川楝素抑制AKT/GSK-3β/β-catenin通路對惡性黑色素瘤細胞增殖、凋亡和上皮間質轉化的影響

皮慶友,趙 媛,陳 璐

山東省立第三醫院皮膚科,山東濟南 250031

惡性黑色素瘤(MM)是一種起源于黑色素細胞且惡性程度極高的腫瘤,已經成為世界上發病率增長最快的惡性腫瘤之一[1]。MM可發生于皮膚、黏膜、內臟等部位,特別是在易摩擦部位具有更高發病率和致命性[2]。目前手術切除惡性組織認為是治療MM的最佳療法,但其具有較高的復發率和死亡率,因此探尋MM的發病機制以尋求更好的治療手段迫在眉睫。上皮間質轉化(EMT)可使上皮細胞轉化為間充質細胞,導致多種惡性腫瘤包括MM的遷移與侵襲[3]。蛋白激酶B(AKT)可調節EMT過程,糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是AKT的下游靶基因,受磷酸化AKT(p-AKT)調節,進而影響信號通路分子β-鏈環蛋白(β-catenin)參與一系列細胞進程,介導EMT的發生[4]。已有研究證明,通過抑制AKT/GSK-3β/β-catenin通路的活化可抑制胃癌細胞EMT過程[5]。川楝素(TSN)是三萜類化合物,具有鎮痛、抗炎、抗腫瘤等作用,其中TSN能通過抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞EMT等多方面發揮抗腫瘤效果[6]。已有研究表明,TSN通過抑制AKT/GSK-3β/β-catenin通路來抑制結直腸癌細胞的生長并誘導其凋亡[7]。然而,關于TSN對MM細胞的作用及其機制的報道較少,因此本研究對此進行分析。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人惡性黑色素瘤細胞A375購自美國ACCT細胞庫。

1.2儀器與試劑 TSN(純度≥99%)購自中國食品藥品檢定研究院;胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、DMEM培養基購自美國Gibco公司;AKT激活劑(SC79)、GSK-3β抑制劑(CP21R7)購自美國Selleck Chemicals公司;CCK-8檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒購自上海碧云天公司;Transwell小室購自美國Coster公司;TRIzol試劑盒購自沈陽萬類生物公司;一抗B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(C-caspase-3)、波形蛋白(Vimentin)、上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經鈣黏蛋白(N-cadherin)、AKT、p-AKT Ser473、GSK-3β、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β) Ser9、β-catenin和β-微管蛋白(β-actin)抗體購自美國賽默飛公司;二抗山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)購自美國Santa公司。流式細胞儀購自北京安諾倫公司;光學倒置顯微鏡購自德國Zeiss公司;蛋白電泳儀購自美國Bio-rad公司;全自動酶標儀購自上海天能公司。

1.3方法

1.3.1細胞復蘇培養 將A375細胞在添加10% PBS的DMEM培養基中培養,并置于37 ℃、5% CO2培養箱中,當細胞復蘇至80%時,胰蛋白酶消化傳代,每2～3天傳代一次。

1.3.2細胞毒性試驗 將A357細胞接種于96孔板中,每孔5×103個細胞,培養24 h后,用不同濃度(0、1、5、10、20、40、60 μmol/L)的TSN處理細胞,繼續培養24 h后,加入10% CCK-8溶液(10 μL)在37 ℃孵育2 h,酶標儀于450 nm處測量吸光度,計算細胞活力和半數抑制濃度(IC50)。

1.3.3細胞分組與處理 將細胞分為5組,對照(NC)組(正常培養)、TSN低劑量組(10 μmol/L)、TSN中劑量組(20 μmol/L)、TSN高劑量組(40 μmol/L)[8]、SC79組(TSN 40 μmol/L+SC79 10 nmol/L)、SC79+CP21R7組(TSN 40 μmol/L+SC79 10 nmol/L+CP21R7 10 nmol/L)。

1.3.4流式細胞術檢測細胞凋亡 將處理過的各組細胞分別接種于6孔板中,每孔5×105個細胞,培養24 h,PBS沖洗兩遍后,按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒說明書逐步進行染色,用流式細胞儀檢測細胞凋亡,確定細胞凋亡率。

1.3.5劃痕實驗檢測細胞遷移 將處理過的各組細胞分別接種于6孔板中,每孔5×105個細胞,培養24 h,用200 μL移液器槍頭進行“一”線性劃痕,在顯微鏡下觀察0 h和24 h的劃痕寬度,記為W0和W24,遷移率=(W0-W24)/W0×100%。

