長期抑制泛素羧基末端水解酶L1在自發性高血壓大鼠視網膜病變中的作用及其機制研究

杜安杰,孫松林,翟俊濤

運城市中心醫院/山西醫科大學附屬運城醫院第八臨床醫學院眼科,山西運城 044000

高血壓視網膜病變(HR)是指繼發于原發性高血壓的視網膜損傷,在高血壓患者中的發生率高達70%以上,目前臨床尚缺乏特效療法[1]。泛素-蛋白酶體系統是真核細胞中關鍵的蛋白降解途徑,參與調節細胞增殖、信號轉導、炎癥等多種生理過程[2]。泛素羧基末端水解酶L1(UCHL1)作為其中主要的去泛素酶,可特異性引起靶蛋白去泛素化以減少其降解,調節蛋白穩態。據報道,UCHL1與高血壓和心血管疾病的發生發展密切相關,抑制UCHL1可降低血管緊張素Ⅱ誘導的血壓升高和炎癥細胞浸潤[3],并改善自發性高血壓(SHR)大鼠的心臟肥大和功能障礙[4]。提示UCHL1可介導高血壓個體靶器官損傷,然而其在HR中的作用仍不清楚。最近研究發現,SHR大鼠成年后即可表現出視網膜毛細血管閉塞及黃斑水腫等高血壓視網膜病理損傷[5]。因此,本研究給予SHR大鼠UCHL1抑制劑LDN57444處理,以確定UCHL1在HR中的作用和潛在機制。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級1個月齡京都維斯特(WKY)和SHR雄性大鼠各16只,體重230～280 g,均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證號:SYXK(京)2021-0010。飼養條件:(23±2)℃恒溫環境,12 h光照/黑暗周期,自由飲食。

1.2儀器與試劑 LDN57444(Selleck,美國);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(索萊寶,中國);抗UCHL1抗體(Santa Cruz,美國);二氫乙錠(DHE)染色試劑盒(Sigma,美國);抗磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化人核轉錄因子-κB(p-NF-κB)、磷酸化κB抑制蛋白激酶α/β(p-IKKα/β)、缺氧誘導因子1α(HIF-1α)抗體(CST,美國);抗血管內皮生長因子(VEGF)抗體(Invitrogen,美國)。

1.3方法

1.3.1實驗分組及給藥 所有大鼠隨機分為WKY對照組、WKY+LDN57444組、SHR對照組和SHR+LDN57444組,每組8只。待2個月齡時給予WKY+LDN57444組、SHR+LDN57444組大鼠灌胃給藥LDN57444[20 μg/(kg·d)],WYK、SHR對照組給予等量玉米油,持續4個月。

1.3.2血壓測量 各組大鼠自1個月齡起,每周使用無創尾套法(Softron,日本)測量血壓和心率,直至6個月齡實驗結束。每只大鼠至少測量5次,以平均值作為其最終血壓和心率值。

1.3.3視網膜組織結構分析 大鼠眼球標本在4%多聚甲醛固定48 h后,經脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋,5 μm厚度切片備用。按照HE染色試劑盒說明書步驟進行常規染色。每只大鼠隨機選取4個相距至少60 μm的切片,400倍光鏡下拍照記錄。

1.3.4DHE熒光法檢測視網膜氧化應激水平 參考文獻[6]方法,取大鼠視網膜組織制備冷凍切片,采用DHE在37 ℃下孵育(5 μm)30 min。BX53熒光顯微鏡觀察并隨機選取5張圖像拍照記錄,用Image J 6.0軟件量化熒光強度。

1.3.5同工凝集素(Isolectin B4)/DAPI染色檢測視網膜內皮細胞增殖情況 冷凍切片制備方法同上,用Dylight 594標記的Griffonia Simplicifolia Lectin Ⅰ Isolectin B4在4 ℃下透化12 h,并用DAPI室溫下孵育5 min。BX53熒光顯微鏡獲取圖像,Image J 6.0軟件量化熒光強度。

