與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)預(yù)后的基因分析*

付 偉,程國(guó)彬,丁 瑤,張 鶴,鄧亞婕,羅永婧

聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二五醫(yī)院消化內(nèi)科,貴州貴陽(yáng) 550009

食管癌是世界上最常見和最致命的消化系統(tǒng)腫瘤之一。在美國(guó),每年有超過(guò)18 000人被診斷為食管癌,有超過(guò)15 000人死于食管癌,大多數(shù)患者在診斷后1年內(nèi)死亡[1]。超過(guò)90%的食管癌患者病理類型是食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)[1-2]。盡管近年來(lái)中國(guó)食管癌的發(fā)病率有所下降,但由于人口眾多,食管癌患者的絕對(duì)數(shù)量仍然很高。食管癌的主要治療方法是手術(shù)、化療和放療。完整的手術(shù)切除和根治性淋巴結(jié)清掃可以提供準(zhǔn)確的分期,目前食管癌患者的分類標(biāo)準(zhǔn)包括組織學(xué)分級(jí)、原發(fā)腫瘤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等[3],對(duì)預(yù)測(cè)預(yù)后和確定術(shù)后治療方案具有重要的指導(dǎo)意義。一個(gè)有效合理的食管癌分期系統(tǒng)對(duì)于治療方案的選擇和長(zhǎng)期生存的預(yù)測(cè)具有重要意義[4-5]。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是食管癌最關(guān)鍵的預(yù)后因素,淋巴結(jié)的數(shù)量與疾病的進(jìn)展有關(guān)[4-5]。原發(fā)腫瘤和淋巴結(jié)擴(kuò)散的程度決定了食管癌的預(yù)后,已有研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)狀態(tài)是預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)疾病及5年生存率的一個(gè)因素[5]。在食管癌中,需要一種預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物來(lái)確定疾病的進(jìn)展和預(yù)后。本研究基于綜合生物信息學(xué)分析,探索可能影響食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的基因,并探討其與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系,以期為臨床治療食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究使用了來(lái)自癌癥基因組圖譜(TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中食管癌的RNAseq數(shù)據(jù)集level 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù),FPKM格式的RNAseq數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成了TPM格式并進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化,截止時(shí)間2021年3月31日。首先確定了食管癌患者,本研究共包括144個(gè)標(biāo)本,包括66個(gè)無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本和78個(gè)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本。

1.2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移基因表達(dá)的差異 將來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的食管癌標(biāo)本數(shù)據(jù)分為兩組,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。然后,使用R軟件的Limma軟件包研究mRNA的差異表達(dá)。當(dāng)“調(diào)整的P<0.05和log2(倍數(shù)變化)>1.5或log2(倍數(shù)變化)<-1.5”被定義為閾值mRNA差異表達(dá)篩選。

1.3蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu) PPI淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)基于 metascape在線數(shù)據(jù)庫(kù)(https://metascape.org/gp/#/main/step1)進(jìn)行分析,采用mcode算法確定中心基因。

1.4免疫浸潤(rùn)評(píng)估 用于分析基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的關(guān)系。橫坐標(biāo)代表基因,縱坐標(biāo)代表免疫細(xì)胞,相關(guān)系數(shù)范圍為-1～1,負(fù)值代表呈負(fù)相關(guān),正值代表呈正相關(guān)。

1.5基因本體(GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)分析 采用GO富集分析生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞成分(CC)、分子功能(MF),采用rpackage簇圖譜對(duì)篩選出的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因進(jìn)行KEGG分析。

1.6預(yù)后模型 對(duì)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因進(jìn)行預(yù)后模擬,采用LASSO Logistic回歸分析獲得最佳相關(guān)基因,確定與預(yù)后相關(guān)的基因,構(gòu)建基因特征,并根據(jù)每例患者簽名中基因的回歸系數(shù)和相應(yīng)的表達(dá)值計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 從TCGA中獲得的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用R3.6.3軟件包進(jìn)行處理。靈敏度和準(zhǔn)確性通過(guò)受試者工作特征(ROC)曲線來(lái)驗(yàn)證。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1分析淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異表達(dá)的基因 利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)研究發(fā)現(xiàn),在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌中存在227個(gè)差異表達(dá)的基因,其中70個(gè)為上調(diào)基因,157個(gè)為下調(diào)基因。

2.2食管癌中表達(dá)的中樞(Hub)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)分析食管癌有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異表達(dá)基因,構(gòu)建了70個(gè)上調(diào)和157個(gè)下調(diào)基因的PPI網(wǎng)絡(luò),并確定了31個(gè)Hub基因。另外,將基于TCGA數(shù)據(jù)集的食管癌標(biāo)本按有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為兩組,發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)基因[甲狀旁腺激素樣激素(PTHLH)、C型凝集素域7家族成員A(CLEC7A)、胰高血糖素(GCG)、瞬時(shí)受體電位離子通道香草素亞型3(TRPV3)、松弛素家族肽受體4(RXFP4)、血小板因子4(PF4)、生長(zhǎng)抑素受體(SSTR)5]的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、2。

