當歸多糖通過Akt/GSK-3β通路增強Nrf2信號傳導對高糖誘導視網膜神經節細胞凋亡的抑制作用*

王艷新，賈冠美，曹 朗，曹順義，張士宏

（保定市第二中心醫院，河北 保定 072750）

糖尿病視網膜病變（diabetes retinopathy, DR）是臨床中糖尿病引起的常見并發癥之一，可引起患者視力損傷和失明[1]。視網膜神經節細胞（retinal ganglion cells, RGCs）是視神經的重要組成部分，高糖環境下誘導RGCs凋亡是DR病程進展的重要過程。RGCs的凋亡會引起視網膜毛細血管病變，致使患者失明[2-3]。因此亟需尋找安全有效、毒副作用低的治療藥物。當歸多糖是提取自中藥當歸的主要成分，具有抗氧化損傷、抗炎、降血糖、降血脂等藥理作用[4-5]，常用于治療視神經損傷。研究表明，當歸多糖可通過減少氧化應激反應，緩解青光眼大鼠視神經損傷癥狀，但其作用機制尚不明確[6-7]。因此，本研究擬通過高糖處理的大鼠RGCs建立高糖損傷模型，檢測當歸多糖對高糖損傷誘導的RGCs氧化應激狀態的改善作用及其對凋亡情況的影響，旨在為當歸多糖藥物開發及臨床治療DR提供參考依據。

1 材料

1.1 細胞 SD大鼠視網膜神經節細胞RGC-5購于中國科學院上海生科院細胞資源中心（BFN608006377）。

1.2 試劑 當歸多糖（純度≥98%，西安金萃坊植物技術開發有限公司，批號：20190517）；Nrf2信號通路抑制劑（ML385）（北京百奧萊博科技有限公司，批號：20211020）；MTT溶液（美國Sigma公司，批號：M2128）；DMSO（美國Sigma公司，批號：D2650）；丙二醛（malondialdehyde, MDA）ELISA試劑盒（批號：20200117）、超氧化物岐化酶（superoxide dismutase, SOD）ELISA試劑盒（批號：20191202）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）ELISA試劑盒（批號：20200109）均購自南京建成生物工程研究所；兔抗β-actin多克隆抗體（批號：#4970）、兔抗鼠凋亡蛋白B細胞淋巴瘤因子2（b-cell lymphoma factor 2, Bcl-2）多克隆抗體（批號：ab21726）、Bcl-2相關蛋白（bcl-2 related x protein, Bax）多克隆抗體（批號：ab32503）、Caspase-3（批號：ab184787）多克隆抗體、Caspase-9多克隆抗體（批號：ab182648）、山羊抗兔二抗IgG（批號：ab205718）均購自美國Cell Signaling公司；DMEM細胞培養基（批號：M4530）、胎牛血清（批號：F8687）、0.25%胰蛋白酶（批號：T4049）均購自美國Sigma公司。

1.3 主要儀器 SW-CJ2-1F型超凈工作臺（蘇州安泰技術有限公司）；BIOFUGE28RS型低溫高速離心機（德國HERAEUS公司）；7500型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

2 方法

2.1 MTT檢測細胞存活情況 待RGC-5細胞復蘇、傳代后，收集對數生長期細胞，采用MTT實驗檢測不同濃度當歸多糖對RGC-5細胞活力的影響。胰蛋白酶將細胞消化重懸，制備細胞濃度為1×104個/mL的細胞懸液，接種至96孔板中，每孔約100 μL細胞懸液。每孔分別給予0、25、50、100、200、400 μmol/L的當歸多糖處理細胞，放入37 ℃、含有5%CO2的細胞培養箱培養24h。取出細胞，吸去培養液，向各孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，繼續培養4h，再加入DMSO溶液150μL，溫和振蕩10 min。將96孔板置入酶標儀中于（OD）波長490 nm處檢測各孔吸光度值，實驗重復3次。細胞存活率（%）=OD實驗組/OD對照組×100%。

2.2 模型建立與分組 將RGC-5細胞常規培養于含有10%胎牛血清的普通DMEM細胞培養基內，置于37 ℃、含有5%CO2的細胞培養箱中，待細胞貼壁生長，生長密度達到80%時，取對數生長期細胞經胰蛋白酶消化重懸后用于實驗。在RGC-5細胞培養基內加入50 mmol/L葡萄糖建立高糖損傷模型[8-9]，然后分為高糖組、當歸多糖組和當歸多糖+ML385組，另設對照組。當歸多糖組使用100 μmol/L的當歸多糖處理，當歸多糖+ML385組使用100 μmol/L的當歸多糖聯合20 μmol/L的ML385處理，高糖組使用50 mmol/L葡萄糖處理，對照組加入等量完全培養基。

