前胡總香豆素對高糖誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的保護作用*

房小鈺，葛廷雨，劉 森，常文莉，黃 鵬，黃和平，徐國兵，2，汪電雷

（1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230031；2.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051）

糖尿病是一種常見的內分泌系統疾病，其病因是胰島素分泌不足或機體對胰島素抵抗。血管病變是糖尿病患者可能出現的最嚴重疾病之一，其起因是高糖誘導使血管內皮細胞受到損傷[1]。糖尿病的發病時間較長，而長時間處于高血糖狀態會給身體的各種組織和器官造成慢性損害，從而導致身體功能性損害[2-4]。糖尿病的發病率和氧化應激有著密切的關聯。若機體發生氧化應激反應，微循環就會遭到損壞，繼而累及人體內的血管內皮細胞，而且長時間處于高血糖狀態將會對血管內皮細胞造成嚴重的損傷[5]。

前胡始載于《名醫別錄》中，主要采集于傘形科白花前胡（Peucedanum praeruptorumDunn）的干燥根，具有降氣化痰、疏散風熱等功效[6]。前胡主要成分為香豆素類化合物。目前有研究發現香豆素類化合物具有保護血管、抗氧化、抗HIV、抗腫瘤等藥理作用[7-9]，而且香豆素類化合物有著多靶點調節，療效溫和、持久，以及副作用較小等優點。韓瑩等[10]研究發現3-溴-4,7-二甲基-6-磺酰脲香豆素可明顯降低小鼠血糖。前胡總香豆素能降低2型糖尿病大鼠血糖[11]。為了進一步探究其降糖作用機制，本研究采用人臍靜脈內皮細胞建立高糖誘導的HUVECs損傷模型，觀察前胡總香豆素對氧化應激和細胞凋亡的影響，以期為前胡總香豆素降糖效果研究提供參考。

1 材料

1.1 細胞株 HUVECs（批號：CRL-1730）由安徽省食品藥品檢驗研究院提供。

1.2 藥物與試劑 前胡總香豆素（批號：20201206）由安徽省食品藥品檢驗研究院提供；胎牛血清（批號：42Q0682K）購自美國Gibco公司；DMEM低糖培養基（批號：AG29694193）購自美國HyClone公司；CCK-8（批號：71011000）購自Biosharp；GSH-Px檢測試劑盒（批號：S0056）、SOD活性檢測試劑盒（批號：S0101S）、NO檢測試劑盒（批號：S0021S）、LDH毒性檢測試劑盒（批號：C0016）、Hoechst 33258染色試劑盒（批號：C003）均購自碧云天生物技術研究所；MDA檢測試劑盒（批號：BL904A）購自Biosharp；人TNF-α酶聯免疫分析試劑盒（批號：202110）、人IL-1β酶聯免疫分析試劑盒（批號：202110）均購自江蘇酶免實業有限公司；Bcl-2抗體（批號：AF6139）、Bax抗體（批號：AF0120）均購自Affinity Biosciences；cleaved Caspase-3抗體（批號：R23727）購自Zenbio；GAPDH抗體（批號：210040421）、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG（批號：216790201）、辣根酶標記山羊抗兔IgG（批號：210830419）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 主要儀器 CLM-170B-8-CN型CO2細胞培養箱（新加坡藝思高科技有限公司）；SW-CJ-1D型超凈工作臺（蘇州博萊爾凈化設備有限公司）；SC-3610型低速離心機（科大創新股份有限公司中佳分公司）；IX71型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；MS-1500型酶標儀（美國Thermo公司）；AI-600型超靈敏多功能成像儀（美國CE Amersham Imager公司）。

2 方法

2.1 HUVECs培養 人臍靜脈內皮細胞置于10%胎牛血清DMEM低糖培養基中，在培養箱中進行孵育，條件為37 ℃，5%CO2。2 d換一次培養基，待細胞生長到80%左右，加入胰酶消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

