乳腺癌組織miR-10a-5p、HOXB3水平對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值*

張京力,高建朝,張志生,李曉霞,王展海,馮志林,周海豐,梁晚平

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院乳腺外科,河北張家口 075000

作為女性常見的惡性腫瘤,乳腺癌具有高轉(zhuǎn)移率和死亡率的特點(diǎn)[1]。其治療方法包括手術(shù)切除、放療和化療[2-3]。雖然取得了一定的療效,但乳腺癌患者的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍然較高,導(dǎo)致患者普遍預(yù)后不良[4]。因此,尋找可靠的指標(biāo)用來判斷患者預(yù)后情況對(duì)乳腺癌具有重要意義。目前研究表明微小RNA(miRNA)參與乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展,可作為乳腺癌診斷、預(yù)后及治療的潛在生物標(biāo)志物[5-6]。miR-10家族位于同源異型盒基因(HOX)簇內(nèi),miR-10a-5p是miR-10家族的成員,可以調(diào)節(jié)許多炎癥相關(guān)疾病中的細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子[7]。有研究表明其在多種腫瘤中也存在異常表達(dá),李?yuàn)u等[8]發(fā)現(xiàn)miR-10a-5p在宮頸癌細(xì)胞中水平降低。HOXB3是HOXB家族成員,該家族主要調(diào)控細(xì)胞分化和增殖,參與胚胎的發(fā)生發(fā)育過程[9]。根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,miR-10a-5p和HOXB3存在靶向結(jié)合關(guān)系[7]。但尚未見二者在乳腺癌中的表達(dá)關(guān)系研究。基于此,本研究擬通過檢測(cè)乳腺癌組織中miR-10a-5p和HOXB3的表達(dá)情況,分析二者與患者預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2017年5月于本院就診的75例乳腺癌患者,均為女性,年齡38～69歲,平均(50.45±5.81)歲;絕經(jīng)35例,未絕經(jīng)40例;腫瘤部位:外上象限26例,其他象限49例;腫瘤分化程度:低分化32例,高、中分化43例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例;TNM分期[10]:Ⅰ+Ⅱ期47例,Ⅲ+Ⅳ期28例;分子分型:Luminal A 22例,Luminal B 22例,人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)陽性13例,三陰性乳腺癌18例;腫瘤最大徑:<2 cm 36例,≥2 cm 39例。收集術(shù)中患者的乳腺癌組織及癌旁正常組織。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[10],經(jīng)手術(shù)病理檢查確診為乳腺癌;(2)均為初診患者;(3)所有患者均未接受過放療、化療或手術(shù)前的任何其他治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他惡性腫瘤;(2)合并其他感染性疾病;(3)臨床資料不完整。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過,所有標(biāo)本采集均取得受試者知情同意。

1.2儀器與試劑 TRIzol試劑(批號(hào)BL10523)、兔源HOXB3單克隆抗體(批號(hào)BL19172)、β-actin抗體(批號(hào)BL19241)、羊抗兔二抗(批號(hào)BL14138)購自廣州奧然科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄酶(批號(hào)zk3924)、蛋白裂解液(批號(hào)zk3013)、PCR試劑盒(批號(hào)zk36127)購自深圳子科生物科技有限公司;熒光定量PCR儀(型號(hào)Cycler510)、顯微鏡(型號(hào)650TFL)、凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào)EL-5200)購自上海金穗生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)乳腺癌組織及癌旁正常組織中miR-10a-5p水平 使用TRIzol試劑從乳腺癌組織及癌旁正常組織中提取總RNA,隨后,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,將cDNA作為RNA擴(kuò)增的模板,使用qPCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序如下:95 ℃ 5 min,然后95 ℃ 15 s,60 ℃ 3 s,最后72 ℃ 30 s,37個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt方法對(duì)miR-10a-5p水平進(jìn)行定量分析。miR-10a-5p及內(nèi)參引物序列見表1。引物由深圳子科生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。

表1 引物序列

1.3.2免疫組織化學(xué)染色觀察乳腺癌組織及癌旁正常組織中HOXB3表達(dá) 將乳腺癌組織及癌旁正常組織病理切片于60 ℃烘烤1 h,二甲苯脫蠟,使用梯度乙醇溶液洗脫。加入0.3%過氧化氫封閉,然后進(jìn)行抗原修復(fù),磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次。將切片與兔源HOXB3單克隆抗體(1∶150稀釋)在37 ℃孵育12 h,隨后加入羊抗兔二抗(1∶1 800稀釋)孵育50 min,然后在PBS中洗滌3次,每次3 min。二氨基聯(lián)苯胺染色,蘇木精復(fù)染,脫水,透明,封片。

