急性缺血性腦卒中患者血清LncRNA FOXD3-AS1水平與病情及預后的關系*

尹 波,田 虹,張艷芳,劉旭生,郭順紅,趙美群

華北石油管理局總醫院康復中醫科,河北滄州 062552

急性缺血性腦卒中(AIS)是一種腦血管病變,其起病急,易造成神經功能損傷,患者預后差[1-2]。因此,尋找與AIS發病有關的因素,并及時進行干預,對于改善AIS患者預后有積極意義。既往研究認為,AIS的發生發展與自噬、長鏈非編碼RNA(LncRNA)、氧化應激、凝血異常、炎癥等相關[3-4]。研究發現,LncRNA叉頭盒D3反義RNA1(LncRNA FOXD3-AS1)在AIS的腦缺血/再灌注模型中呈高表達,LncRNA FOXD3-AS1可能是治療AIS的潛在靶點[5]。但LncRNA FOXD3-AS1在AIS患者中的表達水平及其與AIS發生風險、嚴重程度、預后的關系尚不明確。因此,本研究通過測定LncRNA FOXD3-AS1在AIS患者血清中的水平,分析其與AIS發生風險、疾病嚴重程度、預后的關系,旨在為臨床診斷、評估AIS患者神經功能損傷程度及預測預后提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年6月至2022年3月于本院就診的AIS患者92例為AIS組,男54例,女38例;年齡47～76歲,平均(63.91±11.87)歲;按入院時美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)評分[6]將AIS患者分為輕度組(NIHSS評分≤4分,42例)、中重度組(NIHSS評分>4分,50例)。納入標準:(1)符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[7]中AIS判定標準,經MRI、CT證實;(2)首次發病,發病10 h內入院。排除標準:(1)合并痛風、急慢性感染者;(2)合并腦出血、腎功能不全者;(3)合并心源性栓塞、冠心病等心功能不全者;(4)合并動靜脈畸形、其他神經系統病變者;(5)合并血液類疾病、免疫系統疾病、腫瘤者;(6)失訪者。另納入同期本院體檢健康者92例為對照組,男51例,女41例;年齡47～76歲,平均(61.23±11.67)歲。收集所有受試者總膽固醇(TC)、血小板計數、舒張壓、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、吸煙史、甘油三酯(TG)、收縮壓、平均血小板體積、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、尿酸等資料。本研究獲得本院倫理委員會批準,受試者或其家屬簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標本收集 收集AIS患者入院后及體檢健康者體檢當日4～5 mL空腹外周靜脈血,靜置30 min,4 800 r/min離心5 min,分離血清,分裝,保存于-70 ℃低溫冰箱中待測。

1.2.2實時熒光定量PCR(qPCR)法測定血清LncRNA FOXD3-AS1水平 解凍血清,首先,以TRIzol試劑(批號15596018,北京同立海源生物科技有限公司)提取標本總RNA;利用反轉錄試劑(批號CDNA-200 rxn,美國Molecular Innovations公司)合成cDNA,應用qPCR試劑(批號QPK-201,日本TOYOBO公司)、qPCR儀(型號PikoReal,美國Thermo Scientific公司)擴增cDNA,收集檢測結果。qPCR儀參數:97.4 ℃ 8 min;96 ℃ 30 s,58.2 ℃ 20 s,62.4 ℃ 15 s,40個循環。LncRNA FOXD3-AS1檢測以β-actin為內參,其中β-actin上游引物序列為5′-ACCGAGCGCGGCTACAG-3′,下游引物序列為5′-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3′;LncRNA FOXD3-AS1上游引物序列為5′-GGTGGAGGAGGCGAGCATG-3′,下游引物序列為5′-AGCCGACAGACAGGGATTGG-3′。北京同立海源生物科技有限公司負責引物合成。以2-ΔΔCt法計算LncRNA FOXD3-AS1相對表達水平。

1.2.3酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平 按人TNF-α ELISA試劑盒(批號SEKH-0047,北京索萊寶科技有限公司)說明書配制TNF-α的標準樣品溶液,解凍血清,并在酶標儀(型號SAF-680T,上海巴玖實業有限公司)波長450 nm處,測定TNF-α標準品溶液及血清的吸光度,繪制TNF-α的標準回歸曲線,結合TNF-α的標準方程,計算血清TNF-α水平。