2.2 前胡總香豆素對高糖誘導HUVECs損傷模型的濃度篩選將細胞以密度為5×104個/mL接種在96孔板內，100 μL/孔，在培養箱放置過夜使之貼壁，然后吸盡培養液，隨機分成8組。正常對照組加入新的培養液；高糖模型組及給藥組分別加入100 μL高糖培養基培養48 h后，高糖模型組加入完全培養基，給藥組分別加入不同濃度的前胡總香豆素（5、10、20、40、80、160 μg/mL），放入培養箱孵育，24 h后向培養板加入CCK-8試劑，10 μL/孔，繼續放培養箱內孵育45 min，酶標儀檢測450 nm處的OD值，計算細胞增殖活力。

2.3 細胞分組與給藥 將HUVECs隨機分成正常對照組、高糖模型組、前胡總香豆素低劑量組、前胡總香豆素中劑量組、前胡總香豆素高劑量組。正常對照組：加入5.5 mmol/L葡萄糖；高糖模型組：加入35 mmol/L葡萄糖；前胡總香豆素低劑量組：先加入35 mmol/L葡萄糖培養48 h，再加入10 μg/mL的前胡總香豆素；前胡總香豆素中劑量組：先加入35 mmol/L葡萄糖培養48 h，再加入20 μg/mL的前胡總香豆素；前胡總香豆素高劑量組：先加入35 mmol/L葡萄糖培養48 h，再加入40 μg/mL的前胡總香豆素。然后各組放培養箱內繼續培養24 h，以備后續指標檢測。

2.4 倒置顯微鏡觀察HUVECs形態 將細胞以密度為8×103個/mL接種在6孔板內，按“2.3”項下分組分別給藥培養后，使用倒置顯微鏡觀察各組細胞的形態變化并拍照。

2.5 GSH-Px、SOD活性及MDA含量檢測

2.5.1 GSH-Px活性檢測 依照操作說明往96孔板中按順序加入各種試劑溶液，輕緩搖晃使之混勻。即刻使用酶標儀測各孔在340 nm處的OD值，此時記錄為0 min數值。待酶標儀溫度達到25 ℃時再測定OD340值，此后每隔1 min記錄一次，連續5次，可獲得6個點的數據，計算GSH-Px活性。

2.5.2 SOD活性檢測 依照說明書配制所需溶液，設置待測樣品組、空白對照組1、空白對照組2，按順序放待測樣品及其余各種溶液，最后放反應啟動工作液并使之充分混勻，37 ℃靜置30 min，使用酶標儀測450 nm處的OD值，計算SOD活性。

2.5.3 MDA含量測定 按照說明書配制所需溶液，設置空白對照組、標準品組、待測樣品組。并按照說明書操作步驟依次加樣，最后酶標儀上測定532 nm波長下的吸光度。對應的試樣濃度由標準曲線和吸光度進行計算，再根據用BCA試劑盒檢測出的蛋白濃度計算各組細胞的MDA含量。

2.6 HUVECs培養上清液中NO、LDH含量檢測 將細胞以密度為8×103/mL接種在6孔板內，按“2.3”項下分組分別給藥培養后，取上清液，嚴格依照各說明書進行操作，檢測其上清液中NO、LDH含量。

2.7 Hoechst染色檢測HUVECs凋亡 將細胞以密度為8×103個/mL接種在6孔板內，按“2.3”項下分組分別給藥培養后，棄培養液，用PBS清洗3次。滴加4%多聚甲醛，1 mL/孔，固定20 min，棄去，PBS沖洗3次。每孔加Hoechst 33258染色液1 mL，染色10 min（搖床），棄去，PBS沖洗3次。每孔加0.5 mL抗熒光淬滅劑，使用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。

2.8 ELISA法檢測各組細胞上清液中TNF-α和IL-1β水平 收集各組干預后的細胞培養液，3 000 r/min（4 ℃）離心10 min，取上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作步驟，進行樣品及標準品的稀釋、加樣、孵育抗體、加顯色劑等操作，酶標儀450 nm波長下測OD值。將標準品濃度作為橫坐標，各孔OD值作為縱坐標，繪制標曲。再根據標曲線計算樣品濃度。

