血清外泌體LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3在AFP陰性肝細(xì)胞癌患者中的表達(dá)及臨床預(yù)后價值*

武彩虹,錢成榮,銀廣悅,侯學(xué)伶,韓玉成,田雪梅

河北中石油中心醫(yī)院檢驗科,河北廊坊 065000

肝癌是全世界第五大常見惡性腫瘤,死亡率位于所有腫瘤的第4位[1]。肝細(xì)胞肝癌(HCC)是肝癌最常見的病理類型,由于HCC患者早期癥狀不明顯,當(dāng)出現(xiàn)腹痛、黃疸等癥狀時,多已處于中晚期,患者5年生存率僅為15.7%[2]。目前HCC的預(yù)后主要依據(jù)腫瘤分期、血清甲胎蛋白(AFP)等進(jìn)行綜合評估,但臨床中僅有60%～70%的HCC患者血清AFP水平升高,并且由于腫瘤的異質(zhì)性,相同腫瘤分期的HCC患者預(yù)后差異較大[3]。因此,有必要尋找新的有效評估AFP陰性HCC(AFP-NHCC)患者的血清標(biāo)志物。外泌體是直徑<100 nm的細(xì)胞外囊泡,能夠在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)、DNA和各種形式的RNA,例如微小RNA、長鏈非編碼RNA(LncRNA RNA),它們參與機體生長發(fā)育、炎癥及腫瘤等多種病理生理學(xué)過程[4]。LncRNA RNA是長度在200～300個核苷酸的RNA分子,其可作為分子支架,調(diào)控下游癌基因的表達(dá),參與促進(jìn)HCC的腫瘤進(jìn)展[5]。LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3是近年來發(fā)現(xiàn)的外泌體來源的LNC RNA,是新的HCC早期診斷生物標(biāo)志物[6-7]。但目前LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3在HCC中的預(yù)后價值尚不清楚。本研究通過檢測AFP-NHCC患者血清外泌體LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3水平,分析二者與臨床病理特征的關(guān)系,探討二者的臨床預(yù)后價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年12月至2019年6月于本院就診并接受肝癌根治術(shù)的AFP-NHCC患者102例為AFP-NHCC組。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)過超聲、計算機斷層掃描或磁共振成像等影像學(xué)檢查及術(shù)后病理組織檢查確診為原發(fā)性HCC;(2)AFP<20 μg/L;(3)首次診治;(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)既往接受手術(shù)、放療、化療等治療;(2)其他病理類型的肝癌;(3)合并急性感染性疾病;(4)合并其他惡性腫瘤。其中男70例,女32例;年齡42～73歲,平均(62.34±5.90)歲;病理分化程度:高中分化54例,低分化48例;腫瘤最大徑:≤5 cm 72例,>5 cm 30例;腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目:<2個80例,≥2個22例;包膜完整63例,不完整39例;肝癌巴塞羅那臨床分期(BCLC分期):0～A期41例,B～C期61例;伴有肝內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例,無肝內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移64例。以同期于本院進(jìn)行體檢的體檢健康者80例作為對照組,其中男50例,女30例;年齡40～72歲,平均(61.18±6.10)歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準(zhǔn)通過。

1.2儀器與試劑 透射電鏡購自日本高新技術(shù)公司,型號HT7700;外泌體RNA分離提取試劑盒購自美國Invitrogen公司,型號R4319-02;外泌體反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京索萊寶公司,貨號RP1105,反轉(zhuǎn)錄引物由上海華大公司設(shè)計合成。

