高毒力肺炎克雷伯菌的微生物學特征與毒力因子研究進展*

董秀濤,崔曉笛,石曉紅 綜述,郝明巨△ 審校

1.山東第一醫科大學第一附屬醫院/山東省千佛山醫院檢驗科/山東省醫藥衛生臨床檢驗診斷學重點實驗室,山東濟南 250014;2.濟寧醫學院臨床醫學院,山東濟寧 272067

肺炎克雷伯菌是一種機會性致病的病原體,能夠引起多種感染,如引起免疫力低下患者的肺炎,尿路感染和菌血癥等[1]。肺炎克雷伯菌有3個亞種,具有同源DNA但生化反應不同,包括肺炎亞種、臭鼻亞種和硬鼻結亞種。在過去的幾十年中,高毒力肺炎克雷伯菌(hvKp)已成為一種重要的病原體,能夠引起社區獲得性感染和醫源性感染[2]。在亞洲,hvKp最初被認為是化膿性肝膿腫的病因[3]。肺炎克雷伯菌中hvKp的檢出率存在地區差異,在hvKp流行地區,檢出率在12%～45%[4]。近年來,隨著抗菌藥物的廣泛使用,這些菌株已呈現出對多種抗菌藥物耐藥的現象。本文主要討論hvKp血清型及基因分型,與侵襲性相關的微生物學特征,主要毒力因子及相關的分子基礎。

1 hvKp血清型及基因分型

1.1hvKp的血清型 hvKp通常具有典型的莢膜表型。莢膜是由肺炎克雷伯菌合成的一種多糖成分,可作為細菌外部的保護層,抑制宿主補體介導的炎癥反應[5]。莢膜多糖的核酸序列為莢膜分型的分子基礎,不同的多糖變異體等位基因(wzi)編碼不同的莢膜抗原,可根據血清學對其進行分類。當前,wzi基因的測序較血清學分型的方法更為常用,已通過該方法鑒定出至少134種莢膜基因座[6]。hvKp最常見的wzi基因座是莢膜1型,其次是莢膜2、5、57型[7]。通常認為,hvKp的莢膜可防止宿主的吞噬作用從而增加hvKp的毒性。其機制是巨噬細胞凝集素受體識別病原體表面重復的甘露糖或鼠李糖以誘導吞噬作用,但莢膜1、2、5、57型的hvKp菌株缺少這些糖分子,因此有助于其逃避凝集性介導的吞噬作用[8]。另有研究發現,莢膜1型抵抗嗜中性粒細胞的殺滅作用更強,這可進一步加劇其致病風險[9]。

1.2hvKp的序列類型(ST) 大多數hvKp菌株克隆群分布較為局限,CG23是最主要的克隆群,包括許多ST,如ST23、ST26、ST57和ST1633等[10]。其中,ST23菌株是引起肝膿腫的主要分型[11-12]。CG23與莢膜1型和多種毒力因子密切相關,包括大腸桿菌毒素、微菌素E492、鐵載體捕獲系統(氣桿菌素、耶爾森桿菌素和沙門菌素)等[13]。盡管ST23是hvKp分離株中的主要ST,但最近在許多地區也發現了引起感染的其他ST[14]。因此,莢膜1型ST23 hvKp菌株雖然在最開始被發現時占主導地位,但其分離率正在呈下降趨勢,在全球范圍內有許多不同的莢膜類型也同樣屬于hvKp菌株。

2 hvKp與侵襲性相關的微生物學特征

2.1hvKp的高黏液表型 hvKp的臨床侵襲性常與其黏液性特征有關。hvKp的主要特征是在瓊脂平板上呈現出高黏液表型,屬于高黏液性肺炎克雷伯菌,表現為拉絲實驗陽性,即用接菌環粘取菌落可拉伸至少5 mm;因此,可以通過拉絲實驗對hvKp進行初步識別[15]。通常認為,hvKp的高黏液表型與胞外莢膜產量過多有關;具有高黏液表型或莢膜多糖產生過多的菌株,對補體介導的血清殺傷抵抗能力明顯增強[15]。hvKp胞外多糖網由染色體上的莢膜多糖基因簇(cps)編碼,受毒性質粒攜帶的某些基因[包括黏液表型調節基因(rmp)A、rmpA2和黏液相關基因A(magA)等][16]正向調節。