2.3 CCK-8法檢測細胞生長活力 收集對數生長期RGC-5細胞，胰蛋白酶消化重懸后接種于96孔板中，每孔中細胞約1×104個，各組細胞加入相應藥物進行干預后，置于37 ℃、含有5%CO2的恒溫培養箱中48 h，棄去培養液，每孔加入CCK-8溶液10 μL，再于37 ℃培養箱孵育3 h。將96孔板置入全自動酶標儀中于450 nm波長處檢測各孔吸光度值，計算細胞存活率。每組設置3個復孔，結果取平均數，實驗重復3次。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 收集對數生長期的RGC-5細胞，4 ℃預冷PBS溶液，使用預冷的PBS溶液重懸細胞制備細胞懸液，以每孔1×105個細胞接種于6孔板中，各組加入相應藥物干預48 h。棄去原培養液，PBS溶液清洗2次，每孔加入Annexin V-FITC液5 μL，避光孵育10 min，離心重懸細胞后加入PI染液5 μL，避光孵育5 min。使用流式細胞分析儀檢測各組細胞凋亡情況。

2.5 氧化應激水平檢測 取對數生長期細胞RGC-5進行實驗，各組加入相應藥物干預48 h后，用胰蛋白酶消化為細胞懸液，將細胞懸液濃度調整為5×105個/mL。提前取出ELISA試劑盒，待試劑盒平衡至室溫后開始實驗。使用ELISA法嚴格按照試劑盒說明書操作，檢測各組MDA、GSH-Px、SOD含量。使用酶標測定儀于450 nm波長處檢測OD值，根據標準曲線計算樣品濃度。

2.6 RT-PCR檢測Akt mRNA、GSK-3β mRNA、Nrf2 mRNA表達 取各組對數生長期RGC-5細胞，加入相應藥物干預48 h后棄去原培養液，加入適量TRIzol試劑裂解細胞，TRIzol沉淀法提取細胞總RNA，檢測各組細胞中蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）mRNA、糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3 β,GSK-3β）mRNA和核因子E2相關因子2（nuclear factor E2 and related factor 2, Nrf2）mRNA表達情況。紫外分光光度計檢測總RNA濃度并鑒定純度，反轉錄試劑盒合成cDNA。配制PCR反應液：2×PrimeScript Enzyme Mix10μL，cDNA樣品2 μL，上、下游引物各1 μL，RNase Free ddH2O 6 μL。反應程序設置為：94 ℃5 min，94 ℃30 s，59 ℃30 s，72 ℃30 s，共循環40次。反應結束后，根據測得樣品的循環閾值（CT值），以2-△△CT法計算目的基因與內參基因的相對表達量，比較各樣本之間基因表達差異。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 Western blotting檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達 取對數生長期RGC-5細胞進行實驗，各組加入相應藥物干預48 h后，TBS緩沖液清洗細胞2次，加入適當體積細胞蛋白提取劑與蛋白酶抑制劑，作用3 min，期間反復搖晃培養板，使液體與細胞充分接觸。收集上清液，BCA試劑盒測定蛋白樣品濃度。確定蛋白上樣量，配制電泳SDS-PAGE凝膠與緩沖液，灌膠后加入蛋白樣品，電泳至溴酚藍到達膠板下沿。準備好轉膜濾紙，300 mA轉至PVDF膜，加入含有脫脂牛奶的封閉液室溫孵育2 h，除去封閉液，加入1∶1 000稀釋一抗4 ℃孵育過夜；室溫下TBST清洗3次后加入1∶3 000稀釋二抗，搖床封閉2 h。滴加ECL混合液暗室中避光顯色，曝光系統進行顯影、定影，掃描膠片存檔，應用圖像分析軟件觀察并分析相應條帶。