1.3方法

1.3.1外泌體分離,鑒定及外泌體RNA提取 取各組研究對象清晨空腹肘靜脈血5 mL,加入凝膠促凝管中,采血管37 ℃靜置30 min,血塊凝集后放置離心機上離心,3 000 r/min離心15 min,吸取上清液置于離心管中。取0.5 mL血清,加入0.25 mL外泌體沉淀試劑,混勻后4 ℃孵育30 min,沉淀外泌體,12 000 r/min離心15 min,去上清液,加入0.2 mL緩沖液,重懸收集外泌體。外泌體鑒定:取10 μL外泌體用100 μL PBS重懸,5%戊二醛固定,取10 μL稀釋標(biāo)本滴到碳涂層銅板上,浸入2%磷鎢酸30 s后,采用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)為雙圓盤結(jié)構(gòu)的囊泡,大小在30～200 nm。加入0.4 mL裂解液后,渦旋重懸外泌體,加入0.2 mL無RNA酶水和20 μL蛋白酶K,55 ℃孵育15 min,加入0.6 mL PCL2緩沖液渦旋后于4 ℃,12 000 r/min離心15 min,取外泌體懸液加入兩倍體積的無水乙醇,將混合液轉(zhuǎn)移到柱子上,12 000 r/min離心30 s,重復(fù)3次,將20 μL無RNA酶水加到柱子膜中央,靜置2 min后12 000 r/min離心1 min,獲得外泌體總RNA。

1.3.2實時熒光定量PCR(qPCR)檢測血清外泌體LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3 將外泌體總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。然后進(jìn)行qPCR檢測,LncRNA 00853引物正向序列:5′-AAAGGCTAGGCGATCCCACA-3′,反向序列:5′-ACTCCCTAGCTTGGCTCTCCT-3′;LncRNA FAM72D-3引物正向序列:5′-GGAGGG CAGAAGGAAGAAAACAG- 3′,反向序列:5′-CACTGTCCGTCTGTATGCGAG-3′;GAPDH正向序列:5′-CGGACGACTCGGGATGAGA-3′,反向序列:5′-GAGAGCTGCACGATCCAGTTG-3′。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性30 s,62 ℃退火40 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環(huán)。反應(yīng)體系:SYBR Premix 10 μL,上下游引物各1 μL,cDNA 2 μL和雙蒸水 7 mL。以GAPDH為內(nèi)參,血清外泌體LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3的表達(dá)采用2-ΔΔCt法表示。以LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3相對表達(dá)水平的平均值3.12,2.95作為臨界值,分為LncRNA 00853高表達(dá)組(n=52)和LncRNA 00853低表達(dá)組(n=50),LncRNA FAM72D-3高表達(dá)組(n=49)和LncRNA FAM72D-3低表達(dá)組(n=53)。

1.4隨訪 所有患者確診后開始進(jìn)行隨訪,每3個月隨訪一次,以電話或門診復(fù)查方式進(jìn)行,連續(xù)隨訪3年,隨訪截止時間2022年7月1日,隨訪終點為患者死亡或隨訪時間結(jié)束。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清外泌體LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3相對表達(dá)水平比較 AFP-NHCC組血清外泌體LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3相對表達(dá)水平分別為3.12±0.86、2.95±0.78,明顯高于對照組的1.22±0.36、1.16±0.28,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=17.546、19.552,P<0.05)。

2.2血清外泌體LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3與AFP-NHCC患者臨床病理特征的關(guān)系 血清外泌體LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3與AFP-NHCC患者BCLC分期、病理分化程度及肝內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),與性別、年齡、腫瘤最大徑、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目、包膜完整性無關(guān)(P>0.05),見表1。

表1 血清外泌體LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3與AFP-NHCC患者臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表1 血清外泌體LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3與AFP-NHCC患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3血清外泌體LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3對AFP-NHCC患者生存預(yù)后的影響 AFP-NHCC組患者隨訪3～36個月,隨訪期間死亡32例,失訪2例,中位生存時間為30.82個月(95%CI28.79～32.67)。LncRNA 00853高表達(dá)組患者中位生存時間為29.31個月(95%CI26.36～32.26)明顯低于低表達(dá)組患者的32.41個月(95%CI32.55～34.51),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-rankχ2=4.844,P=0.028)。LncRNA FAM72D-3高表達(dá)組患者中位生存時間為30.43個月(95%CI27.81～33.04)明顯低于低表達(dá)組患者的32.61個月(95%CI30.64～34.76),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Log-rankχ2=4.576,P=0.032)。見圖1。