1.3.6實時熒光定量PCR(qPCR)檢測 采用qPCR檢測視網膜組織UCHL1、炎癥因子[白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]和活性氧(ROS)生成相關基因[還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)1、NOX2、NOX4]mRNA水平 麻醉處死大鼠,摘除眼球并分離左眼視網膜,TRIzol一步法提取總RNA。采用ULtraRT one step qPCR Kit試劑盒將RNA反轉錄為cDNA,并以其為模板進行PCR擴增,反應體系及條件為:2×ULtraRT one step Buffer 12.5 μL、RNA 1 μg、上下游引物各1 μL、ULtraRT one step EnzymeMix 0.5 μL和無RNA酶的雙蒸水補足25 μL。反應程序:45 ℃反轉錄30 min;預變性95 ℃ 2 min;變性94 ℃ 30 s,退火65 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,共40個循環;延伸72 ℃ 5 min。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.3.7蛋白質印跡法(Western blott)檢測視網膜組織UCHL1、p-AKT、p-NF-κB、p-IKKα/β、HIF-1α、VEGF蛋白表達 利用組織勻漿器對視網膜組織標本進行勻漿,離心分離后取上清液提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度。蛋白煮沸變性后,應用十二烷基酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠對40 μg總蛋白進行電泳,以電濕轉的方式將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上。置于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h,分別用抗p-AKT(1∶1 000)、p-NF-κB(1∶1 000)、p-IKKα/β(1∶1 000)、HIF-1α(1∶500)、VEGF(1∶300)抗體4 ℃孵育過夜,TBST清洗3次后,熒光二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h。采用ECL化學發光法顯示蛋白條帶,Image-Pro Plus6.0進行灰度分析。

2 結 果

2.1各組大鼠視網膜UCHL1水平比較 1個月齡時,SHR對照組和WKY對照組大鼠視網膜UCHL1 mRNA和蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05)。2、6個月齡時,與WKY對照組比較,SHR對照組大鼠視網膜UCHL1水平明顯升高(P<0.05)。見圖1。

注:A為Western blot檢測WKY對照組和SHR對照組大鼠在1、2、6個月齡時視網膜的UCHL1蛋白水平;B為UCHL1蛋白水平定量統計結果;C為qPCR檢測UCHL1的mRNA水平;與WKY對照組大鼠比較,aP<0.05。圖1 各組大鼠視網膜UCHL1水平比較

2.2各組大鼠血壓比較 與WKY對照組比較,SHR對照組大鼠收縮壓從2個月齡開始逐漸升高(P<0.05);與SHR對照組比較,SHR+LDN57444組大鼠收縮壓明顯降低(P<0.05),但未恢復至WKY對照組大鼠的血壓水平。而WKY對照組和WKY+LDN57444組大鼠的收縮壓差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

注:與WKY對照組比較,aP<0.05;與SHR對照組比較,bP<0.05。圖2 各組大鼠血壓比較

2.3各組大鼠視網膜形態學比較 HE染色結果顯示,兩組WKY大鼠視網膜組織完整,結構清晰;SHR對照組大鼠視網膜神經節細胞層排布疏松并出現腫脹,中央視網膜的厚度明顯增加,特別是內網狀層(IPL)、內核層(INL)和外網狀層(OPL);而SHR+LDN57444組大鼠視網膜厚度較SHR對照組明顯減少,結構相對規整(P<0.05)。見圖3。

注:A為HE染色圖;B為視網膜中央厚度統計結果;與WKY對照組比較,aP<0.05;與SHR對照組比較,bP<0.05;GCL為神經節細胞層;ONL為外核層;RPE為視網膜色素上皮。圖3 各組大鼠視網膜形態學比較

2.4各組大鼠視網膜氧化應激水平比較 與WKY對照組比較,SHR對照組大鼠視網膜ROS水平升高(P<0.05);與SHR對照組比較,SHR+LDN54777組大鼠視網膜組織ROS水平降低(P<0.05),這些差異主要在INL以上觀察到。WKY對照組和WKY+LDN57444組大鼠視網膜ROS水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