在光學(xué)顯微鏡下觀察HOXB3表達(dá),染色強(qiáng)度評(píng)分:0分(無)、1分(弱)、2分(中等)、3分(強(qiáng))。陽性染色腫瘤細(xì)胞百分比評(píng)分:0分(0%～<6%)、1分(6%～<26%)、2分(26%～<51%)、3分(51%～<76%)、4分(76%～100%)。最終評(píng)分通過染色強(qiáng)度評(píng)分和陽性染色腫瘤細(xì)胞百分比評(píng)分相乘獲得(0～12分)。當(dāng)評(píng)分為0分時(shí),HOXB3表達(dá)為陰性,當(dāng)評(píng)分為1～12分時(shí),HOXB3表達(dá)為陽性。0～4分判定為HOXB3低表達(dá),5～12分判定為HOXB3高表達(dá)。

1.3.3蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)乳腺癌組織及癌旁正常組織中HOXB3水平 蛋白質(zhì)裂解液提取乳腺癌組織及癌旁正常組織中總蛋白,將蛋白進(jìn)行定量,取適量蛋白質(zhì)樣品電泳分離,然后轉(zhuǎn)膜,膜用5%脫脂牛奶封閉2 h,并與兔源HOXB3單克隆抗體(1∶400稀釋)和β-actin內(nèi)參抗體(1∶1 000稀釋)在4 ℃下孵育過夜。之后,去除一抗,再用TBST洗膜3次。最后,將膜與羊抗兔二抗(1∶1 800稀釋)在室溫下溫育2 h。然后顯色,目的蛋白/內(nèi)參蛋白灰度值作為相對(duì)表達(dá)水平。

1.4預(yù)后隨訪 所有患者自術(shù)后開始門診或者電話定期隨訪5年,觀察患者生存情況,隨訪截止時(shí)間為2022年5月31日或患者5年內(nèi)死亡日期。5年內(nèi)乳腺癌患者生存59例(生存組)為預(yù)后良好,死亡16例(死亡組)為預(yù)后不良,無失訪患者。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌組織和癌旁正常組織miR-10a-5p、HOXB3水平比較 乳腺癌組織miR-10a-5p水平低于癌旁正常組織,HOXB3高表達(dá)比例和HOXB3水平均高于癌旁正常組織(P<0.05),見圖1、2,表2。

圖2 乳腺癌組織和癌旁正常組織HOXB3水平蛋白質(zhì)印跡圖

表2 乳腺癌組織和癌旁正常組織miR-10a-5p、HOXB3水平比較或n(%)]

2.2乳腺癌組織miR-10a-5p、HOXB3水平的相關(guān)性分析 乳腺癌組織miR-10a-5p水平與HOXB3呈負(fù)相關(guān)(r=-0.346,P<0.001),相關(guān)方程為Y=0.93-0.50×X,見圖3。

圖3 乳腺癌組織miR-10a-5p、HOXB3水平相關(guān)性分析

2.3生存組和死亡組患者一般資料比較 生存組和死亡組年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤部位、分子分型、腫瘤最大徑比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與生存組比較,死亡組低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期患者比例均較高(P<0.05)。見表3。

表3 生存組和死亡組患者一般資料比較

2.4生存組和死亡組乳腺癌組織miR-10a-5p、HOXB3水平比較 死亡組乳腺癌組織miR-10a-5p水平低于生存組,HOXB3高表達(dá)比例和HOXB3水平均高于生存組(P<0.05),見表4。

表4 生存組和死亡組乳腺癌組織miR-10a-5p、HOXB3水平比較或n(%)]

2.5乳腺癌組織miR-10a-5p、HOXB3水平對(duì)患者5年內(nèi)死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線結(jié)果顯示,乳腺癌組織miR-10a-5p、HOXB3、二者聯(lián)合預(yù)測(cè)患者5年內(nèi)死亡的AUC分別為0.881、0.836、0.948;二者聯(lián)合檢測(cè)的AUC優(yōu)于miR-10a-5p、HOXB3單獨(dú)檢測(cè)的AUC(Z=2.064、2.052,P=0.039、0.040)。見表5。

表5 乳腺癌組織miR-10a-5p、HOXB3水平對(duì)患者5年內(nèi)死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值

2.6影響乳腺癌患者5年內(nèi)死亡的因素分析 單因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、miR-10a-5p、HOXB3均與乳腺癌患者5年內(nèi)死亡有關(guān)(P<0.05)。以乳腺癌患者5年內(nèi)是否死亡(死亡為1,存活為0)作為因變量,以腫瘤分化程度(低分化為1,高、中分化為0)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(是為1,否為0)、TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期為1,Ⅰ+Ⅱ期為0)、miR-10a-5p[miR-10a-5p低水平(<0.40)為1,miR-10a-5p高水平(≥0.40)為0]、HOXB3[HOXB3高水平(≥0.75)為1,HOXB3低水平(<0.75)為0]為自變量,進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示腫瘤分化程度低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、miR-10a-5p低水平、HOXB3高水平均是影響乳腺癌患者5年內(nèi)死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見表6、7。