注:A為血清外泌體LncRNA 00853對AFP-NHCC患者生存預(yù)后的影響;B為LncRNA FAM72D-3對AFP-NHCC患者生存預(yù)后的影響。圖1 血清外泌體LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3對AFP-NHCC患者生存預(yù)后的影響

2.4單因素及多因素Cox回歸分析影響AFP-NHCC患者生存預(yù)后的因素 以AFP-NHCC患者的生存預(yù)后為因變量(死亡賦值為1、存活賦值為0),納入年齡(≥60歲賦值為1、<60歲賦值為0),性別(男賦值為1、女賦值為0),腫瘤最大徑(>5 cm賦值為1、≤5 cm賦值為0),腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目(≥2個賦值為1、<2個賦值為0),包膜完整性(不完整賦值為1、完整賦值為0),BCLC分期(B～C期賦值為1、0～A賦值為0),病理分化程度(低分化賦值為1、高中分化賦值為0),肝內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有賦值為1、無賦值為0),LncRNA 00853(高表達(dá)賦值為1、低表達(dá)賦值為0),LncRNA FAM72D-3(高表達(dá)賦值為1、低表達(dá)賦值為0)為自變量,單因素及多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示,BCLC分期B～C期、病理低分化程度、伴有肝內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LncRNA 00853高表達(dá)及LncRNA FAM72D-3高表達(dá)是影響AFP-NHCC患者生存預(yù)后的獨立危險因素。見表2、3。

表2 單因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析

續(xù)表2 單因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析

表3 多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析

3 討 論

HCC起病隱匿,發(fā)現(xiàn)時多為晚期,患者的臨床預(yù)后較差。AFP是臨床上HCC最常用的腫瘤標(biāo)志物,不僅廣泛用于HCC的早期篩查診斷,也普遍用于患者術(shù)后預(yù)后判斷及腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測[8]。但臨床中發(fā)現(xiàn),約30%的HCC患者AFP表達(dá)陰性(<20 μg/L),即AFP-NHCC患者,特別是在腫瘤最大徑<5 cm的小肝癌患者中,AFP陽性率僅為25%[9]。目前用于AFP-NHCC患者預(yù)后評估系統(tǒng)包括BCLC系統(tǒng)及Child-Pugh系統(tǒng)等,BCLC系統(tǒng)評估內(nèi)容涉及腫瘤負(fù)荷及血管淋巴管侵犯的情況等,雖然全面但過于復(fù)雜。Child-Pugh系統(tǒng)評估內(nèi)容包括腹水及肝性腦病,不同醫(yī)師的主觀觀測結(jié)果不同,對患者預(yù)后評估有較大差異[10]。因此,深入研究AFP-NHCC的疾病機制,尋找能夠術(shù)前判斷患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物,有利于對不同風(fēng)險的AFP-NHCC患者進(jìn)行個體化治療,以改善臨床預(yù)后。