注:A為DHE染色圖;B為ROS熒光強度量化圖;與WKY對照組比較,aP<0.05;與SHR對照組比較,bP<0.05。圖4 各組大鼠視網膜氧化應激水平比較

2.5各組大鼠視網膜內皮細胞增殖情況比較 Isolectin B4/DAPI染色結果顯示,與WKY對照組比較,SHR對照組大鼠視網膜內皮細胞Isolectin B4熒光強度明顯升高(P<0.05);與SHR對照組比較,SHR+LDN57444組大鼠視網膜內皮細胞熒光強度明顯降低(P<0.05)。WKY對照組和WKY+LDN57444組大鼠視網膜內皮細胞Isolectin B4熒光強度差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

注:A為中央視網膜切片Isolectin B4(紅色)染色;B為染色定量圖;細胞核用DAPI(藍色)反染;與WKY對照組比較,aP<0.05;與SHR對照組比較,bP<0.05。圖5 各組大鼠視網膜內皮細胞增殖情況比較

2.6各組大鼠視網膜IL-1β、IL-6、TNF-α、NOX1、NOX2、NOX4 mRNA水平比較 qPCR結果表明,與WKY對照組比較,SHR對照組大鼠視網膜IL-1β、IL-6、TNF-α、NOX1、NOX2、NOX4 mRNA水平均明顯升高(P<0.05)。與SHR對照組比較,SHR+LDN5477組大鼠視網膜中上述各指標水平均明顯降低(P<0.05)。WKY對照組和WKY+LDN57444組大鼠視網膜上述各指標水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖6。

注:A為qPCR分析IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平;B為qPCR分析NOX1、NOX2、NOX4 mRNA水平;與WKY對照組比較,aP<0.05;與SHR對照組比較,bP<0.05。圖6 各組大鼠視網膜IL-1β、IL-6、TNF-α、NOX1、NOX2、NOX4 mRNA水平比較

2.7各組大鼠視網膜p-AKT、p-IKKα/β、p-NF-κB、HIF-1α、VEGF水平比較 Western blot結果顯示,與WKY對照組比較,SHR對照組大鼠視網膜p-AKT、p-IKKα/β、p-NF-κB、HIF-1α、VEGF蛋白水平明顯升高(P<0.05);與SHR對照組比較,SHR+LDN54777組大鼠視網膜p-AKT、p-IKKα/β、p-NF-κB、HIF-1α、VEGF蛋白水平降低(P<0.05);WKY對照組和WKY+LDN57444組大鼠視網膜上述指標蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖7。

注:A為Western blot檢測6個月齡各組大鼠視網膜p-AKT、p-IKKα/β、p-NF-κB、HIF-1α、VEGF蛋白水平;B為各蛋白定量圖;GAPDH用作內參對照;與WKY對照組比較,aP<0.05;與SHR對照組比較,bP<0.05。圖7 各組大鼠視網膜p-AKT、p-IKKα/β、p-NF-κB、HIF-1α、VEGF水平比較

3 討 論

HR是由高血壓引起的常見微血管病變并發癥,因血壓持續升高而造成視網膜病理重塑,導致視網膜水腫、出血、缺血或滲出等病變[7]。HR不僅能反映心臟、大腦、腎臟等全身血管和器官的病理程度,也是導致視力下降甚至失明的主要原因[8]。因此,迫切需要深入了解HR的發病機制,探索抑制HR進展的新型分子靶點,以改善高血壓患者預后。

泛素-蛋白酶體系統在高血壓相關疾病中發揮關鍵作用[9]。作為主要的去泛素化酶之一,UCHL1具有多種生物學功能,并與神經退行性疾病、癌癥、心血管疾病和視網膜病變有關[10]。研究發現,UCHL1在壓力負荷過載和血管緊張素Ⅱ誘導的小鼠心肌細胞中水平升高,并與心肌損傷程度呈正相關[11],但在糖尿病大鼠的視網膜中表達減少[12]。然而,UCHL1在HR中的研究報道較少。LDN54777是一種可逆的競爭性UCHL1水解酶活性抑制劑,其選擇性阻斷UCHL1活性已被證實可延緩阿爾茨海默病的進展,抑制癌癥侵襲,并改善心臟肥大和功能障礙[13]。最新研究發現,SHR大鼠在2個月齡時開始表現出輕度高血壓,但對靶器官沒有明顯損傷;隨著血壓持續升高,在6個月齡即可顯示出高血壓視網膜的病理損傷[5]。因此,本研究選用SHR大鼠作為HR的動物模型,以探究UCHL1對HR的作用及潛在的分子機制。本研究結果顯示,SHR大鼠從2個月齡開始,視網膜中UCHL1的mRNA和蛋白水平升高。此外,SHR大鼠的收縮壓、中央視網膜厚度、炎癥和超氧化物產生均較WKY大鼠升高,其機制與UCHL1水平有關。相比之下,每日給予2、6個月齡SHR大鼠LDN54777治療明顯減弱了這些影響。以上結果表明,UCHL1可作為HR嚴重程度的標志物,其水平升高是HR發病機制中的一個重要因素,抑制UCHL1的表達可以防止HR的發展,UCHL1是治療HR的潛在治療靶點。

