東山灣海帶養殖區海洋浮游細菌的群落結構變化

張飛 劉雙 王昕怡 李和陽 馬勇 湯坤賢

摘要 ?對福建省東山灣一處海帶養殖區海水中浮游細菌群落進行考察，以了解在海帶生長不同階段海洋浮游細菌的群落結構變化特征。結果表明，在未掛養海帶前，海水中的優勢浮游細菌為亞硫酸桿菌屬細菌，在海帶生長的凹凸期、薄嫩期、厚成期、成熟期，海水中優勢浮游細菌分別為假單胞菌屬、普里斯特氏菌屬、假交替單胞菌屬、假交替單胞菌屬細菌。該研究深化了對海洋細菌與海帶相互作用的認識，為海帶生長過程中的科學管理提供了理論依據。

關鍵詞 ?海帶養殖區；海洋浮游細菌；群落結構；東山灣

中圖分類號 ?S 917.1 ??文獻標識碼 ?A ??文章編號 ?0517-6611（2023）05-0061-03

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2023.05.015

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Changes of the Community Structure of Marine Planktonic Bacteria in the Kelp Culture Area of Dongshan Bay

ZHANG Fei1，2，3，LIU Shuang1，WANG Xin-yi et al

（1.Third Institute of Oceanography，MNR，Xiamen，Fujian 361005;2.Fujian Provincial Key Laboratory of Marine Ecological Conservation and Restoration，Xiamen，Fujian 361005;3.Key Laboratory of Marine Ecological Conservation and Restoration，Ministry of Natural Resources，Xiamen，Fujian 361005）

Abstract ?The planktonic bacterial community in seawater of a kelp culture area in Dongshan Bay，Fujian Province was investigated to understand the changes of bacteria structure characteristics at different life stages of kelp.It was found that the dominant planktonic bacteria on a genus level were strains of Sulfitobacter before kelp was hooked and raised. Strains in Pseudomonas，Priestia and Pseudoalteromonas were dominant at different life stages of Saccharina japonica.This study deepened the understanding of the interaction between marine bacteria and kelp，and provided a theoretical basis for the scientific management of kelp growth process.

Key words ?Kelp culture area;Marine planktonic bacteria;Community structure;Dongshan Bay

我國于1927年開始引進種植海帶，距今已有近百年歷史。海帶可以為人們提供海藻多糖、蛋白質等營養物質，不但具有很高的食用價值和藥用價值，同時也是工業上提取碘、甘露醇和海藻酸鈉的重要原料［1-4］。隨著研究的深入，人們發現海帶除了具有重要的經濟價值外，在其生長過程中還可以移除大氣中的CO2、增加海水氧含量、減緩海水富營養化，因而具有重要的生態價值［5］。我國是世界上最大的海帶養殖國家，海帶種植面積和產量均居世界首位［6］。福建是我國海帶養殖第一大?。?］，位于該省南部的東山灣多年來一直是海帶養殖的重要區域。

海帶等藻類在生長過程中會向周圍環境中釋放大量有機物，包括糖類、多肽、氨基酸等，為周圍的海洋細菌提供了營養物質［8-10］。同時一些海洋細菌會與海藻競爭環境中的無機營養［11-12］，在其生長代謝過程中產生的維生素、激素對海藻產生影響［13-14］，甚至本身就是致病菌，使海帶等藻類致病或死亡［15-16］。該研究將考察處于東山灣的海帶養殖區中海洋浮游細菌在海帶不同生長階段的群落結構特點，進一步了解海洋細菌與海帶的相互作用，為海帶生長過程中的科學管理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 采樣區域及方法

采樣區域位于福建省漳州市東山灣 一處多年海帶養殖區（117°32′7.33″E，23°47′58.23″N），分別于2021年10月23日、12月3日、2022年1月25日、4月6日、5月10日采集該區域表層海水（0 m）。取約30 mL海水存放于50 mL 無菌離心管中，保存于0～ 4 ℃直到進一步分析。