注:圖中為前31個(gè)Hub基因,其高度較高的節(jié)點(diǎn)以紅色、藍(lán)色顯示。圖1 PPI網(wǎng)絡(luò)建設(shè)圖

注:*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。圖2 食管癌中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的7個(gè)Hub基因的表達(dá)

2.3GO富集分析和KEGG分析 結(jié)果表明,這些基因在G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、腺苷酸環(huán)化酶激活G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)信號(hào)通路、鈣離子輸入的正向調(diào)節(jié)、宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)及神經(jīng)活性配體-受體相互作用中發(fā)揮著重要的作用,見圖3。

注:A為BP分析的圓圖;B為CC分析的圓圖;C為MF分析的圓圖;D為KEGG分析圖。圖3 7個(gè)Hub基因的GO分析和KEGG分析

2.4食管癌中7個(gè)Hub基因與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系 經(jīng)過(guò)GO富集分析發(fā)現(xiàn),GPCR家族在涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞膜受體中占據(jù)重要地位,參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng),并且在食管癌的免疫浸潤(rùn)中扮演著重要的角色。進(jìn)一步分析食管癌基因與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系發(fā)現(xiàn),這7個(gè)基因與多種免疫細(xì)胞有關(guān),其中PTHLH、CLEC7A、TRPV3與Tcm中央記憶型T細(xì)胞呈正相關(guān),與Th17細(xì)胞、NK CD56 明亮細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞呈負(fù)相關(guān);PF4、SSTR5、RXFP4與Tcm中央記憶型T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān),與Th17細(xì)胞、NK CD56明亮細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞呈正相關(guān)。見圖4。

注:*P<0.05;**P<0.01。圖4 食管癌中7個(gè)Hub基因與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系

2.5預(yù)后建模 對(duì)來(lái)自食管癌隊(duì)列的6個(gè)基因表達(dá)矩陣進(jìn)行了LASSO Logistic回歸分析,使用有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移來(lái)最終確定3個(gè)最相關(guān)的基因(GCG、TRPV3、SSTR5)構(gòu)建體的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分,λ值最小目標(biāo)參量均值=0.041,風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=0.064 7×GCG+0.082 2×TRPV3+0.092 9×SSTR5。見圖5。

注:A為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分從低到高的散點(diǎn)圖;B為不同標(biāo)本風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)應(yīng)的生存時(shí)間和生存狀態(tài)的散點(diǎn)圖分布及預(yù)后模型中基因表達(dá)的熱圖;C為高風(fēng)險(xiǎn)患者和低風(fēng)險(xiǎn)患者的Kaplan-Meier曲線;D為該風(fēng)險(xiǎn)模型的1、3、5年的ROC曲線。圖5 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建

2.6多因素Cox回歸分析 進(jìn)一步分析TCGA數(shù)據(jù)集中的風(fēng)險(xiǎn)模型,顯示高危患者的生存狀態(tài)低于低危患者,風(fēng)險(xiǎn)比(HR)為1.64,P=0.056。同時(shí),該模型在1、3、5年的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.580、0.631和0.950。另外,對(duì)基于風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)分公式中的基因進(jìn)行了多因素Cox回歸分析,表明SSTR5是獨(dú)立的預(yù)后因素。見表1。

表1 多因素Cox回歸分析

續(xù)表1 多因素Cox回歸分析

3 討 論

食管癌是一種常見的惡性腫瘤,預(yù)后差,長(zhǎng)期生存率低。對(duì)于局部晚期可切除的食管癌,新輔助化療目前是治療的標(biāo)準(zhǔn)[6-8]。然而,無(wú)論進(jìn)行何種根治性切除和擴(kuò)大淋巴結(jié)清掃,大多數(shù)ESCC患者仍然死于局部區(qū)域復(fù)發(fā)和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此,食管癌的5年生存率僅在13%～18%[9],區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是ESCC患者術(shù)后失敗的主要標(biāo)志[10]。有研究報(bào)道了miRNAs和長(zhǎng)非編碼RNA與ESCC轉(zhuǎn)移的關(guān)系[11],表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與特定生物標(biāo)志物的異常表達(dá)之間存在直接聯(lián)系。因此,有可能在術(shù)后通過(guò)檢測(cè)特定的生物標(biāo)志物來(lái)識(shí)別高危的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者,從而精確地進(jìn)行術(shù)后輔助治療,提高生存率。

腫瘤細(xì)胞可通過(guò)系統(tǒng)循環(huán)遷移到區(qū)域淋巴結(jié)。幾乎所有類型的癌癥都涉及循環(huán)腫瘤細(xì)胞。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌、頭頸部癌癥、結(jié)直腸癌和前列腺癌的一個(gè)公認(rèn)的預(yù)后因素。然而,在不同的癌癥中,血管侵犯(淋巴侵犯、血源性傳播等)的方法是不同的。HOSCH等[12]將食管癌歸為免疫性腫瘤。WU等[13]報(bào)道的機(jī)制包括由于主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類表型食管癌的DNA甲基化對(duì)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的功能性抑制而導(dǎo)致的免疫規(guī)避和高凝血。