雖然血壓升高是HR的主要原因,但它不能完全解釋其發病機制。HR的其他重要機制包括氧化應激、慢性炎癥、內皮功能障礙和高血壓/血管緊張素Ⅱ誘導的血管重塑等[14]。研究發現,IL-1β水平升高可引發脈絡膜退化,導致外層視網膜嚴重缺氧[15]。此外,IL-1β、IL-6、TNF-α在免疫激活和炎癥反應中共同發揮調節作用,參與血管緊張素Ⅱ誘導的視網膜中NOX和VEGF的激活,間接刺激視網膜血管新生,增加視網膜內皮細胞的通透性[16]。ROS是生物系統中普遍存在的信號分子,在促進炎癥、內皮細胞增殖和遷移及新生血管的形成方面發揮關鍵作用[17]。NOX酶家族(NOX1、NOX2和NOX4)作為視網膜血管內皮細胞中ROS的主要來源,可引起內皮細胞功能紊亂,從而導致視網膜形態學變化和功能障礙。本研究結果顯示,6個月齡SHR大鼠視網膜中促炎癥細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)和NOX1、NOX2、NOX4水平較WKY大鼠均升高,并提高了視網膜內皮細胞增殖能力,這與以往的研究結果一致[18]。此外,本研究發現,與SHR對照組比較,接受LDN54777處理的SHR大鼠視網膜中上述指標水平明顯降低。這些結果表明,高血壓引起的炎癥激活和超氧化物的產生在HR的發展過程中發揮重要作用,抑制UCHL1的表達不僅能明顯降低血壓,還能改善炎癥和超氧化物的增加。

多種信號通路在HR中被激活,包括AKT、同源性磷酸酶、NOX、轉化生長因子β1/Smad和NF-κB[1]。研究發現,UCHL1調節與炎癥、氧化應激和動脈血管重塑有關的多種蛋白質的降解,包括p53、人NF-κB抑制蛋白α和HIF-1α[19-20]。通過進一步探索UCHL1的作用機制發現,與WKY大鼠比較,SHR大鼠視網膜中p-AKT和HIF-1α水平升高。這種變化在LDN54777治療的SHR大鼠中被逆轉,并降低了高血壓視網膜的病理損傷。為了確定LDN54777如何抑制SHR大鼠的HR,本研究進一步分析了多種信號傳導途徑。結果表明,LDN54777明顯阻斷了AKT、HIF-1α和相關信號介質(IKKα/β、NF-κB和VEGF)的激活。作為高血壓中炎癥反應的一個重要上游信號成分,NF-κB的激活引發了參與早期免疫反應每個階段的各種炎癥細胞因子的表達和分泌[21]。相關研究表明,NF-κB信號傳導是VEGF、IL-6和NOX的主要調節因子,進而調節氧化應激和血管功能,導致炎癥因子滲入靶器官,激活炎癥[22]。提示LDN54777對HR的保護作用可能與抑制AKT、IKKα/β、NF-κB、HIF-1α和VEGF信號通路有關。

綜上所述,UCHL1水平升高是HR發病機制的重要決定因素,抑制UCHL1的機制可能是通過抑制AKT、HIF-1α和下游相關信號介質(IKKα/β、NF-κB和VEGF)的激活實現的,抑制UCHL1可降低血壓,改善視網膜中央厚度、抑制炎癥和氧化應激水平,防止HR進展,UCHL1可能是HR的一個有前途的治療靶點。