1.2 樣品處理

1.2.1 ???海洋細菌分離。吸取 “1.1” 海水1 mL加至49 mL滅菌海水中，混勻后吸取50 μL于無菌2216E固體培養基（蛋白胨5.0 g/L，酵母膏1.0 g/L，海鹽 31 g/L，瓊脂16 g/L，pH為7.2～7.4）上均勻涂布，25 ℃培養2～3 d，直到培養基上出現若干直徑2～3 mm單菌落。隨機挑選50～100個上述單菌落做好標記，分別于2216E固體培養基上劃線純化，對純化后的單菌落進行保種。

1.2.2 ???海洋細菌基因組DNA提取及16S rRNA序列擴增。 挑取上述單菌落進行2216E液體培養基擴大培養，后吸取0.5 mL 菌液利用基因組DNA提取試劑盒（TIAN amp Bacteria DNA Kit，DP302）提取細菌基因組DNA。16S rRNA序列擴增采用27F和1492R引物，具體參考郭亞平［17］的方法。

1.2.3 ???16S rRNA序列測序及比對。PCR擴增后的16S rRNA序列送上海美吉生物醫藥科技有限公司測序，將拼接后的測序結果與GenBank數據庫已有序列進行比對分析，根據與其親緣關系最近的參考菌株確定該菌株的分類信息。

1.3 數據處理 ???試驗數據采用Microsoft Excel 2019進行整理和分析。

2 結果與分析

基于屬水平的不同時間點東山灣海帶養殖區海洋浮游細菌構成及相對豐度見表1。2021年10月，該海帶養殖區還未掛養海帶，因此可作為對照組。

2021年10月份的海水樣品中，亞硫酸桿菌屬（Sulfitobacter）細菌占主導地位，在已分離的52株海洋細菌中，其相對豐度可達88.46%，處于第二位的是鹽堿芽孢桿菌屬（Alkalihalobacillus）細菌，但是相對豐度僅有5.77%。2021年12月（凹凸期）的樣品中，分離到的84株細菌全部屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）。在2022年1月份，海帶大致處于生長階段的薄嫩期，此時環境中的浮游細菌以普里斯特氏菌屬（Priestia）和芽孢桿菌屬（Bacillus）為主，二者占比分別為53.62%和42.03%，鹽堿芽孢桿菌屬和地芽孢桿菌屬（Geobacillus）細菌占少數。2022年4月份（厚成期）樣品中，假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）菌株占絕對多數，其比例可達93.33%，亞硫酸桿菌屬和弧菌屬（Vibrio）細菌分別占比5.00%和1.67%。在海帶處于成熟期的2022年5月份樣品中，細菌多樣性明顯高于其他時間點的多樣性；在已篩選到的50株海洋細菌中，假交替單胞菌屬細菌占比為42.00%，其次為寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas）細菌，其占比為20.00%；嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和尼爾氏菌屬（Niallia）細菌占比分別為8.00%和6.00%，亞硫酸桿菌屬、奧利氏菌屬（Olleya）、弧菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、微桿菌屬（Microbacterium）占比均為4.00%，交替單胞菌屬（Alteromonas）和中溫黃桿菌屬（Mesoflavibacter）細菌占比均為2.00%。

3 討論

根據不同生長發育階段，海帶孢子體大體可以分為幼齡期、凹凸期、薄嫩期、厚成期、成熟期和衰老期［18］。該研究的采樣時間除2021年10月作為無海帶掛養的對照組外，2021年12月、2022年1月、4月、5月大致分別對應于海帶生長的凹凸期、薄嫩期、厚成期和成熟期。在海帶的不同生長階段，不僅形態特征差異較大，與周圍環境的相互作用也各不相同。研究在海帶不同生長階段養殖區海水中浮游細菌的群落結構特征，具有重要的代表性。