2.8 統計學方法 使用SPSS 23.0統計學軟件分析數據，計量資料符合正態分布采用“均數±標準差”（x±s）表示，數據方差齊，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 當歸多糖對細胞活力的影響 MTT實驗結果顯示，不同濃度當歸多糖（0、25、50、100、200、400 μmol/L）作用于RGC-5細胞后，各組細胞存活率均明顯降低，且呈現濃度依賴性（P<0.05）。25、50、100、200、400 μmol/L當歸多糖組細胞存活率明顯低于0 μmol/L當歸多糖組（P<0.05）。當歸多糖作用于RGC-5細胞24 h的IC50約為100 μmol/L，所以后續實驗當歸多糖給藥濃度為100 μmol/L。（見表2）

表2 各組細胞存活率比較 （±s）

表2 各組細胞存活率比較 （±s）

注：與0 μmol/L當歸多糖組比較，aP<0.05；與25 μmol/L當歸多糖組比較，bP＜0.05；與50 μmol/L當歸多糖組比較，cP＜0.05；與100 μmol/L當歸多糖組比較，dP＜0.05；與200 μmol/L當歸多糖組比較，eP＜0.05。

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3.2 各組細胞活力比較 高糖組細胞活力低于對照組（P<0.05），當歸多糖組細胞活力高于高糖組（P<0.05），當歸多糖+ML385組細胞活力低于當歸多糖組（P<0.05）。（見表3）

表3 各組細胞活力比較 （±s）

表3 各組細胞活力比較 （±s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與高糖組比較，bP＜0.05；與當歸多糖組比較，cP＜0.05。

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3.3 各組細胞凋亡情況比較 高糖組細胞凋亡率高于對照組（P<0.05），當歸多糖組細胞凋亡率低于高糖組（P<0.05），當歸多糖+ML385組細胞凋亡率高于當歸多糖組（P<0.05）。（見表4、圖1）

圖1 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況

表4 各組細胞凋亡率比較 （±s）

表4 各組細胞凋亡率比較 （±s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與高糖組比較，bP＜0.05；與當歸多糖組比較，cP＜0.05。

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3.4 各組細胞氧化應激水平比較 高糖組細胞MDA含量高于對照組，GSH-Px、SOD含量低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）；當歸多糖組細胞MDA含量低于高糖組，GSH-Px、SOD含量高于高糖組，差異均有統計學意義（P<0.05）；當歸多糖+ML385組細胞MDA含量高于當歸多糖組，GSH-Px、SOD含量低于當歸多糖組，差異均有統計學意義（P<0.05）。（見表5）

表5 各組細胞氧化應激水平比較 （±s）

表5 各組細胞氧化應激水平比較 （±s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與高糖組比較，bP＜0.05；與當歸多糖組比較，cP＜0.05。

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3.5 各組細胞Akt mRNA、GSK-3β mRNA、Nrf2 mRNA相對表達量比較 高糖組細胞Akt mRNA、GSK-3β mRNA相對表達量高于對照組，Nrf2 mRNA相對表達量低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）；當歸多糖組細胞Akt mRNA、GSK-3β mRNA相對表達量低于高糖組，Nrf2 mRNA相對表達量高于高糖組，差異均有統計學意義（P<0.05）；當歸多糖+ML385組細胞Akt mRNA、GSK-3β mRNA相對表達量高于當歸多糖組，Nrf2 mRNA相對表達量低于當歸多糖組，差異均有統計學意義（P<0.05）。（見表6）

表6 各組細胞Akt mRNA、GSK-3β mRNA、Nrf2 mRNA相對表達量比較 （±s）

表6 各組細胞Akt mRNA、GSK-3β mRNA、Nrf2 mRNA相對表達量比較 （±s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與高糖組比較，bP＜0.05；與當歸多糖組比較，cP＜0.05。

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3.6 各組細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對表達量比較 高糖組細胞Bcl-2蛋白相對表達量低于對照組，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對表達量高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）；當歸多糖組細胞Bcl-2蛋白相對表達量高于高糖組，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對表達量低于高糖組，差異均有統計學意義（P<0.05）；當歸多糖+ML385組細胞Bcl-2蛋白相對表達量低于當歸多糖組，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對表達量高于當歸多糖組，差異均有統計學意義（P<0.05）。（見表7、圖2）

圖2 各組細胞凋亡蛋白表達Western blotting 圖

表7 各組細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9 蛋白相對表達量比較 （±s）

表7 各組細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9 蛋白相對表達量比較 （±s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與高糖組比較，bP＜0.05；與當歸多糖組比較，cP＜0.05。

