基于NLRP3信號通路探討辛伐他汀抑制COPD大鼠肺組織細胞焦亡的作用研究*

張 俁,王麗萍,溫春生,王海旭

新疆醫科大學第五附屬醫院呼吸與危重癥醫學科, 新疆烏魯木齊 830011

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種常見的以持續氣流受限為特征的肺部疾病[1]。目前COPD的常規治療方法僅能達到控制患者癥狀、抑制病情進展的作用,無法徹底治愈[2]。細胞焦亡是一種新型的程序性細胞死亡,可誘發強烈的炎癥反應,是COPD進展的重要因素[3-4]。辛伐他汀主要用于高膽固醇血癥、冠心病的治療,但隨著臨床研究的進展,有報道指出辛伐他汀可有效治療COPD,降低炎癥指標水平[5],同時也有研究發現辛伐他汀對COPD大鼠有良好的抗炎作用[6]。細胞焦亡常伴隨核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NLRP3)信號通路的激活,促進機體釋放多種炎癥因子,激活強烈的炎癥反應[7];研究發現,NLRP3信號通路參與調控COPD發生發展過程中的細胞焦亡[8]。但辛伐他汀能否通過調控NLRP3信號通路調節COPD機體肺組織細胞焦亡的相關報道較少。鑒于此,本研究選取SD大鼠進行動物實驗,探究辛伐他汀通過調控NLRP3信號通路調節COPD機體肺組織細胞焦亡的作用與機制。

1 材料與方法

1.1材料 40只SD大鼠,SPF級,雄性,體重(200±10)g。SD大鼠由新疆醫科大學動物實驗中心提供[許可證編號:SCXK(新)2020-0003],實驗于新疆醫科大學動物實驗管理中心SPF級實驗室進行。飼養條件:室溫(23±3)℃,相對濕度40%～65%,光照周期12 h/12 h,自由進食、飲水。本研究經新疆醫科大學動物實驗管理中心倫理委員會批準(審批號:IACUC20200118-01)。

1.2儀器與試劑 脂多糖(LPS)、辛伐他汀購自美國SIGMA公司,批號L2630、S6196;NLRP3-siRNA質粒(正義鏈:5′-AUCUCUTGAACUAUUAUCAAC-3′;反義鏈:5′-CTUAUATCTCTAGGCUA-3′)、NC-siRNA質粒(正義鏈:5′-ATUCUAUTCGAUAGCTATATCUAC-3′;反義鏈:5′-CTUAUAGCUUAGAGGCUA-3′)委托深圳晶美生物工程公司合成;Lipofectamine 2000脂質體購自美國Invitrogen公司,批號PB1021;大鼠白細胞介素(IL)-1β酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒購自聯科生物公司,批號EK301B、EK382;大鼠IL-18 ELISA檢測試劑盒購自武漢華美公司,批號CSB-E04610r;免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司,批號SP9000;末端標記法(TUNEL)凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德公司,批號MK1020;大鼠NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)、IL-1β、凋亡相關點樣蛋白(ASC)、IL-18、TNF-α、β-肌動蛋白(β-actin)聚合酶鏈反應(PCR)引物由合肥知恩生物技術有限公司合成;兔抗大鼠NLRP3、Caspase-1、IL-1β、ASC、IL-18、TNF-α抗體購自美國BIOSS公司,批號bs-10021R、bs-0169R、bs-0812R、bs-6741R、bs-0529R、bs-10802R;TRIzolTM試劑盒(總RNA提取試劑盒)購自美國ABI公司,批號15596026。

PFTManeuvres型動物肺功能測量系統購自美國Buxco公司,煙熏箱購自上海玉研科學儀器有限公司,Neofuge 15R型離心機購自上海力申科學儀器有限公司,E200型光學顯微鏡購自尼康儀器(上海)有限公司,xMarkTM型酶標儀購自美國Bio-Rad公司,7500型PCR儀購自美國ABI公司。

