ANG及其突變體對膀胱癌血管生成的影響及分子機制研究

劉玉林,黃曉楠,向 玉,陳俊霞

1.四川省遂寧市中心醫院檢驗科,四川遂寧 629000;2.重慶醫科大學細胞生物學與遺傳學教研室,重慶 400016

膀胱癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤之一,其發病率居我國泌尿系統腫瘤第一位[1]。相關數據顯示,2020年全球新增膀胱癌確診病例約5.73萬例,占全部惡性腫瘤新發病例的3.0%,死亡約2.13萬例,占全部惡性腫瘤死亡病例的2.1%[2]。血管生成素(ANG)是非常重要的血管生成因子,由147個氨基酸組成,包含一段信號肽序列,具有弱RNA酶活性[3]。ANG在多種實體瘤中表達升高,研究表明其與血管生成及腫瘤發生發展密切相關[4],新生血管形成可促進腫瘤的發生發展。ANG可以通過調節黏附因子表達[5]及免疫細胞[6-7]參與免疫反應,也可通過調節腫瘤血管變化[8]間接參與免疫反應。本文主要探索ANG及其突變體對膀胱癌血管生成的影響和作用機制,從血管生成角度探索膀胱癌的發生發展。

1 材料與方法

1.1材料 膀胱癌BIU87細胞(南京凱基生物有限公司);RPMI 1640培養基(美國Gibico公司);脂質體Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司);Endothelial Tube Formation Assay(體外血管,美國Cell Biolabs公司)、基質膠(美國BD公司);兔抗人磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、磷酸化PTEN(p-PTEN)、糖原合成酶(GSK3)、磷酸化GSK3(p-GSK3)及二抗(美國Immunoway公司);ANG單克隆抗體(美國Abcam公司);核糖核酸酶抑制因子(RI)多克隆抗體(重慶醫科大學細胞生物學與遺傳學教研室保存);G418(中國碧云天生物技術有限公司);Dual-Glo?Luciferase Assay試劑盒和PRL-TK質粒(美國Promega公司);白皮受精雞蛋(重慶市種禽育種公司)。

1.2實驗方法

1.2.1構建突變體質粒

1.2.1.1pCMV-3×flag-ANGH13R和pCMV-3×flag-ANGH114R突變體合成 pCMV-3×flag-ANGH13R引物:上游引物為5′-CACACTTCCTGACCCAGCGCTATGATGCCAAACCACAG-3′,下游引物為5′-CTGTGGTTTGGCATCATAGCGCTGGGT CAGGAAGTGTG-3′;pCMV-3×flag-ANGH114R引物:上游引物為5′-GAAAATGGCTTACCTGTCCGCTTGGATCAGTCAATTTTC-3′,下游引物為5′-GAAAATTGACTGATCCAAGCGGACAGGTAAG CCATTTTC-3′。

1.2.1.2突變反應體系 模板DNA 2.5 μL,突變體引物2.0 μL,dNTPs 4.0 μL,Pyrobest聚合酶0.4 μL,pyrobest buffer 5.0 μL,ddH2O 36 μL,總體積50 μL。突變條件:94 ℃,30 s;68 ℃,30 s;72 ℃,10 min;12個循環。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定突變產物。

1.2.1.3質粒轉化 感受態菌中加入突變反應產物,4 ℃靜置30 min。42 ℃孵育2 min,4 ℃刺激2 min。加入900 μL LB培養基(不含抗菌藥物)混勻,37 ℃恒溫搖床振蕩培養1 h。取100 μL轉化后的混合液接種到LB平板培養皿中(含抗菌藥物)。37 ℃孵箱中正放培養30 min后,倒置培養18 h。挑選單克隆接種于LB培養基中(含抗菌藥物),37 ℃,300 r/min振蕩培養18 h。

