面主要富集在細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)、中間體、微管、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜、有絲分裂核分裂、細(xì)胞核和溶酶體膜等部位；在生物學(xué)過(guò)程（BP）方面主要富集在DNA 復(fù)制、細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖和胞外外泌體等過(guò)程；在分子功能（MF）方面主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合過(guò)程。KEGG 分析提示49 個(gè)差異表達(dá)基因（上調(diào)18 個(gè)，下調(diào)31 個(gè)）參與了Pathways in cancer 通路。隨后，從PPI 網(wǎng)絡(luò)中篩選出hub gene 274個(gè)；經(jīng)OncoLnc 在線工具分析這些hub gene 與OC 患者的生存預(yù)后相關(guān)性后發(fā)現(xiàn)，14 個(gè)基因的高水平表達(dá)和9 個(gè)基因的低水平表達(dá)與OC 患者的不良OS 結(jié)局密切相關(guān)。

一些hub gene 已在其他實(shí)驗(yàn)研究中得到證實(shí)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。例如，CDCA3 在各種類(lèi)型癌癥的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［16-17］。本研究提示，CDCA3在OC 患者中表達(dá)水平異常升高，且與OC 患者的不良預(yù)后相關(guān)（P＜0.05），提示CDCA3 有望作為腫瘤預(yù)后標(biāo)志物。又如，在先前報(bào)道的OC 研究中，IQGAP1 在OC浸潤(rùn)前期的高表達(dá)水平和彌散性表達(dá)模式與不良預(yù)后顯著相關(guān)，表明IQGAP1 可能是OC 的潛在預(yù)后標(biāo)志物。就目前診治水平而言，OC 的預(yù)后仍較差，這與OC 患者明確診斷時(shí)間較晚及患者并發(fā)廣泛的腹膜內(nèi)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究中的預(yù)后分析表明IQGAP1 與OC 的OS不良預(yù)后密切相關(guān)。若進(jìn)一步深入研究其致病性、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為機(jī)理，則有望指導(dǎo)IQGAP1 高表達(dá)和彌散性表達(dá)患者個(gè)體化隨訪頻率并設(shè)計(jì)出更為有效的治療方法。其他hub gene，如EXO1、POLR2D、BTRC等在本研究中均提示與OC 的不良預(yù)后密切關(guān)系，但這些基因在腫瘤方面的研究報(bào)道甚少，故有進(jìn)一步研究挖掘的潛在意義。

綜上所述，與lncRNA 相關(guān)聯(lián)的hub gene 的異常表達(dá)與OC 患者的不良OS 預(yù)后密切相關(guān)，一些hub gene如MCM3、CDCA3、IQGAP1、KLHL25 及SPC24 等在其他實(shí)驗(yàn)研究中也已得到證實(shí)，相對(duì)較多的hub gene 與腫瘤的預(yù)后相關(guān)性尚未見(jiàn)于文獻(xiàn)報(bào)道。目前關(guān)于lncRNA及其靶基因協(xié)同作用在OC 的基礎(chǔ)和臨床研究較少，故值得進(jìn)一步探究，因此，本研究對(duì)于開(kāi)展lncRNA 及與之共表達(dá)的相關(guān)基因?qū)C 的診斷、預(yù)后等實(shí)驗(yàn)生物學(xué)研究具有一定的啟示作用。下一步，本課題組將對(duì)篩選的部分差異基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和臨床雙重驗(yàn)證，并將追蹤更新的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。