2.9 Western blotting法檢測Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達量 收集5組細胞提取總蛋白，用BCA法測定各組細胞蛋白濃度，然后在每組中加入5倍上樣緩沖液用100 ℃沸水煮13 min，之后蛋白上樣、凝膠電泳（115 V，1.5 h）、轉膜（100 V，45 min），用5%脫脂奶粉對其密封2 h，用TBST洗膜3次，10 min/次。加入一抗，4 ℃下靜置一夜，搖床孵育30 min，保持4 ℃恒溫下靜置一夜，再用TBST洗膜3次，每次清洗10 min，換二抗再孵育2 h，在使用TBST洗膜3次，10 min/次，涂抹ECL，使用超靈敏多功能成像儀檢測樣品灰度值，該實驗需要獨立并重復3次。

2.10 統計學方法 使用GraphPad Prism 8進行數據分析，計量資料以“均數±標準差”表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 前胡總香豆素對高糖誘導HUVECs損傷模型的有效濃度篩選 高糖模型組細胞存活率明顯低于正常對照組（P<0.05）；前胡總香豆素各濃度組（5、10、20、40、80 μg/mL）均可提高細胞存活率（P<0.05或P<0.01）。160 μg/mL組細胞存活率低于高糖模型組。綜合結果，選擇10、20、40 μg/mL的前胡總香豆素濃度作為給藥的低、中、高劑量。（見圖1）

圖1 各組細胞存活率比較 （±s，n=6）

3.2 各組HUVECs形態學比較 正常對照組細胞生長及其貼壁情況良好，細胞間連接十分緊密，界線清晰；高糖模型組細胞生長情況差，形態各異，細胞的兩端增長或拉絲，界線模糊；前胡總香豆素低、中、高劑量組細胞形態逐漸恢復。（見圖2）

圖2 各組HUVECs 形態學比較 （×200）

3.3 各組HUVECs的GSH-Px、SOD活性及MDA、NO含量比較 高糖模型組HUVECs的GSH-Px、SOD活性及NO含量均明顯低于正常對照組（P<0.01）；前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs的GSH-Px、SOD活性及NO含量均高于高糖模型組（P<0.05或P<0.01）。高糖模型組HUVECs的MDA含量明顯高于正常對照組（P<0.01）；前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs的MDA含量均低于高糖模型組（P<0.05或P<0.01）。表明前胡總香豆素能降低高糖誘發的HUVECs氧化應激水平。（見圖3）

圖3 各組HUVECs 的GSH-Px、SOD 活性及MDA、NO含量比較 （±s，n=3）

3.4 各組HUVECs的LDH釋放量比較 高糖模型組HUVECs的LDH的釋放量明顯高于正常對照組（P<0.01）；前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs的LDH釋放量明顯低于高糖模型組（P<0.05或P<0.01）。（見圖4）

圖4 各組HUVECs 的LDH 釋放量比較 （±s，n=3）

3.5 各組HUVECs凋亡情況 正常對照組HUVECs細胞核呈現均一藍色，且細胞核形狀完整；高糖模型組HUVECs細胞核呈致密濃染，顏色發白；前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs細胞凋亡情況改善明顯。（見圖5）

圖5 各組HUVECs 凋亡情況 （×200）

3.6 各組HUVECs的TNF-α、IL-1β水平比較 高糖模型組HUVECs的TNF-α和IL-1β水平均明顯高于正常對照組（P<0.01）；前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs的TNF-α和IL-1β水平均明顯低于高糖模型組（P<0.05或P<0.01）。（見圖6）

圖6 各組HUVECs 的TNF-α、IL-1β 水平比較 （±s，n=3）

3.7 各組HUVECs的Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達量比較 高糖模型組HUVECs的Bcl-2蛋白相對表達量低于正常對照組（P<0.01）；前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs的Bcl-2蛋白相對表達量高于高糖模型組（P<0.05或P<0.01），并且呈劑量依賴性。高糖模型組HUVECs的Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達量及Bax/Bcl-2明顯高于正常對照組（P<0.01）；前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs的Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達量及Bax/Bcl-2均低于高糖模型組（P<0.05或P<0.01），并且呈劑量依賴性。（見圖7~8）

圖7 各組HUVECs 中Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達量及Bax/Bcl-2 比較 （±s，n=3）

圖8 各組HUVECs 中Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3 蛋白表達Western blotting 圖