1.3隨訪 所有AIS患者出院后均隨訪3個月,利用改良Rankin量表(mRS)評分[8]對AIS患者進行生活能力評估,依據mRS評分將其分為預后良好組(mRS評分<3分,48例)、預后不良組(mRS評分≥3分,44例)。

2 結 果

2.1兩組臨床資料比較 與對照組比較,AIS組患者HDL-C水平降低(P<0.05),TG、尿酸水平升高(P<0.05);兩組性別、年齡、TC、血小板計數、舒張壓、吸煙史、收縮壓、平均血小板體積、LDL-C比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組臨床資料比較(n/n或

2.2兩組血清LncRNA FOXD3-AS1、TNF-α水平比較 與對照組比較,AIS組患者血清LncRNA FOXD3-AS1、TNF-α水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 兩組血清LncRNA FOXD3-AS1、TNF-α水平比較

2.3多因素Logistic回歸分析AIS發生的危險因素 以AIS是否發生為因變量,以TG、尿酸、HDL-C、LncRNA FOXD3-AS1、TNF-α為自變量,行多因素Logistic回歸分析,結果顯示,高水平TG、尿酸、LncRNA FOXD3-AS1、TNF-α是AIS發生的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 多因素Logistic回歸分析AIS發生的危險因素

2.4AIS患者血清LncRNA FOXD3-AS1、TNF-α水平與TG、尿酸的相關性分析 Pearson相關分析結果顯示,AIS患者血清LncRNA FOXD3-AS1、TNF-α水平與TG、尿酸均呈正相關(P<0.05),見表4;AIS患者血清LncRNA FOXD3-AS1水平與TNF-α呈正相關(r=0.586,P<0.001),見圖1。

圖1 AIS患者血清LncRNA FOXD3-AS1水平與TNF-α的相關性分析

表4 AIS患者血清LncRNA FOXD3-AS1、TNF-α水平與TG、尿酸的相關性

2.5血清LncRNA FOXD3-AS1水平與AIS發生風險的關系 以是否患AIS為因變量,以血清LncRNA FOXD3-AS1水平四分位數分組為自變量,血清LncRNA FOXD3-AS1四分位數分組采用啞變量處理,以血清LncRNA FOXD3-AS1第一分位數為參照組,進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示,隨血清LncRNA FOXD3-AS1水平升高,AIS發生風險的OR增加。見表5。

表5 血清LncRNA FOXD3-AS1水平與AIS發生風險的關系

2.6不同嚴重程度的AIS患者血清LncRNA FOXD3-AS1、TNF-α水平比較 與輕度組比較,中重度組AIS患者血清LncRNA FOXD3-AS1、TNF-α水平升高(P<0.05),見表6。

表6 不同嚴重程度的AIS患者血清LncRNA FOXD3-AS1、TNF-α水平比較

2.7不同預后的AIS患者血清LncRNA FOXD3-AS1、TNF-α水平比較 與預后良好組比較,預后不良組AIS患者血清LncRNA FOXD3-AS1、TNF-α水平升高(P<0.05),見表7。

表7 不同預后的AIS患者血清LncRNA FOXD3-AS1、TNF-α水平比較

3 討 論

AIS是一種神經功能缺損疾病,發生率逐年升高,發病機制復雜,若未能及時采取救治措施將導致偏癱,甚至死亡,嚴重威脅患者生活質量和生命安全[9]。因此,尋找與AIS病理變化相關,且可評估AIS患者病情嚴重程度及預后的指標,對及時制訂治療方案,提高AIS患者生存質量至關重要。

