CXCL11和CXCR3在宮頸癌患者中的表達及其與高危型人乳頭狀瘤病毒感染的關系*

鄧艷琴,高金菊

荊門市人民醫院:1.婦科;2.產科,湖北荊門 448000

高危型人乳頭狀瘤病毒(HR-HPV)持續性感染是引發宮頸上皮內瘤變(CIN)、宮頸癌等宮頸病變的重要致病因素[1]。宮頸癌是最為嚴重的宮頸病變,其不僅與HR-HPV感染有關,還與癌基因激活、炎癥反應、抑癌基因失活、免疫逃逸等有關[2-3]。研究發現,人乳頭狀瘤病毒(HPV)陽性感染可導致CXC趨化因子配體(CXCL)10分泌增多,而CXCL10可與CXC趨化因子受體-3(CXCR3)結合,激活相關通路,影響HPV免疫逃逸,促進癌變進程,CXCR3可能是治療宮頸癌的潛在靶點[4]; CXCL11在頭頸部鱗狀細胞癌中呈高表達,CXCL11-CXCR3軸通過調節淋巴細胞浸潤,影響炎癥反應進而影響頭頸部鱗狀細胞癌發展[5]。但CXCL11在CIN、宮頸癌中的表達及其與CXCR3、HR-HPV感染的關系尚未明確,因此,本研究通過測定CXCL11、CXCR3在CIN、宮頸癌和宮頸炎中的表達情況,分析各自相關性,以期為臨床防治宮頸病變提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年5月至2022年5月本院收治的205例宮頸病變患者的組織標本進行研究,其中75例宮頸癌患者為宮頸癌組,78例CIN患者為CIN組,52例宮頸炎患者為宮頸炎組。宮頸癌組:年齡35～69歲,平均(53.26±13.78)歲;體重44.97～68.53 kg,平均(56.12±8.94)kg。CIN組:年齡33～70歲,平均(52.95±13.63)歲;體重45.05～68.70 kg,平均(56.30±8.81)kg。宮頸炎組:年齡34～70歲,平均(53.38±13.87)歲;體重45.16～68.61 kg,平均(56.25±8.87)kg。宮頸癌組、CIN組、宮頸炎組女性年齡、體重比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。

納入標準:(1)CIN、宮頸癌患者符合《宮頸癌及癌前病變規范化診療指南(試行)》[6]中宮頸癌及CIN判定標準,經病理活檢證實;(2)宮頸炎患者無惡性病變,為單純宮頸炎;(3)患者未進行抗HPV治療。排除標準:(1)合并其他惡性腫瘤者;(2)近半年接受放療、免疫治療、化療者;(3)既往接受宮頸手術治療者。研究對象對本研究知情同意,且本研究獲得本院倫理委員會批準(批號:201904003)。

1.2儀器與試劑 兔抗人CXCL11單克隆抗體(貨號:ab216157)、兔抗人CXCR3單克隆抗體(貨號:ab288437)購自美國Abcam公司,山羊抗兔IgG(貨號:PAB9405)購自上海群己生物科技有限公司,二氨基聯苯胺顯色試劑盒(貨號:E-IR-R101)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,HPV-DNA分型檢測試劑盒(批號:20181205)購自凱杰生物工程(深圳)有限公司,顯微鏡(型號:LV100)購自日本尼康公司,基因雜交信號擴大儀(型號:Digene DML 2000TM)購自廣東信健醫療器械有限公司。

1.3方法

1.3.1組織標本收集 收集宮頸癌組和CIN組患者行全子宮切除術或宮頸錐切術的宮頸病變組織標本,收集宮頸炎組患者宮頸病變活檢組織標本,均放置于無菌標本袋,由病理科統一檢測。

1.3.2免疫組化法檢測宮頸病變組織CXCL11、CXCR3表達 采用免疫組化法檢測CXCL11、CXCR3表達:將收集的3組患者的宮頸病變組織進行石蠟包埋,取3 μm厚的組織切片,用二甲苯和梯度乙醇進行脫蠟、脫水處理,在3%過氧化氫溶液中進行孵育,孵育10 min后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次,每次3 min,用枸櫞酸鹽緩沖液進行抗原修復,再用PBS沖洗3次,每次3 min,然后加入按1∶200稀釋的一抗(兔抗人CXCL11、CXCR3單克隆抗體)各1滴,4 ℃孵育過夜,用PBS沖洗5次,每次3 min,再加入按1∶1 000稀釋的二抗(山羊抗兔IgG)1滴,37 ℃孵育60 min,孵育后用PBS沖洗5次,每次3 min,最后使用二氨基聯苯胺顯色試劑盒進行顯色,蘇木素復染,梯度乙醇脫水,中性樹膠封片,并在顯微鏡下拍照。隨機選取5個有代表意義的視野(×200)評估染色情況,每個視野計數200個細胞,取平均值。根據陽性細胞比例(A)和染色程度(B)評分乘積[7]判斷CXCL11、CXCR3表達情況。A:以陽性細胞比例>75%、50%～75%、25%～<50%、<25%分別記為3、2、1、0分;B:以染色程度黃褐色、棕黃色、淡黃色、無色分別記為3、2、1、0分。CXCL11、CXCR3表達評估結果:以A×B<3分為陰性,A×B≥3分為陽性。