1.2.1.4pCMV-3×flag-ANGH13R和pCMV-3×flag-ANGH114R酶切體系 Hind Ⅲ 2.5 μL,BamHⅠ2.5 μL,10×K Buffer 5 μL,pCMV-3×flag-ANG突變體質粒25 μL,ddH2O 15 μL,總體積50 μL。37 ℃恒溫金屬浴反應5 h,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,并送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.2建立穩定轉染細胞系 實驗組(pEGFP-C1-ANGH13R、pEGFP-C1-ANGH114R、pEGFP-C1-ANG)和對照組(pEGFP-C1)質粒分別用脂質體Lipofectamine 2000轉染BIU87細胞。24 h后移植到6孔板,細胞培養箱中繼續培養,48 h后換10%血清培養基(含600 μg/mL G418)培養。兩周后G418濃度減半,用300 μg/mL G418繼續培養兩周,最后將幸存下來的細胞轉移到96孔板中擴大培養,穩定轉染細胞系構建成功。

1.2.3蛋白質印跡法(Western blot)檢測PI3K/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路靶蛋白 提取細胞總蛋白,使用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度。非磷酸化蛋白AKT、PI3K、PTEN、GSK3(α/β)、mTOR和磷酸化蛋白p-GSK3(α/β)、p-AKT、p-PTEN、p-PI3K、p-mTOR抗體稀釋比例均為1∶500。

1.2.4雞胚尿囊絨毛膜(CAM)血管生成實驗 白皮受精雞蛋清洗消毒,分為實驗組和對照組,每組隨機10只雞蛋。37.5 ℃、濕度60%,孵育5 d,75%乙醇消毒氣室端蛋殼,用尖嘴鑷形成0.5 cm×0.5 cm小孔,形成假氣室。75%乙醇消毒,滴2～3滴生理鹽水將氣室膜和CAM分離開,去除氣室膜,暴露CAM。用基質膠將各組細胞制成懸液,分別加入CAM,命名為實驗組(BIU87-ANGH114R、BIU87-ANGH13R、BIU87-ANG)和對照組(BIU87-C1)。繼續孵育72 h。小孔中加入甲醇和丙醇等體積混合液3 mL,室溫固定15 min,將固定后的CAM剪下,風干并拍照。

1.2.5小管形成實驗 取預冷的96孔板,每孔加入解凍的ECM膠50 μL,37 ℃孵育30 min,使ECM溶液形成凝膠。每孔加入150 μL細胞懸浮液(1.5～3.0)×104個/毫升到固化的ECM凝膠上,37 ℃孵育10 h。高倍視野下用光學顯微鏡檢查內皮管。

1.2.6過表達RI對ANG及其突變體促核糖體RNA(rRNA)轉錄活性的影響

1.2.6.1構建熒光素酶報告基因載體 以基因組DNA為模板,擴增rRNA啟動子序列,上游引物:5′-CGGGGTACCGCGGTCCCTCTGCCGCGA-3′;下游引物:5′-CCCAAGCTTAGCGCGACCTCTCGGGC C-3′。PCR條件:94 ℃,2 min;94 ℃,30 s,63 ℃,30 s,72 ℃,100 s,30個循環;72 ℃延伸5 min。KpnⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定。

1.2.6.2雙熒光素酶報告基因系統檢測rRNA轉錄活性 96孔板中加入與孔中培養基相等體積的Dual-Glo?試劑,等待10 min,在發光儀中測量螢火蟲熒光素酶的發光;向每個孔中加入與原培養基體積相等的Dual-Glo?Stop&Glo?試劑并混合,等待10 min,然后檢測海腎熒光素酶發光;海腎熒光素酶發光應按與螢火蟲熒光素酶發光相同的板序讀取。計算實驗報告發光與對照報告發光的比值。

1.3統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行數據處理和分析。多組間比較采用方差分析,組內比較采用LSD-t檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1ANG突變質粒(pCMV-3×flag-ANGH13R、pCMV-3×flag-ANGH114R)構建成功 瓊脂糖凝膠電泳結果顯示,pCMV-3×flag質粒大小約為6 400 bp,ANG突變體大小約為500 bp,與PCR結果吻合(圖1)。測序結果分析也表明,在特定位置發生突變,突變體構建成功(圖2)。