LncRNA是一類不能編碼蛋白質的RNA分子,可調控自噬,調節氧化應激,參與信號轉導,影響炎癥反應過程,與急性心肌梗死、AIS等病理發展等有關[10-12]。研究發現,敲低LncRNA FOXD3-AS1可通過上調miR-150-5p表達,進而抑制細胞凋亡,從而抑制缺氧誘導的心肌細胞損傷[13];另外,LncRNA FOXD3-AS1在心肌細胞缺血/再灌注軸中水平升高,其可能通過促進自噬,調節核因子-κB(NF-κB)信號通路進而加重心肌細胞缺血/再灌注損傷[14]。本研究中,AIS患者血清LncRNA FOXD3-AS1水平較高,提示LncRNA FOXD3-AS1可能與AIS發生發展相關,推測LncRNA FOXD3-AS1可能通過調節自噬、影響NF-κB信號通路進而影響AIS病變過程,但其機制仍需深入探討。此外,本研究顯示,高水平LncRNA FOXD3-AS1是影響AIS發生的獨立危險因素,且隨著血清LncRNA FOXD3-AS1水平升高,AIS發生風險隨之增加,臨床應及時監控患者血清LncRNA FOXD3-AS1水平,預防AIS發生。

AIS引發的神經缺損與AIS患者預后及高病死率關系密切[15-16]。本研究通過比較中重度組與輕度組AIS患者血清LncRNA FOXD3-AS1水平,結果顯示,中重度神經功能缺損患者血清LncRNA FOXD3-AS1水平較高,提示LncRNA FOXD3-AS1可能與AIS疾病嚴重程度相關,LncRNA FOXD3-AS1有望成為評估AIS患者神經功能缺損程度的輔助指標。進一步研究發現,預后不良的AIS患者血清LncRNA FOXD3-AS1水平高于預后良好者,提示LncRNA FOXD3-AS1可能與AIS患者預后密切相關,LncRNA FOXD3-AS1可作為判斷AIS患者預后的潛在指標。

AIS患者體內存在代謝異常,本研究AIS患者HDL-C水平降低,TG、尿酸水平升高,與李露露等[15]研究相符,且高水平TG、尿酸是AIS發生的獨立危險因素,提示AIS患者存在血脂、尿酸異常,臨床應及時監控TG、尿酸水平,防治AIS。進一步分析顯示,AIS患者血清LncRNA FOXD3-AS1水平與TG、尿酸均呈正相關,提示LncRNA FOXD3-AS1可能與血脂、尿酸共同影響AIS疾病進展。

TNF-α是一種炎癥因子,在缺血缺氧時,其水平升高,損傷神經細胞[17-18]。研究發現,TNF-α在AIS患者血清中水平升高,TNF-α可能在AIS發生發展中發揮促炎作用[19-20]。本研究中,AIS患者血清TNF-α水平升高,與步霄等[19]研究結果一致,且高水平TNF-α是AIS發生的獨立危險因素,AIS患者血清TNF-α水平與TG、尿酸呈正相關,提示TNF-α可能與TG、尿酸協同參與AIS病變過程。進一步研究顯示,中重度神經功能缺損患者血清TNF-α水平較高,且預后不良的AIS患者血清TNF-α水平高于預后良好者,表明TNF-α可能與AIS疾病嚴重程度及預后相關,測定血清TNF-α水平有助于評估AIS患者神經功能缺損程度及預后情況。此外,TONG等[14]研究認為,LncRNA FOXD3-AS1通過影響NF-κB信號通路,進而升高TNF-α水平,故本研究分析了AIS患者血清LncRNA FOXD3-AS1水平與TNF-α的相關性,結果顯示,LncRNA FOXD3-AS1水平與TNF-α呈正相關,提示LncRNA FOXD3-AS1可能與TNF-α共同影響AIS病變進程,推測LncRNA FOXD3-AS1通過調節NF-κB信號通路,進而促進TNF-α釋放,加強炎癥反應,從而在AIS中起促進作用,但其機制有待進一步探究。

綜上所述,LncRNA FOXD3-AS1在AIS患者血清中水平升高,與TNF-α呈正相關,其水平越高,AIS發生風險越高,且LncRNA FOXD3-AS1與AIS嚴重程度、預后密切相關。本研究為臨床診治AIS,評估AIS患者病情、預后提供了新靶點,但本研究未深入探討LncRNA FOXD3-AS1在AIS中的作用機制及其預測AIS患者預后的價值,且樣本量較少,后期將擴大樣本從多角度進行深入研究。