TIM-3、hPEBP4在多發性骨髓瘤患者BMCS中的水平及其與體內硼替佐米累積量的相關性研究*

韓東海,駢曉琴,申清云,張亞朋,高 大

內蒙古醫科大學附屬醫院血液內科,內蒙古呼和浩特 010050

多發性骨髓瘤多發于老年人群,為漿細胞惡性增生疾病[1]。該骨髓瘤是因大量單克隆惡性漿細胞增殖引發,貧血、腎功能損傷、骨痛等為其常見并發癥。多發性骨髓瘤的完全緩解率較低,患者復發率高,若不及時進行合理治療,對患者生命健康有一定威脅[2-3]。T細胞免疫球蛋白黏蛋白(TIM)-3為新型免疫負性調控因子,為TIM基因家族成員,在T輔助細胞與細胞毒性T細胞中表達而產生抑制信號,使其細胞發生凋亡[4]。研究顯示,TIM-3在多種腫瘤組織表面有表達,腫瘤組織浸潤T細胞表面致使TIM-3水平升高,且與腫瘤患者預后機體T細胞功能障礙有關。磷脂酰乙醇胺結合蛋白(PEBP)為天然抑制蛋白,能調節核因子-κB等通路,調節細胞增殖分化與凋亡過程[5]。研究顯示,PEBP4過度表達與肺癌、乳腺癌等發生和腫瘤細胞的放化療抵抗有一定關聯,目前關于其與多發性骨髓瘤的研究較少。目前治療多發性骨髓瘤的方式有化療、造血干細胞移植等,但均以化療為基礎,硼替佐米為蛋白酶體抑制劑,是根據蛋白質降解機制研發的雙肽基硼酸鹽衍生物,該藥為首個用于治療多發性骨髓瘤的抑制劑。硼替佐米在多發性骨髓瘤治療中具有顯著優越性,但關于其在體內累積量的相關研究較少[6]。本研究通過檢測多發性骨髓瘤體內硼替佐米不同積累量患者骨髓來源細胞(BMCs)中TIM-3、人磷脂酰乙醇胺結合蛋白4(hPEBP4)水平,分析TIM-3、hPEBP4表達與硼替佐米積累量的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年3月至2021年12月本院收治的126例多發性骨髓瘤患者為研究組,其中男71例,女55例;年齡為48～76歲,平均(62.48±10.06)歲。納入標準:符合《中國多發性骨髓瘤診治指南(2020年修訂)》標準[7],確診為多發性骨髓瘤,且經病理檢查確診為漿細胞瘤;初次治療患者;預生存期超過半年;患者簽署知情同意書。排除標準:存在化療禁忌證;有腦血管疾病;有自身免疫性疾病;對本研究藥物不耐受;肝腎功能不全;有精神疾病。同期選取30例骨質疏松患者為骨質疏松組,男17例,女13例;年齡為46～74歲,平均(58.69±10.03)歲。另選取于本院體檢的50例體檢健康者為對照組,其中男29例,女性21例;年齡為45～75歲,平均(59.64±9.88)歲。各組年齡、性別比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究通過醫院倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 儀器:高速離心機、流式細胞儀均購自美國貝克曼庫爾特公司;試劑:人淋巴細胞分離液(Ficoll)購自美國sigma公司,鼠抗人CD3、CD4、CD8單克隆抗體購自美國biolelgend公司,PE標記鼠抗人TIM-3單克隆抗體購自美國R&D公司,hPEBP4試劑盒購自武漢優爾生公司;藥物:注射用硼替佐米(國藥準字H20193175,規格3.5 mg)購自先聲藥業有限公司,地塞米松磷酸鈉注射液(國藥準字H53020670,規格1 mL∶5 mg)購自昆藥集團股份有限公司。

1.3TIM-3與hPEBP4檢測方法 采集受試者BMCs中骨髓液,提取其血清后冷凍保存。使用Ficoll密度梯度離心法將單核細胞從骨髓抽吸物中分離,放于顯微鏡下利用牛鮑氏計數板計數,并重懸在10%胎牛血清中使細胞終濃度至1×107/mL備用。分離單核細胞中留下的血清于液氮狀態下保存。用帶有熒光標記素的鼠抗人單克隆抗體檢測TIM-3在T細胞上的表達分子;避光下將以上抗體分離出的單核細胞染色并孵育,待抗原抗體孵育后用流式洗滌液洗滌,重懸于磷酸鹽緩沖液內。使用FlowJo軟件程序分析流式細胞術檢測的數據:CD3+CD4+TIM-3占CD3+CD4+T細胞百分比、CD3+CD8+TIM-3占CD3+CD8+T細胞百分比。采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清中hPEBP4水平,hPEBP4試劑盒來源于武漢優爾生公司,檢測步驟嚴格參照試劑盒說明書進行。