表6 影響乳腺癌患者5年內(nèi)死亡的單因素分析

表7 影響乳腺癌患者5年內(nèi)死亡的多因素分析

3 討 論

在全球范圍內(nèi),每年有多達(dá)140萬例患者被診斷出患有乳腺癌[11-12]。目前,乳腺癌的治療方法除化療外還包括手術(shù)治療、內(nèi)分泌治療、靶向治療和聯(lián)合治療[13]。盡管乳腺癌的治療取得了重大進(jìn)展,但乳腺癌患者的臨床預(yù)后仍然很差。因此,需要選擇更加有效、可靠的指標(biāo)評(píng)估乳腺癌預(yù)后。

乳腺癌的發(fā)生、局部侵襲或轉(zhuǎn)移涉及多種基因的失調(diào)、突變和表觀遺傳機(jī)制。失調(diào)的基因包括編碼RNA和非編碼RNA,例如miRNA[14]。miRNA能夠通過靶向mRNA的互補(bǔ)區(qū)域,抑制蛋白質(zhì)翻譯來沉默基因表達(dá),這在正常和異常生物過程(包括癌癥)中至關(guān)重要。目前已經(jīng)在乳腺癌中觀察到miRNA的失調(diào),并且與腫瘤生長(zhǎng)、耐藥性和轉(zhuǎn)移有關(guān)[15]。相關(guān)研究顯示miR-10a-5p在多種腫瘤中異常表達(dá),且在不同腫瘤類型中表達(dá)水平具有一定的腫瘤異質(zhì)性[16-17]。有研究表明,miR-10a-5p在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)降低,上調(diào)miR-10a-5p表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞存活和侵襲[18]。在本研究中,乳腺癌組織中miR-10a-5p水平較癌旁正常組織降低,死亡組乳腺癌組織miR-10a-5p水平較生存組降低,提示miR-10a-5p可能參與調(diào)控乳腺癌的發(fā)生,有可能作為評(píng)估乳腺癌預(yù)后不良的潛在生物學(xué)指標(biāo);ROC曲線結(jié)果也進(jìn)一步表明miR-10a-5p可作為預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后不良的指標(biāo)。

同源盒基因是在胚胎發(fā)生和正常發(fā)育過程中編碼轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)基因,在這些基因中它們調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和增殖[19]。其中HOX基因家族,由39個(gè)基因組成,這些基因被細(xì)分為4組:A、B、C和D。據(jù)報(bào)道,HOX基因與腫瘤進(jìn)展有關(guān)[20]。已有研究證明HOXB3在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)可以誘導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞表型形成[21]。在本研究中,乳腺癌組織HOXB3高表達(dá)比例和HOXB3水平與癌旁正常組織比較明顯升高,提示HOXB3可能發(fā)揮了促癌基因的作用,參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)死亡組乳腺癌組織HOXB3高表達(dá)比例和HOXB3水平較生存組高,提示HOXB3表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后不良密切相關(guān);Spearman相關(guān)分析結(jié)果得到乳腺癌組織miR-10a-5p和HOXB3水平呈負(fù)相關(guān),提示miR-10a-5p和HOXB3之間存在某種分子機(jī)制共同調(diào)控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。ROC曲線結(jié)果顯示,乳腺癌組織miR-10a-5p、HOXB3聯(lián)合預(yù)測(cè)乳腺癌患者5年內(nèi)死亡的AUC優(yōu)于miR-10a-5p、HOXB3單獨(dú)預(yù)測(cè)的AUC,提示聯(lián)合檢測(cè)可作為預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后不良的指標(biāo)。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)腫瘤分化程度低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、miR-10a-5p低水平、HOXB3高水平均是影響乳腺癌患者5年內(nèi)死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示乳腺癌組織中HOXB3高表達(dá)、miR-10a-5p低表達(dá)的患者,應(yīng)該在術(shù)后給予更嚴(yán)密的隨訪觀察,必要時(shí)給予輔助治療,改善患者預(yù)后。

綜上所述,miR-10a-5p在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào),HOXB3表達(dá)上調(diào),二者在乳腺癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。miR-10a-5p和HOXB3均是影響乳腺癌生存狀況的危險(xiǎn)因素,聯(lián)合檢測(cè)可有效預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后。