注:1為Marker;2為pCMV-3×flag-ANGH13R;3為pCMV-3×flag-ANGH114R;4為pCMV-3×flag-ANG;5為pCMV-3×flag;6為Marker。圖1 pCMV-3×flag-ANGH13R、pCMV-3×flag-ANGH114R突變體質粒的酶切鑒定

注:A為pCMV-3×flag-ANGH13R測序鑒定圖;B為pCMV-3×flag-ANGH114R測序鑒定圖。圖2 pCMV-3×flag-ANGH13R、pCMV-3×flag-ANGH114R測序鑒定

2.2穩定轉染ANG及其突變體的膀胱癌BIU87細胞系構建成功 各組穩定轉染細胞系都屬于pEGFP-C1 系列帶有綠色熒光,可直接用熒光顯微鏡觀察細胞系表達情況,表明各組穩定轉染細胞系構建成功。見圖3。

注:A為BIU87-ANGH13R;B為BIU87-ANGH114R;C為BIU87-ANG;D為BIU87-C1。圖3 穩定轉染ANG及其突變體的膀胱癌BIU87細胞系

2.3Western blot檢測信號通路中的靶蛋白 結果顯示,與對照組比較,實驗組p-PI3K、p-AKT、p-GSK3(α/β)、p-mTOR、p-PTEN的表達增加,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

注:A、C為各蛋白的Western blot結果;B、D為各蛋白的統計分析結果;與BIU87-C1比較,aP<0.05。圖4 過表達RI調控ANG促PI3K/AKT/mTOR信號通路磷酸化水平

2.4ANG及突變體促進CAM血管生成和小管形成 CAM血管生成實驗和小管形成實驗結果均顯示,實驗組(BIU87-ANGH13R、BIU87-ANGH114R、BIU87-ANG)CAM血管生成及小管形成均明顯多于對照組(BIU87-C1),表明實驗組ANG及其突變體可促進腫瘤血管生成。見圖5。

注:A為實驗組和對照組小管形成實驗結果;B為實驗組和對照組小管形成實驗統計分析結果;C為實驗組和對照組CAM血管形成實驗結果;D為實驗組和對照組CAM血管形成實驗統計分析結果;與BIU87-C1比較,aP<0.05。圖5 ANG及其突變體對膀胱癌腫瘤小管形成及CAM血管生成的影響

2.5RI抑制ANG及其突變體促核糖體RNA的轉錄活性 運用雙熒光素酶報告基因檢測系統對rRNA轉錄活性檢測結果表明,RI抑制ANG及其突變體促核糖體RNA的轉錄活性,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

注:A為BIU87-ANG組雙熒光素酶相對熒光活性;B為BIU87-ANGH13R組雙熒光素酶相對熒光活性;C為BIU87-ANGH114R組雙熒光素酶相對熒光活性;與PGL3-Basic-rRNA+PRL-TK比較,aP<0.05;與pcDNA3.1(-)-myc-RI&BIU87-ANG比較,bP<0.05。圖6 RI抑制ANG及其突變體促核糖體RNA的轉錄活性

3 討 論

ANG是一種重要的促進血管生成的作用因子,在淋巴管和血管生長成熟中起關鍵作用,由纖維蛋白原樣結構、蛋白信號肽、螺旋結構域三部分組成。目前發現4個亞型[9],分別是ANG-1、ANG-2、ANG-3、ANG-4。ANG-1是 Tie2 的激動劑,與Tie2結合后能激活并誘導其磷酸化,促進血管的內皮細胞形成管狀結構,增加結構穩定性;吸引血管周圍細胞支持,包圍內皮細胞,促進血管重新塑造,以維持血管完整性[10]。ANG-2約有60%與ANG-1相同,機體胚胎發育時其主要在肝血管壁和大血管平滑肌中表達,而處于成體時其主要在胎盤、子宮和卵巢中表達,通過抑制ANG-1活化的程度,開始調節內分泌環路,維持血管的生長及退化的動態平衡,在缺氧情況下可促進其表達[11]。目前,關于ANG-3、ANG-4的研究較少。在ANG的123個殘基蛋白質中包含許多重要的生物活性位點,比如核轉位序列、核受體結合位點、RNase活性中心等,此類位點可能與ANG的未知生物功能相關[12]。本研究針對核轉位序列將ANG基因13位和114位的氨基酸由組氨酸突變為精氨酸,目的是初步探索ANG的生物特性,為進一步了解ANG促進膀胱癌腫瘤血管生成和腫瘤細胞增殖的研究做準備。