1.3.3HR-HPV檢測 使用取樣器在宮頸外口黏膜處旋轉4圈取樣,置于取樣管內,利用HPV-DNA分型檢測試劑盒按第二代基因雜交捕獲法測定HPV16、52、18、56、31、58、33、59、35、66、39、45、68、51型這14種HR-HPV-DNA表達。具體方法:(1)DNA雙鏈在堿性條件下加熱,分解為DNA單鏈;(2)由試劑盒提供RNA組合探針,通過堿基配對的原則與DNA單鏈重新組成RNA-DNA雜交復合物;(3)捕獲特異性抗體與DNA-RNA雜交復合物;(4)第二抗體與RNA雜合體結合反應;(5)用基因雜交信號擴大儀進行定量檢測。HR-HPV判定標準:以標本表達值相對光單位(RLU)/陽性標準品閾值(CO)定義為HR-HPV病毒負荷量,以RLU/CO<1.0為陰性,RLU/CO≥1.0為陽性。并統計宮頸炎組、CIN組及宮頸癌組患者HR-HPV單一感染及多重感染情況。

1.4統計學處理 采用SPSS25.0軟件進行數據處理和分析。計數資料以例數和百分率表示,組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組組織中CXCL11、CXCR3表達及HR-HPV感染情況比較 與宮頸炎組、CIN組比較,宮頸癌組宮頸病變組織CXCL11、CXCR3陽性表達率及HR-HPV陽性感染率升高(P<0.05);與宮頸炎組比較,CIN組CXCL11、CXCR3陽性表達率及HR-HPV陽性感染率升高(P<0.05)。見表1、圖1。

注:A～C為CXCL11表達陰性的免疫組化圖;D～F為CXCL11表達陽性的免疫組化圖;G～I為CXCR3表達陰性的免疫組化圖;J～L為CXCR3表達陽性的免疫組化圖。圖1 免疫組化圖(×200)

表1 各組組織中CXCL11、CXCR3表達及HR-HPV感染情況比較[n(%)]

2.2宮頸癌患者CXCL11、CXCR3表達及HR-HPV感染與臨床病理參數的關系 宮頸癌患者宮頸病變組織CXCL11、CXCR3表達及HR-HPV感染與淋巴結轉移、分化程度有關(P<0.05)，與年齡、腫瘤最大徑、肌層浸潤及FIGO分期無關(P>0.05)。見表2。

表2 宮頸癌患者CXCL11、CXCR3表達及HR-HPV感染與臨床病理參數的關系 [n(%)]

2.3宮頸癌患者HR-HPV感染結果及分型 宮頸癌患者中HR-HPV感染共68例,其中單一感染率為38.24%(26/68),單一感染類型分別為HPV16型(11例)、HPV18型(7例)、HPV33型(4例)、HPV52型(2例)、HPV58型(2例);多重感染率為61.76%(42/68),多重感染類型分別為HPV16+HPV18型(19例)、HPV16+HPV33型(8例)、HPV16+HPV31+HPV51型(6例)、HPV16+HPV18+HPV58型(6例)、HPV18+HPV51+HPV52型(3例)。

2.4宮頸癌患者不同HR-HPV感染類型CXCL11、CXCR3表達情況比較 與單一感染HR-HPV類型患者比較,多重感染HR-HPV類型患者宮頸病變組織CXCL11、CXCR3陽性表達率升高(P<0.05)。見表3。

表3 宮頸癌患者不同HR-HPV感染類型CXCL11、CXCR3表達情況比較 [n(%)]

2.5宮頸癌患者CXCL11、CXCR3表達與HR-HPV感染的關系 宮頸癌患者宮頸病變組織CXCL11、CXCR3表達與HR-HPV感染有關(P<0.05)。見表4。

表4 宮頸癌患者CXCL11、CXCR3與HR-HPV感染的關系(n)

2.6宮頸癌患者CXCL11表達與CXCR3表達的關系 宮頸癌患者宮頸病變組織中CXCL11表達與CXCR3有關(χ2=12.311,P<0.05)。見表5。

表5 宮頸癌患者CXCL11表達與CXCR3的關系(n)

3 討 論

HPV是一種DNA病毒,其可通過感染宿主細胞,將自身DNA整合到宿主DNA上,且HR-HPV大多可整合到宿主細胞的基因中,進而影響癌基因、抑癌基因表達,其更易引起宮頸癌及CIN[8-9]。另外,宮頸癌的發生發展是一個漸變過程,其由慢性宮頸炎發展為CIN,CIN再進一步發展形成,病程較長[10]。因此,尋找與HR-HPV感染、宮頸病變有關的指標,及時干預,對早期防治宮頸癌有積極意義。