因此,有必要尋找能夠預(yù)測(cè)早期轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的生物標(biāo)志物。在本研究中,在兩組有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)本中檢測(cè)到227個(gè)基因表達(dá)差異,70個(gè)上調(diào)基因和157個(gè)下調(diào)基因。然后,構(gòu)建了這些基因的PPI網(wǎng)絡(luò),并篩選了總共7個(gè)Hub基因,包括PTHLH、CLEC7A、GCG、TRPV3、RXFP4、PF4、SSTR5。

研究發(fā)現(xiàn),在ESCC的一個(gè)亞群中溴結(jié)構(gòu)域睪丸特異性蛋白與鱗狀細(xì)胞表型相關(guān)的關(guān)鍵ΔNp63靶基因PTHLH環(huán)路有關(guān)[14]。有研究發(fā)現(xiàn), CLEC7A在胰腺導(dǎo)管腺癌(PDA)的巨噬細(xì)胞上高表達(dá),靶向CLEC7A信號(hào)傳導(dǎo)是開發(fā)PDA免疫療法的潛在策略[15]。GCG是林奇綜合征發(fā)展成結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物[16]。在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)具有高預(yù)后價(jià)值的GCG異常表達(dá)。腫瘤進(jìn)展相關(guān)的途徑和腫瘤免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞與GCG的表達(dá)有關(guān)。因此,GCG可被視為治療結(jié)直腸癌的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。但是在食管癌的研究中相關(guān)報(bào)道較少[17]。有研究表明,SSTR在多腫瘤中過(guò)度表達(dá),在食管腺癌患者中,大多數(shù)人表達(dá)少量的SSTR[18]。

淋巴結(jié)也是腫瘤轉(zhuǎn)移的常見部位,淋巴結(jié)中的癌細(xì)胞可以通過(guò)控制免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)和反應(yīng)性來(lái)塑造它們與宿主免疫系統(tǒng)的相互作用。這可能表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能與免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)密切相關(guān)。GO富集分析結(jié)果也顯示了7個(gè)Hub基因和免疫之間的可能聯(lián)系。本研究還分析了這些基因與食管癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性。免疫浸潤(rùn)分析結(jié)果顯示,PTHLH、CLEC7A、TRPV3與Tcm中央記憶型T細(xì)胞呈正相關(guān),與Th17細(xì)胞、NK CD56明亮細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞呈負(fù)相關(guān);PF4、SSTR5、PXFP4與Tcm中央記憶型T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān),與Th17細(xì)胞、NK CD56明亮細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞呈正相關(guān)。

CLEC7A通過(guò)修飾腸道菌群來(lái)調(diào)控Treg細(xì)胞的分化,從而調(diào)節(jié)腸道免疫穩(wěn)態(tài)[19]。SSTR5誘導(dǎo)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)β-catenin質(zhì)膜積累,T細(xì)胞因子依賴的轉(zhuǎn)錄失活,下調(diào)Wnt靶基因cyclin D1和c-Myc[20]。這進(jìn)一步證明免疫細(xì)胞浸潤(rùn)可以促進(jìn)食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。結(jié)合這項(xiàng)研究可以看出,這一過(guò)程與這7個(gè)關(guān)鍵基因密切相關(guān),但具體機(jī)制還有待研究。

最后,本研究對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中7個(gè)基因表達(dá)矩陣進(jìn)行了LASSO Logistic回歸分析,通過(guò)有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移來(lái)最終確定為3個(gè)最相關(guān)基因(GCG、TRPV3、SSTR5)構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。此外,基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式中變量Cox回歸分析顯示,SSTR5是獨(dú)立的預(yù)后因素。這可以解釋GCG、TRPV3、SSTR5與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)后密切相關(guān)。

但本研究存在一定局限性:(1)TCGA是一個(gè)定期更新的公共數(shù)據(jù)庫(kù),但樣本量和數(shù)據(jù)量有限,臨床病理信息不全面,這可能會(huì)導(dǎo)致一些潛在的錯(cuò)誤或偏見,未來(lái)應(yīng)該包括更多的數(shù)據(jù)來(lái)改進(jìn)模型;(2)缺乏體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。本課題組還將繼續(xù)進(jìn)行基因?qū)ο鄳?yīng)免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制的研究。

綜上所述,食管癌中有7個(gè)基因與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外,GCG、TRPV3、SSTR5與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)后密切相關(guān)。上述7個(gè)基因可能通過(guò)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)促進(jìn)食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,但其具體機(jī)制仍有待研究,這也為免疫療法阻止食管癌的進(jìn)展提供了潛在的方向。