2.2hvKp在腸道內定植是引起人群流行和感染的重要因素 hvKp是腸道微生物組的成員,這可能有助于其在社區和醫院中的傳播。在哺乳動物中,肺炎克雷伯菌為腸道的常見定植菌。另外,在人體黏膜表面、污水污染的水源和醫院的表面物體中也常常分離到該菌[17]。患者腸道定植的肺炎克雷伯菌往往是引起人類感染的主要來源[18]。研究發現,在住院患者中,肺炎克雷伯菌的腸道定植率在19%～38%[19]。

引起hvKp在腸道內定植的環境來源尚不清楚,在hvKp高流行地區,hvKp進入腸道定植后,通過糞-口途徑傳播可能是引起社區傳播的一種重要途徑。有研究發現,胃腸道定植與肝膿腫之間存在很強的相關性[20]。在韓國,5%的健康成年人中攜帶hvKp[20],在接受調查的近千名亞洲地區的華人成年人中,這一比例為6%[21]。這些研究結果提示,肺炎克雷伯菌感染很可能源于腸道內定植。此外,使用小鼠腸道定植模型,已經確定了hvKp在腸道內定植相關所需的基因,這表明hvKp可能使用特定的毒力決定因素進入肝臟[22]。總之,hvKp易于在腸道內定殖的特性促進了其在人群之間的傳播,并可能在疾病期間從腸道擴散到其他器官引起播散性感染。

3 hvKp的毒力因子

3.1hvKp中的毒性質粒 hvKp的高毒性通常由其所攜帶的高毒力質粒介導,質粒編碼的鐵載體系統和黏液表型相關基因是hvKp菌株的關鍵毒力因子[2]。當前,由NTUH2044攜帶的pK2044[23]和CG43攜帶的pLVPK[24]是研究最為深入的hvKp毒力質粒,大小約為220 kb,二者的基因序列高度相似(圖1)。毒性質粒中攜帶多種毒性基因和重金屬抗性基因座,包括黏液樣調節基因rmpA、rmpA2、rmpD,鐵捕獲基因(iut、iro),介導對金屬碲、銅等抗性的ter和pco耐藥基因(圖1)。盡管如此,在這些毒力質粒編碼的基因中,大約2/3的基因功能仍然未知。

注:質粒中帶有的毒性基因(rmp、iuc、iro)、重金屬抗性基因(pco、ter)及與pLVPK質粒Blast比對結果見圖中標注。圖1 pK2044毒性質粒示意圖

rmp基因:質粒編碼的rmpA和rmpA2可調控位于細菌染色體上的莢膜基因cps表達,以增加莢膜外多糖的合成和產生高黏液表型[2]。rmpA基因見于90%有高黏液表型的分離株,然而,無高黏液表型的分離株中也有22%菌株同樣攜帶rmpA基因,但在這些rmpA陽性分離株中,rmpA基因多存在突變(插入或缺失)而失去活性,這可能是導致其不出現黏液表型和低毒力的原因之一[25]。雖然有研究支持hvKp的高黏液表型與胞外莢膜產量過多有關,但也有研究認為莢膜產量與黏液表型分屬不同的生物學特征,并無相關性,比如在毒力質粒中存在一種cps調節基因rmpC,當敲除后導致cps表達明顯降低,但是細菌依然呈現出高黏液狀態[25]。研究者繼而發現了一種新的調節基因rmpD與黏液表型密切相關,但其并不影響cps的表達[26]。因此,對于不同的hvKp菌株,其黏液性表型的機制可能并不相同,這有待于進一步的研究。