1.3.6Transwell實驗檢測細胞侵襲 將基質膠包被在Transwell小室底膜上室,接種處理后的各組細胞(5×104個/毫升),下室加入含有10 % FBS的DMEM培養基,在37 ℃、5% CO2中培養24 h。取出Transwell小室,棄去上室培養基,擦去上室細胞后,PBS洗滌、多聚甲醛固定、結晶紫染色,在光學倒置顯微鏡下計數。

1.3.7蛋白質印跡法(Western blot)檢測 將各組細胞破碎后提取總蛋白,用BCA試劑盒進行定量,按步驟將蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜,于5%脫脂奶粉中封閉2 h,在4 ℃下加入一抗Bcl-2、Bax、C-caspase-3、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin(1∶2 000)和β-actin 4 ℃孵育過夜,清洗,在室溫下加入二抗山羊抗兔IgG(1∶1 000),孵育2 h。用ECL發光顯影,觀察并拍照。各條帶灰度值用Image J軟件處理分析。

2 結 果

2.1TSN對A357細胞的毒性作用 CCK-8結果顯示,與無TSN(0 μmol/L)時比較,A357細胞活力隨著TSN濃度的升高而逐漸降低(P<0.05),見表1。TSN對A357細胞的IC50為43.67 μmol/L。因此,選擇10、20和40 μmol/L作為后續TSN的實驗濃度。

表1 不同濃度TSN對A357細胞的毒性作用

2.2各組細胞凋亡情況 與NC組比較,TSN低劑量組、TSN中劑量組、TSN高劑量組細胞凋亡率升高(P<0.05);與TSN高劑量組比較,SC79組細胞凋亡率降低(P<0.05);SC79+CP21R7組與TSN高劑量組細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05);與SC79組比較,SC79+CP21R7組細胞凋亡率升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞凋亡率比較

2.3各組細胞凋亡和EMT相關蛋白水平比較 與NC組比較,TSN低劑量組、TSN中劑量組、TSN高劑量組Bcl-2、N-cadherin、Vimentin水平降低,Bax、C-caspase-3、E-cadherin水平升高(P<0.05);與TSN高劑量組比較,SC79組Bcl-2、N-cadherin、Vimentin水平升高,Bax、C-caspase-3、E-cadherin水平降低(P<0.05);SC79+CP21R7組與TSN高劑量組各蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05);與SC79組比較,SC79+CP21R7組Bcl-2、N-cadherin、Vimentin蛋白水平降低(P<0.05),Bax、C-caspase-3、E-cadherin水平升高(P<0.05)。見圖1、表3。

注:A為NC組;B為TSN低劑量組;C為TSN中劑量組;D為TSN高劑量組;E為SC79組;F為SC79+CP21R7組。圖1 各組細胞凋亡和EMT相關蛋白水平變化

表3 各組細胞凋亡和EMT相關蛋白水平比較

2.4各組細胞遷移能力比較 與NC組比較,TSN低劑量組、TSN中劑量組、TSN高劑量組細胞劃痕愈合率降低(P<0.05);與TSN高劑量組比較,SC79組細胞劃痕愈合率升高(P<0.05);SC79+CP21R7組與TSN高劑量組劃痕愈合率差異無統計學意義(P>0.05);與SC79組比較,SC79+CP21R7組細胞劃痕愈合率降低(P<0.05)。見圖2、表4。

注:A1、A2為NC組;B1、B2為TSN低劑量組;C1、C2為TSN中劑量組;D1、D2為TSN高劑量組;E1、E2為SC79組;F1、F2為SC79+CP21R7組。圖2 劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力

表4 各組細胞劃痕愈合率比較

2.5各組細胞侵襲能力比較 與NC組比較,TSN低劑量組、TSN中劑量組、TSN高劑量組細胞侵襲數目減少(P<0.05);與TSN高劑量組比較,SC79組細胞侵襲數目增加(P<0.05);SC79+CP21R7組與TSN高劑量組細胞侵襲數目差異無統計學意義(P>0.05);與SC79組比較,SC79+CP21R7組細胞侵襲數目減少(P<0.05)。見圖3、表5。

注:A為NC組;B為TSN低劑量組;C為TSN中劑量組;D為TSN高劑量組;E為SC79組;F為SC79+CP21R7組。圖3 各組細胞侵襲能力比較(結晶紫染色,×200)

表5 各組細胞侵襲能力比較個)

2.6各組細胞通路蛋白水平比較 與NC組比較,TSN低劑量組、TSN中劑量組、TSN高劑量組p-AKT Ser473、p-GSK-3β Ser9、β-catenin蛋白水平降低(P<0.05);與TSN高劑量組比較,SC79組p-AKT Ser473、p-GSK-3β Ser9、β-catenin蛋白水平升高(P<0.05);SC79+CP21R7組與TSN高劑量組各蛋白水平差異無統計學意義(P>0.05);與SC79組比較,SC79+CP21R7組pAKT Ser473、p-GSK-3β Ser9、β-catenin蛋白水平降低(P<0.05)。見圖4、表6。