外泌體是具有雙層磷脂結(jié)構(gòu)的微小囊泡,細(xì)胞可分泌產(chǎn)生外泌體,外泌體中含有蛋白、脂質(zhì)及核酸等活性物質(zhì),具有細(xì)胞間通訊、免疫抗原呈遞等多種生物學(xué)功能[11]。腫瘤細(xì)胞可分泌外泌體,并能分布到血液、尿液等體液中被檢測到,檢測外泌體中核酸分子如LncRNA等,可能是理想的腫瘤標(biāo)志物[12-13]。LncRNA 00853是一種內(nèi)源性長鏈RNA分子,位于染色體1p33上,具有較高的細(xì)胞和組織特異性,參與個體生長發(fā)育調(diào)控過程[14]。本研究中,AFP-NHCC組患者血清外泌體LncRNA 00853明顯高于對照組,提示LncRNA 00853可能參與AFP-NHCC患者的腫瘤發(fā)生。既往有學(xué)者對HCC患者血清外泌體中LncRNA進(jìn)行分析[6],也證實相比于健康人群血清,LncRNA 00853是差異性表達(dá)升高最明顯的基因之一。目前AFP-NHCC中LncRNA 00853表達(dá)上調(diào)的機制尚不清楚,可能與RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)異常有關(guān),研究發(fā)現(xiàn),環(huán)狀RNA能夠作為內(nèi)源競爭性RNA,結(jié)合并抑制LncRNA的表達(dá)及功能,環(huán)狀RNA的表達(dá)失調(diào)可導(dǎo)致LncRNA 00853的表達(dá)升高,進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞生長、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和化療耐藥等過程[15]。本研究中,LncRNA 00853的表達(dá)與AFP-NHCC患者BCLC分期、病理分化程度及肝內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示LncRNA 00853的表達(dá)升高促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。研究表明,LncRNA 00853通過促進(jìn)CC趨化因子受體9的表達(dá),通過結(jié)合CC趨化因子配體25,增強腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力,導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展[16]。本研究發(fā)現(xiàn),血清外泌體LncRNA 00853高表達(dá)的AFP-NHCC患者生存預(yù)后較差,是影響患者生存預(yù)后的獨立危險因素,表明檢測血清外泌體中LncRNA 00853的表達(dá)有助于評估臨床預(yù)后,是新的AFP-NHCC預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物。研究表明,CC趨化因子受體9通過結(jié)合其特異性配體CC趨化因子配體25,激活Wnt/β-連環(huán)蛋白通路,增強腫瘤細(xì)胞對化療藥物的抵抗性[17],LncRNA 00853可通過促進(jìn)該通路的激活,導(dǎo)致患者不良生存預(yù)后[16]。

LncRNA FAM72D-3是近年來發(fā)現(xiàn)的新的RNA調(diào)控分子。體外細(xì)胞實驗中發(fā)現(xiàn),肝癌細(xì)胞系如HepG2,SNU-423中LncRNA FAM72D-3表達(dá)均明顯升高,可能是新的HCC腫瘤標(biāo)志物[7]。本研究中,AFP-NHCC患者血清外泌體中LncRNA FAM72D-3表達(dá)明顯升高,并且與BCLC分期、病理分化程度及肝內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示LncRNA FAM72D-3表達(dá)升高參與促進(jìn)AFP-NHCC的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn),LncRNA FAM72D-3能夠作為分子海綿結(jié)合并抑制miR-5787的表達(dá)[7],引起miR-5787的下游靶基因真核翻譯起始因子5 mRNA的穩(wěn)定性增加,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,遷移和轉(zhuǎn)移能力[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn),LncRNA FAM72D-3高表達(dá)患者的生存預(yù)后較差,是影響AFP-NHCC患者生存預(yù)后的獨立危險因素,表明血清外泌體LncRNA FAM72D-3是一種新的評估AFP-NHCC生存預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。LncRNA FAM72D-3可通過影響下游微小RNA及靶基因的表達(dá),影響腫瘤對化療藥物的耐藥性,進(jìn)而影響患者生存預(yù)后。有學(xué)者報道,LncRNA FAM72D-3的表達(dá)升高能夠抑制miR-5787的表達(dá),而miR-5787表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基3的表達(dá),進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞氧化磷酸化,促進(jìn)無氧糖酵解,增強腫瘤細(xì)胞對順鉑等化療藥物的耐藥性,導(dǎo)致患者不良生存預(yù)后[20]。

綜上所述,AFP-NHCC患者血清外泌體中LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3水平升高,其水平與AFP-NHCC患者BCLC分期、病理分化程度及肝內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),共同參與促進(jìn)AFP-NHCC的腫瘤進(jìn)展。血清外泌體中LncRNA 00853、LncRNA FAM72D-3高表達(dá)的AFP-NHCC患者生存預(yù)后較差,是影響患者生存預(yù)后的獨立危險因素。但本研究仍然存在一定不足之處,由于樣本量及隨訪時間有限,有待今后設(shè)計多中心臨床試驗進(jìn)一步研究。