1.3方法

1.3.1COPD大鼠模型建立及藥物干預 將40只大鼠隨機分成5組:對照組、COPD模型組、辛伐他汀藥物組、NLPR3下調組和空載組,每組8只。

對照組大鼠分別于第15天和第30天通過氣道灌輸200 mL生理鹽水,每天自由飲水攝食,不進行香煙煙熏。第1～14天、第16～29天和第31～59天于每天上午使用與藥物等體積的生理鹽水對大鼠灌胃(氣道灌輸生理鹽水當天不灌胃)。

COPD模型組大鼠采用香煙煙熏方式[9]構建COPD模型,分別于第15天和第30天通過氣道灌輸200 mL LPS(1 mg/mL溶于生理鹽水),輕輕搖擺大鼠20 s,確保注入的LPS在肺部分布均勻。第1～14天、第16～29天和第31～59天將大鼠置于煙熏箱內,暴露于均勻燃燒的12支去除濾嘴的香煙煙霧中(焦油量為12 mg,煙氣煙堿量為1.1 mg,煙氣CO量為14 mg),每天上、下午各1次,每次間隔約4 h,每次1 h。每天上午在煙熏前使用與藥物等體積生理鹽水灌胃(氣道灌輸LPS當天不煙熏、不灌胃)。

辛伐他汀藥物組大鼠COPD模型建立方法同COPD模型組。第1～14天、第16～29天和第31～59天于每天上午煙熏前對該組大鼠使用辛伐他汀以5 mg/kg劑量灌胃(氣道灌輸LPS當天不煙熏、不灌胃)。

NLPR3下調組和空載組COPD模型建立方法同COPD模型組。第1～14天、第16～29天和第31～59天于每天上午煙熏前對大鼠分別經尾靜脈注射NLPR3-siRNA轉染重組載體、NC-siRNA轉染重組載體(氣道灌輸LPS當天不煙熏、不注射)。

1.3.2肺功能測定 各組大鼠于第60天,運用動物肺功能測量系統檢測動物肺功能,檢測指標:呼吸頻率(f)、吸氣容積(TVb)、每分鐘呼氣量(MVb)、吸氣峰流速(PIFb)、呼氣峰流速(PEFb)、吸氣時間(Ti)、呼氣時間(Te)、呼氣中流速(EF50)。

1.3.3標本收集 各組大鼠于第60天進行標本收集。肺泡灌洗液(BALF)標本:大鼠腹腔麻醉,固定,切開胸腹部,分離氣管及肺臟,夾閉右主支氣管,以3.0 mL的0.9%生理鹽水緩慢灌洗左肺,抽出1.5 mL,反復灌洗3次,總共回收液體4.0～5.0 mL。收集的BALF在700×g(有效離心半徑11 cm)離心10 min,上清液單獨分裝,-80 ℃保存。

血清標本:大鼠腹主動脈取血(盡量多抽),4 ℃,3 000 r/min(有效離心半徑11 cm)離心10 min,取上清液(即血清)單獨分裝,-80 ℃保存。

右肺組織:大鼠麻醉處死后迅速摘取右肺中葉組織,分成2份,一部分直接固定保存于10%甲醛溶液中,另一部分直接凍存于-80 ℃冰箱。

1.3.4ELISA檢測BALF上清液和血清中IL-1β、IL-18、TNF-α水平 取各組大鼠BALF上清液及血清標本,ELISA分別檢測IL-1β、IL-18、TNF-α水平,檢測方法按檢測試劑盒說明書進行。

1.3.5蘇木精-伊紅(HE)染色觀察大鼠肺組織病理改變 取各組大鼠固定于10%甲醛溶液的1/3右肺組織,石蠟包埋,常規切片(4 μm),脫蠟。染色過程:蘇木精染色5 min后,分色2～3 s,反藍2～3 min;伊紅染色2 min,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片后于光學顯微鏡下觀察肺組織切片。

1.3.6TUNEL染色觀察肺細胞凋亡 取各組大鼠固定于10%甲醛溶液的1/3右肺組織,石蠟包埋,常規切片(4 μm),TUNEL染色,具體操作按照檢測試劑盒說明書進行。