鐵捕獲相關毒力因子:鐵是許多細菌和人類的細胞所需的重要元素,鐵的捕獲是hvKp形成毒力的關鍵組成部分。鐵的可利用性通常受到機體多種蛋白質的限制,在感染過程中,這些蛋白質能夠限制細菌對鐵的利用,這一過程稱為營養免疫[27],如宿主免疫蛋白lipocalin-2可以結合細菌產生的腸桿菌素并阻止其返回細胞,從而阻止細菌對鐵的吸收[28]。然而,hvKp能夠通過編碼高親和力的鐵捕獲系統,抵消宿主的營養免疫過程。例如,hvKp編碼的ybt、iuc和iro鐵捕獲系統對lipocalin-2具有抗性,能夠克服lipocalin-2營養免疫的限制[29-30],而且iro和iuc基因座的共存趨勢很強,對hvKp在體內生存和致病性發揮重要作用[31]。除了毒性質粒中編碼的鐵載體之外,hvKp染色體上含有編碼腸桿菌素和耶爾森菌素鐵載體系統,可進一步增強細菌對鐵的攝取能力。以上鐵載體系統中,氣桿菌素iuc對于hvKp獲取鐵最為重要,也是關鍵的毒力因子,因此,它已被用作抗hvKp毒素治療的靶標之一[32]。

3.2整合和共軛元件(ICEs) 除毒力質粒外,hvKp菌株還通過染色體中的ICEs移動遺傳元件獲得了其他毒力基因。ICEs在hvKp譜系中極為流行,存在于近90%的CG23[33]和接近75%的hvKp菌株中[34]。hvKp中共有14種不同類型的ICEs,ICEKp1在ST23型NTUH-K2044菌株中首先被發現。然而在其他的ST23型hvKp菌株中,ICEKp10是最為多見的一種ICEs類型[13]。含有編碼鐵載體耶爾森菌素的基因是肺炎克雷伯菌和hvKp菌株中大多數ICEs的共同特征[33]。除耶爾森菌素基因外,一些ICEs還攜帶其他毒力基因,如ICEKp1含有編碼rmpA和鐵載體沙門菌素的基因,而ICEKp10含有編碼大腸菌素合成的基因[35]。

3.3magA magA基因編碼一種相對分子質量為43×103的外膜蛋白,與莢膜1型血清型密切相關。該基因位于莢膜1型血清型cps基因簇的特異性操縱子內[35],從而使細菌具有莢膜1型血清型[36]。magA與莢膜1型血清型的hvKp的毒性也密切相關,一項采用轉座子誘變技術識別候選毒力基因的研究顯示,magA陽性菌株有黏液性胞外多糖網,具有抗吞噬作用,能夠引起小鼠動物模型的肝膿腫和腦膜炎,而magA陰性突變株缺乏胞外多糖網,易被吞噬,沒有毒性[37]。對magA基因側翼區進一步測序發現,magA基因是cps操縱子中聚合酶wzy基因位點的等位基因,因為magA為莢膜1型抗原特異性聚合酶,所以有人提出將magA重命名為wzyKpK1,即莢膜1型血清型肺炎克雷伯菌特異性莢膜聚合酶[38]。其他血清型(莢膜2、5、20、54、57型)及新的莢膜N1型在wzy基因位點有不同的等位基因,它們編碼不同血清型的cps基因簇特異性莢膜聚合酶[39]。

3.4大腸菌素 hvKp的另一個重要的分子特征是合成大腸菌素的能力。大腸菌素是通過非核糖體肽合成酶、聚酮化合物合酶和其他酶(pks基因)進行催化,作為次級代謝的一部分而合成[40]。相對于肺炎克雷伯菌分離株,pks基因座在hvKp中過度表達,在大多數莢膜1型分離株中,通常以染色體整合和結合元件編碼[41-42]。大腸菌素會破壞DNA并破壞宿主細胞周期,但對其中的確切機制尚不清楚。在一項腸道定植hvKp菌株的小鼠模型的研究中顯示,抑制大腸菌素的合成能夠降低hvKp菌株在體內的傳播和轉移能力[43]。因此,大腸菌素是hvKp重要的毒力因子并有助于hvKp在腸道內的定植。

