番茄紅素調節AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路對過敏性結膜炎小鼠的治療作用

潘英芬,金延強,劉艷雪,倪麗麗,劉 斐

山東省泰安市婦幼保健院:1.眼科;2.中醫科,山東泰安 271000

過敏性結膜炎(AC)是一種在成人和兒童間都流行的免疫性過敏疾病,可對患者視力造成不可逆的傷害[1]。AC在臨床上主要表現為眼部瘙癢、紅腫等癥狀,因個人免疫能力不同,每個人發病癥狀有所不同,嚴重者甚至導致角膜炎并發癥的發生,影響人的視力[2]。番茄紅素(LYC)是一種類胡蘿卜素,具有抗氧化、抗炎、保護心臟、抗腫瘤、抗菌、免疫調節等活性[3-5]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/沉默信息調節因子1(SIRT1)/核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路是調節炎癥反應的關鍵通路,激活AMPK的磷酸化水平可以促進SIRT1表達,減輕過敏導致的氣道炎癥[6];AMPK/SIRT1通路的活化還可抑制NF-κB磷酸化,進而減輕脂多糖誘導的炎癥反應[7]。研究發現,LYC減輕骨關節炎炎癥反應的作用與抑制NF-κB炎癥通路活化,同時降低促炎因子水平有關[8]。鑒于LYC的抗炎作用,本研究推測LYC可能通過調節AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路減輕AC小鼠炎癥反應,并建立AC小鼠模型進行探討。

1 材料與方法

1.1材料 選用BALB/c小鼠(雄性),周齡6～8周,體重18～20 g,共60只,購自廣東藥康生物科技有限公司,許可證號:SCXK(粵)2020-0054。所有小鼠均飼養于本院的動物實驗中心,國家標準飼料喂養,自由飲水,適應性飼養1周,觀察無異常后用于后續實驗。

1.2儀器與試劑 LYC購自上海麥克林生化科技有限公司;卵清蛋白(OVA)購自艾柏森(北京)生物科技有限公司;蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、IL-17、IL-10、轉化生長因子(TGF)-β、免疫球蛋白(Ig)E和胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司;磷酸化AMPK(p-AMPK)、AMPK、SIRT1、NF-κB p65抗體購自艾博抗(上海)貿易有限公司。

光學顯微鏡購自奧林巴斯(中國)有限公司;冷凍離心機購自美國貝克曼庫爾特公司;多功能酶標儀購自美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.3方法

1.3.1分組與造模 采用OVA致敏方式誘導AC小鼠模型建立[9]。造模開始第1天和第7天通過腹腔注射200 μL OVA與Al(OH)3佐劑比例為1∶50的混合溶液,第10～15天向小鼠每只眼睛滴加含有OVA 250 g的溶液激發致敏。造模后將小鼠分為模型組(AC組)、LYC低組(5 mg/kg)、LYC中組(10 mg/kg)、LYC高組(20 mg/kg)[10],LYC高+AMPK抑制劑(CC,0.2 mg/kg)[11]組,另設置未處理的小鼠作為正常組(NC組),每組10只。LYC低、中、高組按照對應劑量灌胃給藥,LYC高+CC組給予對應劑量CC灌胃給藥,AC組和NC組給予生理鹽水灌胃,連續給藥10 d。

1.3.2眼周情況觀察 在最后一次施用OVA 20 min后,觀察小鼠眼周是否出現眼瞼水腫、結膜水腫及充血、溢淚等現象,出現上述情況視為造模成功。

1.3.3標本采集 小鼠麻醉處死后,將雙眼結膜分離取出;腹主動脈取血,室溫靜置2 h,離心保留上清液備用;剪開腹部后,完整剝離脾臟備用。

1.3.4小鼠眼部結膜病理學變化觀察 將1.3.3取得的左眼結膜進行固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等操作,HE染色后,顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5流式細胞儀檢測脾臟中Th17、Treg細胞比例 將1.3.3剝離的脾臟用PBS沖洗數次后,液氮研磨,勻漿后,離心棄上清液,加入紅細胞裂解液,靜置5 min后加入PBS,離心棄上清液,最后加入PBS重懸細胞,制備脾單細胞懸液。將脾單細胞懸液調整至1×107個,在37 ℃、CO2恒溫培養4 h后,加入Anti-CD4-FITC,4 ℃培養30 min;加入Permeabilization buffer混勻,4 ℃培養30 min;加入Anti-IL-17A-PE,4 ℃避光孵育30 min;上機檢測Th17細胞(CD4+IL-17A+)比例。另外,加入Anti-CD4-FITC、Anti-CD25-APC,4 ℃避光孵育20 min;加入Permeabilization buffer混勻,4 ℃避光孵育30 min;加入Anti-FOXP3-PE,4 ℃避光孵育30 min;上機檢測Treg細胞(CD4+CD25+FOXP3+)比例。