1.3.7實時熒光定量PCR(qPCR)檢測肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α mRNA水平 取各組大鼠凍存的右肺組織,液氮包圍研磨成粉,4 ℃,12 000 r/min(有效離心半徑11 cm)離心15 min取上清液,加異丙醇-20 ℃靜置1 min;4 ℃,12 000 r/min(有效離心半徑11 cm)離心15 min,沉淀即為總RNA。采用核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度為1.8～2.1合格;反轉錄合成cDNA,反應條件為25 ℃反應10 min,85 ℃反應5 s。qPCR擴增反應:預變性95 ℃ 10 min;變性95 ℃ 15 s,40個循環;延伸60 ℃ 1 min。引物信息見表1。待測基因mRNA相對表達水平以2-ΔΔCt表示[10]。

表1 qPCR檢測待測基因mRNA的引物信息表

1.3.8免疫組化檢測肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α蛋白水平 取各組大鼠固定于10%甲醛溶液的剩余右肺組織,石蠟包埋,常規切片(4 μm),按照免疫組化染色試劑盒操作說明檢測各組大鼠右肺組織中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α蛋白水平。

2 結 果

2.1各組大鼠肺功能比較 與對照組比較,COPD模型組、空載組大鼠f、TVb、MVb、PIFb、PEFb、EF50均升高(P<0.05),Ti、Te延長(P<0.05);與COPD模型組、空載組比較,辛伐他汀藥物組、NLRP3下調組f、TVb、MVb、PIFb、PEFb、EF50均降低(P<0.05),Ti、Te縮短(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠肺功能比較

2.2各組大鼠BALF上清液和血清中IL-1β、IL-18、TNF-α水平比較 與對照組比較,COPD模型組、空載組大鼠BALF上清液和血清中IL-1β、IL-18、TNF-α水平升高(P<0.05);與COPD模型組、空載組比較,辛伐他汀藥物組、NLRP3下調組大鼠BALF上清液和血清中IL-1β、IL-18、TNF-α水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠BALF上清液和血清中IL-1β、IL-18、TNF-α水平比較

2.3HE染色觀察大鼠肺組織病理改變 鏡下觀察,對照組大鼠肺組織大體結構正常,少部分支氣管上皮細胞輕度增生,黏膜下少量慢性炎癥細胞浸潤;少部分肺泡壁增生、增厚,間質散在少量慢性炎癥細胞浸潤;少部分肺泡萎縮、變小。COPD模型組和空載組大鼠部分支氣管黏膜纖毛柱狀上皮增生,部分萎縮、脫落,平滑肌層及黏膜下層見大量慢性炎癥細胞散在或灶狀浸潤,部分支氣管管腔擴張;部分肺泡壁增厚,實變,間質較多慢性炎細胞浸潤,部分肺泡壁萎縮,肺泡腔變小,部分肺泡壁斷裂、擴張;部分支氣管伴行血管擴張、充血;部分間質纖維肉芽組織增生。辛伐他汀藥物組和NLRP3下調組大鼠支氣管黏膜增生及破壞程度、周圍炎癥細胞浸潤程度均稍減輕,肺泡壁增厚、萎縮及擴張程度未見明顯改變。見圖1。

注:A、B、C、D、E分別為對照組、COPD模型組、空載組、NLRP3下調組、辛伐他汀藥物組大鼠肺組織HE染色圖。圖1 大鼠肺組織HE染色結果(×200)

2.4TUNEL染色觀察大鼠肺組織細胞凋亡 與對照組比較,COPD模型組、空載組大鼠肺組織細胞凋亡率升高(P<0.05);與COPD模型組、空載組比較,辛伐他汀藥物組和NLRP3下調組大鼠肺組織細胞凋亡率降低(P<0.05),見表4、圖2。

注:A、B、C、D、E分別為對照組、COPD模型組、空載組、NLRP3下調組、辛伐他汀藥物組大鼠肺組織凋亡圖。圖2 大鼠肺組織細胞凋亡(×200)