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4 討論

DR的發病和進展過程是多細胞因子參與的過程；主要原因為神經細胞長期處于高糖微環境中，造成視網膜氧化應激嚴重，導致視網膜神經節細胞凋亡；其中信號傳導代謝酶、氧化應激因子、離子通道和炎癥因子均發揮著重要調控作用[10-11]。近年來，研究表明，在DR的發病過程中，RGCs凋亡的主要因素可通過影響細胞的氧化應激水平，調控RGCs的細胞凋亡信號通路控制凋亡相關基因表達，從而導致RGCs凋亡[12]。因此，研究RGCs的細胞凋亡機制，尋找作用靶點對DR臨床治療有著重大意義。

當歸多糖為中藥當歸的水溶提取物，可以改善機體造血功能，提高免疫力，具有較強的抗氧化作用[13-15]。研究表明，當歸多糖對視網膜缺血-再灌注的大鼠神經節細胞具有保護作用，能大幅度縮短視力恢復時間，提示當歸多糖對RGCs具有保護作用[16-17]。因此，本研究通過采用不同濃度當歸多糖處理體外培養的RGC-5細胞，探討當歸多糖對高糖誘導的RGC-5細胞凋亡的影響。結果顯示，在MTT實驗中，采用不同濃度的當歸多糖（0、25、50、100、200、400 μmol/L）作用于RGC-5細胞后，各組細胞存活率均明顯降低，且呈現濃度依賴性。當歸多糖作用于RGC-5細胞24 h的IC50約為100 μmol/L，所以后續實驗當歸多糖給藥濃度為100 μmol/L。當歸多糖組細胞活力明顯高于高糖組，且細胞凋亡率低于高糖組，而當歸多糖+ML385組細胞活力低于當歸多糖組，且細胞凋亡率高于當歸多糖組。表明當歸多糖能抑制高糖誘導的RGC-5細胞凋亡，對RGC-5細胞具有保護作用，而當歸多糖對RGC-5細胞的保護作用會受到Nrf2通路抑制劑的影響。

當歸多糖組細胞MDA含量低于高糖組，GSH-Px、SOD含量高于高糖組，而當歸多糖+ML385組細胞MDA含量高于當歸多糖組，GSH-Px、SOD含量低于當歸多糖組。表明當歸多糖能抑制RGC-5細胞內氧化應激水平，對RGC-5細胞具有保護作用，而當歸多糖對RGC-5細胞的保護作用會受到Nrf2通路抑制劑的影響。

Akt/GSK-3β信號通路在細胞的生長、增殖和分化過程中進行調控，是影響RGCs凋亡的典型信號通路[18-19]。當RGC-5細胞受到高糖環境的刺激時，異常的氧化應激水平可激活細胞質中靜息狀態的Akt[20]。Akt激活后與GSK-3β區域中相應受體結合，并從細胞膜轉移至細胞核中，由磷酸化作用激活或抑制其下游抗氧化元件Nrf2和凋亡/抑凋亡蛋白的表達水平（包括抑凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9），從而影響細胞的氧化應激反應與凋亡進程[21-22]。此外，Akt/GSK-3β信號通路還可參與細胞生命活動，如葡萄糖的轉運與蛋白質的合成[23]。在糖尿病的進一步發展過程中，持續的高糖環境會活化Akt/GSK-3β信號通路，進而引起多種細胞因子的合成與釋放，導致DR進一步惡化[24-25]。本研究結果表明，當歸多糖組Nrf2 mRNA相對表達量高于高糖組，Akt mRNA、GSK-3β mRNA相對表達量均低于高糖組；當歸多糖組Bcl-2蛋白相對表達量高于高糖組，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對表達量均低于高糖組。當歸多糖+ML385組Nrf2 mRNA相對表達量低于當歸多糖組，Akt mRNA、GSK-3β mRNA相對表達量均高于當歸多糖組；當歸多糖+ML385組Bcl-2蛋白相對表達量低于當歸多糖組，Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對表達量均高于當歸多糖組。表明當歸多糖能抑制高糖誘導的RGC-5細胞凋亡，對RGC-5細胞具有保護作用，然而在給予了Nrf2通路抑制劑后，當歸多糖的抑凋亡作用受到阻滯，表明當歸多糖對RGC-5細胞的保護作用會受到Nrf2通路抑制劑的影響。

綜上所述，當歸多糖對高糖誘導的RGC-5細胞凋亡有一定的抑制作用，能降低細胞內氧化應激水平，可能機制為阻滯Akt/GSK-3β通路，提高細胞內抗氧化Nrf2表達水平。