1.3.6血清炎癥因子水平檢測 采用ELISA試劑盒檢測血清中IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β的水平,按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.7小鼠血清中IgE和TSLP水平檢測 采用ELISA試劑盒檢測血清中IgE、TSLP水平,按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.8小鼠結膜組織中p-AMPK、SIRT1、NF-κB p65蛋白檢測 蛋白質印跡法(Western blot)檢測右眼結膜組織中p-AMPK、SIRT1、NF-κB p65蛋白水平,將結膜組織液氮研磨勻漿后加入裂解液提取總蛋白,然后電泳、轉膜、封閉后加入一抗p-AMPK(1∶1 000)、SIRT1(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000),內參β-actin(1∶1 000),4 ℃孵育12 h,PBS洗膜后加入二抗(1∶2 000),室溫孵育2 h后,ECL顯色,利用條帶灰度值分析蛋白表達。

2 結 果

2.1小鼠造模指標觀察 NC組小鼠結膜未出現明顯充血、水腫,眼瞼正常,無溢淚現象;AC組小鼠眼部周圍分泌物增多,有溢淚,結膜充血、水腫現象明顯,抓撓次數頻繁;LYC低、中、高組小鼠隨著LYC濃度增加,結膜水腫充血、分泌物多、溢淚現象逐漸減弱;LYC高+CC組小鼠眼周特征與AC組基本一致。見圖1。

注:A、B、C、D、E、F分別為NC組、AC組、LYC低組、LYC中組、LYC高組、LYC高+CC組小鼠眼周情況。圖1 小鼠眼周情況觀察

2.2小鼠結膜組織病理學變化 NC組小鼠細胞排列整齊,無破裂和炎癥細胞浸潤;AC組小鼠結膜組織出現明顯的炎癥浸潤,主要表現為嗜酸性粒細胞數量增多;LYC低、中、高組小鼠隨著LYC濃度的增大,炎癥細胞浸潤逐漸減輕,嗜酸性粒細胞數量較AC組減少,細胞紊亂破裂減輕;LYC高+CC組小鼠病理學變化與AC組相近。見圖2。

注:A、B、C、D、E、F分別為NC組、AC組、LYC低組、LYC中組、LYC高組、LYC高+CC組小鼠結膜組織染色情況。圖2 小鼠結膜組織HE染色(×200)

2.3LYC對小鼠脾臟中Th17、Treg細胞比例的影響 與NC組比較,AC組小鼠脾臟中Th17細胞比例升高,Treg細胞比例降低(P<0.05);與AC組比較,LYC中、高組小鼠脾臟中Th17細胞比例降低,Treg細胞比例升高(P<0.05),LYC低組小鼠脾臟中Th17細胞、Treg細胞比例有所變化,但差異無統計學意義(P>0.05),LYC高+CC組小鼠脾臟Th17細胞、Treg細胞比例差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠脾臟中Th17、Treg細胞比例

2.4各組小鼠血清炎癥因子水平比較 與NC組比較,AC組小鼠血清中IL-6、IL-17水平升高,IL-10、TGF-β水平降低(P<0.05)。與AC組比較,LYC中、高組小鼠血清中IL-6、IL-17水平降低,IL-10、TGF-β水平升高(P<0.05);LYC低組小鼠血清中IL-6、IL-17水平有所降低,IL-10、TGF-β水平有所升高,但差異無統計學意義(P>0.05);LYC高+CC組小鼠血清中上述炎癥因子水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血清炎癥因子水平比較

2.5各組小鼠血清IgE、TSLP水平比較 與NC組比較,AC組小鼠血清中IgE、TSLP水平升高(P<0.05)。與AC組比較,LYC中、高組小鼠血清中IgE、TSLP水平降低(P<0.05),LYC低組、LYC高+CC組小鼠血清中IgE、TSLP水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠血清IgE、TSLP水平比較