4 討論

高糖會導致血管內皮細胞增加活性氧的生成量，進而產生氧化應激。應激會產生多種炎癥因子，從而損壞血管內皮細胞，造成其功能障礙[12]。高糖刺激后，細胞發生的氧化損傷和炎癥損傷是引發糖尿病的重要機制[13]。內皮細胞本身就擁有氧化及抗氧化系統，且一般情況下兩者維持著動態平衡。內皮細胞受到病理刺激后，其動態平衡會遭到破壞，導致細胞組織損傷。GSH-Px、SOD及過氧化氫酶（CAT）作為酶系統主要的酶，屬于抗氧化系統；SOD是人體中最常見的一種抗細胞損害的酶，能催化超氧自由基生成雙氧水和分子氧[14-15]。研究表明，提高SOD的活性能夠提高血管的內皮機能[16]，因此將SOD、GSH-Px的活力值作為人體氧化應激水平高低的判斷條件，具有重要的意義。MDA是膜脂過氧化后的分解產物，其含量可以反映細胞膜的結構和作用受傷害程度[17-18]。同時血管內皮還可以分泌NO，維持血液的動態均衡。此外，氧化應激往往伴隨有炎癥反應，氧化應激狀態下內皮細胞能夠產生TNF-α、IL-1β和IL-6等一系列炎癥因子[19]。上述炎癥因子能夠進一步加劇內皮細胞的功能紊亂，從而誘發細胞炎癥損傷。本研究發現，前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs的GSH-Px、SOD活性及NO含量明顯上升，MDA、LDH含量下降，TNF-α和IL-1β水平降低，說明前胡總香豆素可能通過抑制氧化應激和炎癥反應來保護高糖造成的HUVECs損傷。

細胞凋亡即細胞程序性死亡，可清除有害細胞，而異常的細胞凋亡則會導致一系列疾病[20]。Bcl-2和Bax是細胞凋亡中重要的調節蛋白；Bcl-2能夠降低或者阻斷DNA裂解、細胞皺縮及染色質濃縮，在凋亡早期作用重大[21]；Bax的促細胞凋亡作用則是通過其本身形成的Bax同源二聚體造成的，它還可以與Bcl-2形成Bax-Bcl-2異源二聚體從而抑制細胞凋亡[22]。正常情況下Bcl-2與Bax結合后可阻斷Bax、Bax異源二聚體的形成。Bax/Bcl-2表達比率對于誘導細胞凋亡至關重要，該比率對細胞凋亡速度有一定決定性作用[23]。Bax/Bcl-2比率太高將會導致細胞色素C從線粒體快速進入細胞質，從而激活Caspase-3。Caspase-3是細胞凋亡的執行因子，通常作為酶原出現；Caspase-3一旦被活化則以其切割形式cleaved Caspase-3存在，從而促進細胞凋亡[24-25]。研究表明，高滲環境損傷和氧化損傷可以激發線粒體的凋亡途徑，調節Bc1-2家族成員活性，并通過活化胞質中促凋亡蛋白Bax或Bax二聚體，抑制抗凋亡蛋白Bc1-2表達，從而調節細胞凋亡[26]。本研究發現，前胡總香豆素低、中、高劑量組HUVECs的Bcl-2蛋白相對表達量升高，Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達量及Bax/Bcl-2顯著降低，說明前胡總香豆素能通過抑制細胞凋亡對高糖損傷HUVECs產生一定的保護作用，且低、中、高劑量前胡總香豆素對HUVECs的保護作用存在一定的劑量依賴性，即劑量越高對HUVECs的保護作用越明顯。

綜上所述，前胡總香豆素能夠通過降低細胞內MDA、LDH含量及提高GSH-Px、SOD、NO活性，改善高糖導致的HUVECs氧化應激損傷；前胡總香豆素能有效控制TNF-α和IL-1β等炎癥因子，抑制炎癥反應；同時前胡總香豆素可以增強抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表達，下調凋亡因子Bax、cleaved Caspase-3的蛋白表達，降低Bax/Bcl-2，從而控制細胞凋亡。本研究驗證了前胡總香豆素能夠通過調節氧化應激和細胞凋亡兩條途徑共同達到保護細胞的功效，為后續進一步探討前胡總香豆素對高糖導致HUVECs的保護機制提供了研究基礎。