注:A為NC組;B為TSN低劑量組;C為TSN中劑量組;D為TSN高劑量組;E為SC79組;F為SC79+CP21R7組。圖4 各組細胞通路蛋白水平比較

表6 各組細胞通路蛋白水平比較

3 討 論

MM是皮膚癌致死的主要原因,目前MM的標準治療方法主要包括化療、放療、免疫治療和生物治療,但因其侵襲性強、預后差、對化療或放療耐藥等特征,治療效果并不理想,因此應積極探索新的藥物和治療方法[9]。Bcl-2與Bax是兩個凋亡相關的調節蛋白,Bcl-2作為抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白Bax共同作用,決定細胞是否凋亡;caspase-3是caspase家族直接誘導細胞凋亡的蛋白之一,間接影響其他凋亡因子誘導細胞凋亡[10]。TSN在誘導細胞周期停滯和凋亡、抑制多種癌癥方面具有良好的作用。時俊宇等[11]發現,TSN能體外抑制人卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移和侵襲的作用。此外,SHAO等[12]發現,TSN誘導MKN-45人胃癌細胞凋亡是通過介導Bcl-2的激活來實現的。同時,WANG等[13]發現,TSN還可以抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移,促進細胞凋亡。因此,TSN是一種療效顯著的抗腫瘤藥物,然而其在MM治療中的作用機制尚未闡明。本研究中,TSN可抑制MM細胞活力,促進凋亡,使Bcl-2蛋白表達水平降低,Bax、C-caspase-3水平升高,與上述研究報道一致。

EMT在腫瘤侵襲和轉移過程中起著至關重要的作用,特別是在早期階段。在EMT過程中,細胞失去上皮特性獲得間充質特性,其分子機制與上皮標志物E-cadherin的下調和間充質標志物N-cadherin、Vimentin的上調有關,細胞間黏附能力降低導致腫瘤細胞遷移和侵襲性增強[14]。EMT是一種可逆的生物學過程,可以調節人類MM細胞的遷移和侵襲。MM細胞在未發生侵襲和遷移時,E-cadherin高表達,細胞間黏附性較強,可阻止MM細胞逃逸;當發生侵襲和遷移時,N-cadherin、Vimentin高表達,E-cadherin則低表達,MM細胞向周圍轉移擴散[15]。向桂瓊等[16]發現,全反式維甲酸能抑制MM細胞的侵襲、轉移,其機制與抑制EMT現象有關。LI等[17]發現,燈盞花乙素可通過抑制EMT來抑制MM細胞的遷移、侵襲。因此,EMT有可能成為治療MM的途徑。TSN作為抗腫瘤藥物能抑制細胞EMT過程,如TSN通過抑制EMT來抑制人卵巢癌細胞的遷移和侵襲[18]。在本研究中,TSN治療后劃痕愈合率、細胞侵襲能力、N-cadherin、Vimentin蛋白水平降低,E-cadherin水平升高,表明TSN有可能抑制間充質標志物N-cadherin、Vimentin蛋白表達,提高E-cadherin蛋白水平,來減少EMT發生。

Wnt/β-catenin通路能影響癌細胞增殖和轉移,且在不同腫瘤中誘導EMT,是EMT的關鍵途徑[19]。GSK-3β是Wnt/β-catenin通路的關鍵因子,可直接調節β-catenin蛋白在細胞質中的穩定性[20]。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,參與細胞存活、分化和運動,其中AKT通過磷酸化Ser9位點使GSK-3β的非活性形式激活,影響β-catenin的穩定,導致β-catenin的積累和易位,從而促進惡性癌細胞EMT過程的發展[21]。已有研究發現,TSN通過AKT/GSK-3β/β-catenin通路影響細胞的增殖和凋亡[7]。在本研究中,TSN能同時降低p-AKT Ser473、p-GSK-3β Ser9、β-catenin蛋白的表達,而AKT激動劑SC79升高p-AKT Ser473、p-GSK-3β Ser9、β-catenin蛋白的表達,減弱TSN對MM細胞增殖的抑制,降低凋亡率,增強侵襲和遷移能力,促進EMT進程。GSK-3β抑制劑CP21R7與TSN、SC79共同作用,能拮抗SC79對TSN治療的抑制作用,促進MM細胞凋亡,抑制細胞增殖、遷移、侵襲和EMT的發生。

綜上所述,TSN能抑制MM細胞增殖,促進凋亡,抑制EMT發生,其作用機制可能與抑制AKT/GSK-3β/β-catenin通路激活有關。本研究為治療MM提供了新的方法和思路,但缺少體內和臨床試驗,后續需繼續探索。