2.6各組小鼠結膜組織AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路蛋白水平比較 與NC組比較,AC組小鼠結膜組織p-AMPK、核NF-κB p65蛋白水平升高,SIRT1水平降低(P<0.05)。與AC組比較,LYC中、高組小鼠結膜組織p-AMPK、SIRT1水平升高,核NF-κB p65水平降低(P<0.05);LYC低組小鼠結膜組織p-AMPK、SIRT1水平有所升高,核NF-κB p65水平有所降低,但差異無統計學意義(P>0.05);LYC高+CC組小鼠結膜組織p-AMPK、SIRT1、核NF-κB p65水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、表4。

表4 各組小鼠結膜組織AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路蛋白水平比較

圖3 各組小鼠結膜組織AMPK/SIRT1/NF-κB通路蛋白水平

3 討 論

AC是臨床常見的過敏性疾病之一,病程通常延長反復,影響患者正常生活,管理不當會引發視力不可逆受損[12]。嗜酸性粒細胞在AC等過敏性免疫疾病中發揮重要作用,其增多是過敏性疾病的標志表型[13];也是導致AC患者結膜組織受損的主要原因[14]。本研究采用OVA誘導建立AC小鼠模型,觀察到AC組小鼠有眼部溢淚,結膜充血水腫,頻繁抓撓等現象,且HE染色顯示嗜酸性粒細胞增多,炎癥細胞浸潤明顯,說明造模成功。LYC具有免疫調節、抗炎作用[5]。本研究中,LYC中、高組小鼠結膜腫脹、嗜酸性粒細胞增多等病變明顯減輕,表明LYC對AC小鼠有治療作用。

Th17/Treg平衡對人體免疫穩態至關重要,Th17/Treg失衡會導致免疫紊亂,引起炎癥入侵[15]。Th17細胞可大量分泌與炎癥疾病密切相關的促炎因子IL-17、IL-6;Treg細胞則分泌具有負向免疫調節作用的TGF-β和抑制性炎癥細胞因子IL-10[16]。Th17/Treg在免疫表達中相互拮抗,維持機體免疫平衡[17]。IgE常常介導過敏性疾病的發生發展,IgE高表達會激活肥大細胞,引起組織腫脹[18]。TSLP是與過敏性疾病相關的關鍵調節因子,可響應蛋白酶過敏原刺激而合成,通常在過敏性疾病中高表達[19-20]。本研究中,與NC組比較,AC組小鼠脾臟中Th17細胞比例升高,Treg細胞比例降低,Th17/Treg平衡偏向Th17細胞;血清中IL-17、IL-6水平升高,TGF-β、IL-10水平降低,與Th17/Treg失衡一致;血清中IgE、TSLP水平均明顯升高,這些變化均與小鼠響應OVA刺激致敏有關。經過LYC中、高劑量處理后,Th17/Treg趨向平衡,IL-17、IL-6、IgE、TSLP水平均降低,TGF-β、IL-10水平均升高,表明LYC可以調節Th17/Treg平衡,維持機體免疫內穩態,對于IgE和TSLP有負向調節作用,提示LYC的免疫調節、抗炎作用可能是其治療AC小鼠的機制。

AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路為炎癥免疫相關通路之一,AMPK的磷酸化可促進SIRT1表達,進一步抑制NF-κB入核活化,減輕炎癥反應[21]。研究發現,在預防Th17/Treg失衡中AMPK/SIRT1通路也發揮著重要作用,主要表現為通路的激活有利于維持Th17/Treg平衡[22]。AMPK/SIRT1通路的激活可以減輕胰腺炎的全身炎癥反應[23];SIRT1高表達可以抑制因NF-κB活化引起的炎癥因子的釋放,減輕機體炎癥反應[24]。在本研究中,AC組小鼠AMPK磷酸化以響應OVA刺激,SIRT1表達下調導致NF-κB p65入核增加,與Th17/Treg失衡和炎癥因子高表達現象一致。經過LYC處理后AMPK磷酸化水平進一步提高,同時促進SIRT1高表達,進而抑制NF-κB入核活化,減少炎癥因子釋放,表明LYC可促進AC小鼠AMPK/SIRT1通路活化,抑制NF-κB通路活化。進一步采用CC處理后,研究顯示,CC可抵消LYC對AC小鼠的上述保護作用。

綜上所述,LYC可減輕AC小鼠的過敏和炎癥反應,維護機體免疫平衡,可能與促進AMPK/SIRT1通路活化,抑制NF-κB通路活化有關。