3.5其他hvKp毒力因子 脂多糖:脂多糖由脂質A、核心寡糖和O抗原組成,也即革蘭陰性菌的內毒素。肺炎克雷伯菌脂多糖O側鏈可阻礙補體C1q或C3b結合細菌胞膜,從而保護細菌免于補體介導的膜損傷和細胞死亡[44]。O1抗原是經典的肺炎克雷伯菌最常見的亞型,其缺失能夠明顯抑制細菌毒力。而莢膜1型hvKp菌株中的O1抗原通常被莢膜所掩蓋,其抑制補體激活的途徑通常與厚的莢膜有關。肺炎克雷伯菌屬脂多糖還可能通過其他機制提高毒力,包括觸發細胞因子的大量分泌而導致膿毒綜合征或膿毒性休克而增加肺部感染的致死性[45]。

菌毛:肺炎克雷伯菌能夠表達1型和3型菌毛。1型菌毛是所有腸桿菌科細菌產生的雜多聚甘露糖結合纖維,介導對多種類型上皮細胞(如膀胱上皮細胞)的黏附。3型菌毛中的黏附蛋白(MrkD黏附素)能夠促進肺炎克雷伯菌附著于宿主細胞(如泌尿生殖道、呼吸道和腸道細胞)、塑料和人胞外基質表面,從而促進在人體腔道內,以及體內留置管(如靜脈導管和導尿管)表面的定植[46-47]。表1中總結了hvKp主要毒力因子及致病性機制。

表1 hvKp含有的主要毒力因子

4 hvKp的耐藥性趨勢

隨著抗菌藥物的廣泛使用,hvKp已從最初的對多數抗菌藥物敏感呈現出耐藥率增長的趨勢,出現了越來越多的耐碳青霉烯類hvKp(CR-hvKp),其引起的感染給臨床治療帶來很大困難[46-47]。有研究報道了一種CR-hvKp引起的呼吸機相關性肺炎的致命性暴發[48]。國內一項多中心研究顯示,CR-hvKp的檢出率呈逐年升高的趨勢,在產KPC-2的ST11型肺炎克雷伯菌株中尤為明顯[49]。筆者最近的一項關于CR-hvKp的多中心研究分析表明,幾乎所有分離株均攜帶高毒力質粒和blaKPC-2耐藥基因[50]。除了blaKPC-2基因,攜帶blaNDM和blaOXA48型耐藥基因的hvKp相繼被發現[51-53]。不僅如此,對多黏菌素耐藥[54]和替甲環素不敏感的CR-hvKp[55],甚至同時對多黏菌素、替甲環素和碳青霉烯類耐藥的“超級hvKp”[56]相繼在中國被報道。因此,在細菌耐藥現象日益嚴重的背景下,如何應對hvKp帶來的挑戰,已成為一項十分緊急的公共衛生問題。

5 小 結

繼在亞洲的早期報道之后,hvKp已開始在全球范圍內廣泛傳播,為了在臨床中快速鑒定hvKp,需要基于細菌血清型、ST分型、毒力基因檢測等多種診斷方法。hvKp中毒性質粒、ICEs及染色體中含有rmpA、rmpA2、鐵載體(iro、iuc)等是hvKp的關鍵毒力因子,對于hvKp的高致病性發揮重要作用,也常用作hvKp毒力鑒定標記。rmpA基因是莢膜外多糖合成的正性調節因子,可以通過促進cps高表達誘導莢膜形成從而形成高毒力,但某些hvKp菌株黏液表型與cps高表達無關。另外,多藥耐藥性的hvKp菌株尤其是CR-hvKp的出現須引起足夠重視,亟須尋求新的策略來應對這種高毒力與高耐藥性的CR-hvKp引起的感染,臨床上必須快速有效地對hvKp進行鑒定,從而為臨床診療提供依據。