1.4硼替佐米化療 患者行以地塞米松為主的聯合化療,方法:第1、4、8、11天分別以1.3 mg/m2標準快速注射硼替佐米;在第1～4天、第9～12天靜注20 mg地塞米松,以3周為1療程,患者持續治療3療程。

2 結 果

2.13組TIM-3、hPEBP4水平比較 研究組CD3+CD4+TIM-3、CD3+CD8+TIM-3 T細胞百分比和hPEBP4水平高于骨質疏松組、對照組(P<0.05),見表1。

表1 3組TIM-3、hPEBP4水平比較

表2 低、高累積量組TIM-3、hPEBP4水平比較

2.2患者化療后體內硼替佐米累積量 經3個療程化療后,患者體內硼替佐米累積量為(21.86±4.28)mg/m2。以硼替佐米中位累積量21 mg/m2為臨界值[8],將累積量<21 mg/m2作為低累積量組,共54例;≥21 mg/m2作為高累積量組,共72例。

2.3低、高累積量組TIM-3、hPEBP4水平比較 高累積量組CD3+CD4+TIM-3、CD3+CD8+TIM-3 T細胞百分比和hPEBP4水平低于低累積量組(P<0.05),見表1。

2.4患者TIM-3、hPEBP4水平與體內硼替佐米累積量的相關性 經Pearson相關分析結果顯示,TIM-3、hPEBP4水平與體內硼替佐米累積量呈負相關(P<0.05)。見表3。

表3 患者TIM-3、hPEBP4水平與體內硼替佐米累積量的相關性

3 討 論

多發性骨髓瘤的發病機制復雜,目前臨床尚無根治該病的方法,化療為其主要治療手段。VAD化療方案(長春新堿+表柔比星+地塞米松)對癌細胞具有較強的殺傷力,但難以有效延長生存期限[9-10]。隨著硼替佐米的上市,為多發性骨髓瘤治療提供了新思路,該藥物對多種類型腫瘤細胞的毒性較強,對多發性骨髓瘤治療有確切療效,能提高患者完全緩解率[11]。硼替佐米屬于硼酸二肽衍生物,是一種人工合成的靶向藥物,能降低細胞因子水平,可逆性結合26S蛋白酶體以抑制其活性,能阻斷細胞中大多蛋白降解途徑,誘導癌細胞凋亡以發揮抑制癌細胞擴散與生長作用[12-13]。

TIM-3為免疫負性調控因子,該物質在細胞免疫調節與腫瘤免疫逃逸等過程中有重要作用,是目前臨床中研究的熱點因子[14]。該因子均表達于T細胞表面,與其配體相互作用,使T細胞發生負性調控活化,共同作用后對腫瘤發生具有促進作用[15]。不同血液系統腫瘤中以免疫檢查點變化為基礎的免疫抑制具有明顯差異,其中以TIM-3變化最為顯著。本研究中多發性骨髓瘤患者體內CD3+CD4+TIM-3、CD3+CD8+TIM-3 T細胞百分比高于骨質疏松組、對照組,提示TIM-3參與多發性骨髓瘤的發生。TIM-3高表達可抑制多發性骨髓瘤患者T細胞功能,經化療后患者體內硼替佐米累積量越高,其體內TIM-3水平越低。hPEBP4為磷脂酰乙醇胺下游物質,可連接糖脂代謝和細胞凋亡、信號轉導[16]。鈣蛋白最早發現于牛大腦中,是在進化上較為保守的蛋白分子,對膜成分磷脂酰乙醇胺具有較強的親和力。hPEBP4為新型腫瘤抗凋亡分子,在乳腺癌、肺癌等多腫瘤中高表達,可參與癌癥發生發展[17]。本研究中多發性骨髓瘤患者hPEBP4水平高于對照組,證實該蛋白可在多發性骨髓瘤發展中發揮作用;化療后患者體內硼替佐米累積量越高者hPEBP4水平越低。將硼替佐米累積量進行相關性分析,結果顯示TIM-3、hPEBP4水平表達與其呈負相關,表明通過監測體內硼替佐米累積量和TIM-3、hPEBP4水平對臨床療效評估具有促進作用,可為下一步治療提供依據[18]。由于本研究的樣本量相對較少,結果可能有偏差,后續需進一步擴大樣本再次研究。

綜上所述,在多發性骨髓瘤患者BMCs中TIM-3、hPEBP4水平相對于健康人群較高,經硼替佐米化療后,藥物在其體內逐漸積累,且TIM-3、hPEBP4水平與硼替佐米積累量呈負相關,臨床可通過監測體內TIM-3、hPEBP4水平以評估治療效果。