表4 各組凋亡率比較

2.5各組大鼠肺組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β、ASC、IL-18、TNF-α mRNA水平比較 與對照組比較,COPD模型組、空載組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、ASC、IL-18、TNF-α mRNA水平升高(P<0.05);與COPD模型組、空載組比較,辛伐他汀藥物組、NLRP3下調組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、ASC、IL-18、TNF-α mRNA水平降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠肺組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β、ASC、IL-18、TNF-α mRNA水平比較

2.6各組大鼠肺組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β、ASC、IL-18、TNF-α蛋白免疫組化評分比較 與對照組比較,COPD模型組、空載組NLRP3、Caspase-1、IL-1β、ASC、IL-18、TNF-α蛋白免疫組化評分升高(P<0.05);與COPD模型組、空載組比較,辛伐他汀藥物組、NLRP3下調組NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-18、TNF-α蛋白免疫組化評分降低(P<0.05)。見表6。

表6 各組大鼠肺組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β、ASC、IL-18、TNF-α蛋白免疫組化評分比較分, n=8)

續表6 各組大鼠肺組織NLRP3、Caspase-1、IL-1β、ASC、IL-18、TNF-α蛋白免疫組化評分比較分, n=8)

3 討 論

吸煙是COPD的主要病因,煙草燃燒后釋放大量有毒物質,可促進肺組織細胞焦亡,促進炎癥細胞釋放炎癥因子,引起肺部炎癥反應,造成肺組織損傷[11]。目前COPD的臨床治療主要為家庭氧療、呼吸肌鍛煉等康復型治療和藥物治療,但只能達到緩解作用,無法根本性逆轉病變,且目前臨床并無特效藥,因而仍需探索更加高效的藥物。

本研究結果顯示,COPD模型組和空載組大鼠肺組織平滑肌層及黏膜下層見大量慢性炎癥細胞散在或灶狀浸潤,肺泡間質較多慢性炎癥細胞浸潤,與既往研究構建COPD模型一致[12],證實本研究模型構建成功。本研究結果表明,辛伐他汀可改善COPD大鼠肺功能,改善肺組織病理情況,抑制肺細胞凋亡,發揮抑制肺細胞焦亡的功能,且其作用與下調NLRP3表達的效果一致。細胞焦亡可誘導強炎癥反應,有報道指出,辛伐他汀可抑制COPD小鼠炎癥反應[13],推測辛伐他汀可能通過抑制炎癥反應從而抑制肺細胞焦亡。

本研究結果表明,辛伐他汀可下調BALF上清液和血清中IL-1β、IL-18、TNF-α表達,抑制肺組織NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α表達,發揮抑制肺細胞焦亡的作用,與下調NLRP3表達的作用相當,推測辛伐他汀是通過抑制NLRP3從而抑制其下游分子表達、減輕炎癥反應、減少肺細胞焦亡。細胞焦亡作為一種新的程序性細胞死亡,在其發生過程中常伴隨NLRP3信號通路的激活,當NLRP3與COPD機體內激活炎癥小體的信號分子結合后,促進NLRP3炎癥小體形成,導致Caspase-1激活,活化Caspase-1促進IL-1β、IL-18、TNF-α釋放,誘導細胞焦亡,引起強炎癥反應[14-15]。RAO等[16]指出通過激活NLRP3信號通路,促進IL-1β、IL-18表達可促進COPD氣道上皮細胞焦亡;MO等[17]指出,激活NLRP3信號通路,上調IL-1β、IL-18水平可誘導COPD氣道上皮細胞焦亡;TIAN等[18]指出,通過抑制NLRP3炎癥小體途徑可改善香煙煙霧誘導的COPD大鼠肺炎癥及細胞焦亡;李海霞[19]指出,通過抑制NLRP3信號通路,可降低COPD炎癥水平,降低細胞焦亡作用。本研究結果與上述研究一致,提示辛伐他汀可能通過抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號通路,抑制ASC、IL-18、TNF-α表達,發揮抑制COPD肺組織細胞焦亡的作用。

綜上所述,辛伐他汀可抑制COPD肺組織細胞焦亡,其機制可能是通過抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號通路,抑制ASC、IL-18和TNF-α表達實現的。