CXCL11是一種分泌蛋白,可與其受體CXCR3結合,進而趨化淋巴細胞,影響機體免疫應答,參與炎癥反應,與感染、腫瘤關系密切[11-12]。研究發現,CXCL11在結腸癌中呈高表達,與分化程度、淋巴結轉移相關,CXCL11可能是評估結腸癌患者預后的輔助指標[13];另外,CXCL11在口腔鱗狀細胞癌中表達上調,可能通過調節有關基因表達,進而影響口腔鱗狀細胞癌發生發展,CXCL11可能是診治口腔鱗狀細胞癌的潛在靶點[14]。但CXCL11在宮頸癌中的作用及與HR-HPV感染的關系尚不明確,因此本研究將CXCL11作為觀察指標有一定的臨床意義。本研究結果顯示,宮頸病變程度越高,CXCL11陽性表達率越高,提示CXCL11可能與宮頸病變有關,推測高表達CXCL11可能與其受體CXCR3結合,進而影響機體免疫反應,促進炎癥反應,加速宮頸病變,但其機制仍需深入探究證實。進一步研究顯示,宮頸癌患者宮頸病變組織CXCL11表達與淋巴結轉移、分化程度有關,提示CXCL11表達越高,宮頸癌患者腫瘤惡化程度越高,越易發生淋巴結轉移,CXCL11可能與宮頸癌病理發展密切相關。HR-HPV持續感染可引發宮頸癌及CIN[15]。本研究中HR-HPV陽性感染率隨宮頸病變程度加重而呈上升趨勢,與張燕等[16]研究趨勢相似,提示HR-HPV可能影響宮頸惡性轉化進程。此外,本研究結果顯示,宮頸癌患者HR-HPV感染與淋巴結轉移、分化程度有關,與霍會蠶等[17]研究結果類似,表明宮頸癌的生物學行為可能與HR-HPV感染有關。本研究進一步分析了宮頸癌患者宮頸病變組織CXCL11表達與HR-HPV感染的關系,結果顯示,CXCL11表達與HR-HPV感染有關,提示CXCL11可能與HR-HPV感染協同影響宮頸癌病變過程。

CXCR3主要表達在肥大細胞、自然殺傷細胞、T淋巴細胞表面上,可與其配體結合,進而趨化免疫細胞,調節免疫反應,影響腫瘤細胞遷移、增殖[18]。研究發現,CXCR3在腎細胞癌中表達升高,與腎細胞癌患者預后有關,CXCR3具有評估腎細胞癌預后的潛在價值[19];另外,CXCR3在套細胞淋巴瘤中呈過表達,與不良預后相關,CXCR3可能是套細胞淋巴瘤的治療靶標[20]。但宮頸病變程度和HR-HPV感染中CXCR3的表達情況尚不明確,因此本研究測定CXCR3的表達有積極意義。本研究中宮頸病變組織CXCR3陽性表達率隨宮頸病變程度加重呈升高趨勢,提示CXCR3可能在宮頸癌及CIN中起重要作用,推測CXCR3可能與其配體結合,進而影響機體免疫功能,影響宮頸細胞異常增殖、遷移,從而促進宮頸癌及CIN進展過程,其機制有待進一步探討。另外,本研究中宮頸癌患者宮頸病變組織CXCR3表達與淋巴結轉移、分化程度有關,提示CXCR3可能與宮頸癌病理進展相關。進一步分析結果顯示,宮頸癌患者宮頸病變組織CXCR3表達與HR-HPV感染有關,提示HR-HPV感染可能與CXCR3共同影響宮頸癌發生發展。另外,本研究發現,多重感染HR-HPV類型患者宮頸病變組織CXCL11、CXCR3陽性表達率高于單一感染HR-HPV類型患者,提示HR-HPV感染類型與宮頸癌患者CXCL11、CXCR3表達有關,多重感染HR-HPV患者可能通過增加CXCL11、CXCR3表達來促進宮頸癌進展。KUMARAVEL等[5]研究認為CXCL11-CXCR3軸影響頭頸部鱗狀細胞癌發生發展,因此,本研究分析了宮頸癌患者宮頸病變組織中CXCL11與CXCR3表達的關系,結果顯示,CXCL11表達與CXCR3有關,提示CXCL11可能通過與CXCR3相互結合進而影響宮頸癌病變過程,但具體機制仍需深入探討。

綜上所述,CIN及宮頸癌患者宮頸病變組織CXCL11、CXCR3表達較高,CXCL11、CXCR3在宮頸癌患者中表達最高,其與HR-HPV感染有關,CXCL11、CXCR3可能是診治宮頸癌的分子靶標。但本研究尚未深入探究CXCL11、CXCR3在宮頸癌中的作用機制,未分析CXCL11、CXCR3診斷宮頸癌的價值,且樣本量較少,后期將擴大樣本量,結合作用機制展開研究。