研究表明,血管生成及新血管的形成對實體瘤的生長轉移起非常重要的作用,新生成的血管可為實體腫瘤的生長和轉移提供豐富的氧氣和營養物質,為腫瘤細胞的轉移和免疫細胞的滲透提供通道,并且能帶走腫瘤細胞產生的廢物[13]。在沒有新生血管形成時,實體腫瘤長到1～2 mm3時,腫瘤減小消退,甚至消失。在腫瘤的早期階段,新生血管形成較少且緩慢,腫瘤處于休眠狀態,當促血管生成因子占據優勢時血管形成活躍,誘導新生血管形成,是腫瘤血管化的啟動標志[14]。外源性試驗抑制血管的生成可以明顯地抑制腫瘤的生長,甚至可以使腫瘤消退,所以新生血管對于腫瘤的生長和轉移發揮巨大作用。所有的實體腫瘤生長和轉移都依賴于新生血管的形成,這個特征為實體腫瘤的診斷和治療提供了一個新的方向。

本研究構建了pCMV-3×flag-ANGH13R、pCMV-3×flag-ANGH114R兩個突變體質粒用于初步探索ANG的生物學功能,研究結果表明,ANG及上述兩個突變體能促進小管的形成,在CAM血管形成實驗中促進血管生成,實驗組(BIU87-ANGH13R、BIU87-ANGH114R、BIU87-ANG)CAM血管生成及小管形成均明顯多于對照組(BIU87-C1),表明ANG及其突變體可促進腫瘤血管生成。相關報道表明,ANG可通過PI3K/AKT/mTOR信號通路刺激rRNA轉錄和核糖體生物合成,其雙重作用為腫瘤的治療提供了方向[15]。PI3K/AKT/mTOR是一個經典的信號通路,影響細胞凋亡和腫瘤細胞生存,調節細胞增殖及分化[16]。ANG和PI3K/AKT/mTOR信號通路中的AKT交互應答,ANG激活AKT,激活的AKT促進ANG的核轉位[16]。mTOR作為PI3K/AKT/mTOR信號通路下游的一個效應器,AKT能直接激活mTOR的磷酸化反應。ANG誘導AKT的磷酸化,可促進傷口愈合和CAM血管的生成。ANG不僅能促進PI3K/AKT磷酸化并激活AKT傳導通路,還能使GSK-3β、mTOR蛋白磷酸化,磷酸化可抑制其生物學作用。ANG可通過PI3K/AKT/mTOR信號通路參與腫瘤血管的發生發展。前期研究證實,RI與ANG相互作用抑制BALB/C裸鼠人膀胱癌移植瘤的生長轉移,同時抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路中磷酸化蛋白的水平[17]。也有研究顯示,Ang/Tie2 信號通路與結直腸癌[18]、黑色素瘤[19]、乳腺癌[20]等腫瘤的發生發展存在密切聯系,這也為下一步研究拓展了方向。

本研究尋找到ANG中H13R和H114R兩個可能的突變位點,它們通過PI3K/AKT/mTOR通路影響其促血管生成特性,為探索ANG在膀胱癌中的分子機制提供理論依據。目前研究結果表明,本研究ANG突變體基本達到預期的效果,筆者將在后續實驗中繼續探索ANG的生物學功能。