該研究采用經典的野外采樣、分離培養、純菌株篩選、分析鑒定的方法，雖然可以在一定程度上反映出在海帶不同生長階段周圍海水中浮游細菌的群落結構特征，包括細菌群落中的優勢菌群，但是由于培養條件的選擇性（包括培養基種類、培養溫度等），篩選用于測序菌落的隨機性，不可避免地導致最終結果可能無法完全反映出培養現場的細菌群落結構特征。比如在該研究2021年12月的樣品中，已測序的所有84株細菌在屬水平上全部屬于假單胞菌屬，更體現出此方法的局限性。雖然采用此方法可以獲得用于進一步研究的菌株資源，但是需要結合諸如宏基因組分析的方法，才能更全面了解培養現場的細菌群落，尤其是針對一些難培養細菌及在細菌群落中占比較小細菌的信息。

2021年10月份的樣品中，亞硫酸桿菌屬細菌占可培養細菌的88.46%，處于明顯的主導地位。可能的原因為此時海區尚未有海帶苗掛養，且該海區經過近半年沒有大型海藻等生產者對有機碳的輸入，因此溶解有機碳和顆粒有機碳均處于較低水平。亞硫酸桿菌屬細菌是一類嚴格的有機化能營養菌，在有機碳源存在的情況下，它們可以利用硫代硫酸鹽和亞硫酸的氧化為其生命活動提供能量［19］，因此在有機物較缺乏的環境中具有生長優勢。2021年12月，此時海帶大致處于凹凸期，發現此樣品中浮游細菌在屬水平上全部屬于假單胞菌屬。在第一次測序約50株細菌后，又隨機挑選了30多株，共84株細菌測序后，仍發現所獲得的菌株全部屬于假單胞菌屬。假單胞菌屬是一個很大的屬，截至目前（2022年7月15日）共有505種細菌［20］，同時有很多種分離自海洋環境；來源于海洋環境的該屬細菌很多可以產生豐富的次級代謝產物，包括抑菌物質等［21］，這可能是在這一樣品中出現大量假單胞菌屬細菌的原因之一。2022年1月的樣品中存在較多的普里斯特氏菌屬和芽孢桿菌屬細菌，還包括鹽堿芽孢桿菌屬和地芽孢桿菌屬細菌，它們都屬于芽孢桿菌科（Bacillaceae）。多數芽孢桿菌會形成內生孢子，抗逆性較強，可分泌多種蛋白酶對外界蛋白質消化利用［22］，這可能是此樣品中海洋浮游細菌多為芽孢桿菌的原因之一。2022年4月的樣品中假交替單胞菌屬細菌占絕大多數。已有研究表明某些來源于海洋環境的這一屬細菌可以合成生物活性分子，這些活性分子具有抗菌、溶菌、裂解及殺滅藻類的活性，進而在競爭營養物質和形成菌落方面發揮優勢［23］。2022年5月，海帶大致處于成熟期，海帶藻體生物量已累積到最大且不再明顯增多；此時海帶葉片產生孢子囊群并伴隨著游孢子的放散，大量的顆粒和溶解有機碳進入水體，進而為不同種類的海洋細菌提供了碳源和能源，這可能是此時間點海洋浮游細菌多樣性最高的原因之一；作為此樣品中相對豐度第二的寡養單胞菌屬，它們具有較特殊的生存策略，某些該類細菌與植物關系密切，甚至可以通過改變植物葉片表面的性質來提高自身的附著能力，因此可能在與其他浮游細菌的競爭中獲得優勢。

海帶在生長過程中會產生大量的顆粒及溶解有機碳［24］，在生長不同階段的海帶產生不同種類和數量的有機碳是影響浮游細菌群落結構變化的關鍵因素。當然，伴隨著海帶生長不同階段的溫度、溶解氧等其他環境因素也是造成海帶生長環境中浮游細菌群落結構變化的重要原因。

4 結論

通過對福建省東山灣一處海帶養殖區中海洋浮游細菌群落結構在海帶養殖期間的分析，發現在未掛養海帶前，海水中的優勢細菌為亞硫酸桿菌屬細菌。在海帶生長的凹凸期、薄嫩期、厚成期、成熟期，海水中優勢浮游細菌分別為假單胞菌屬、普里斯特氏菌屬、假交替單胞菌屬、假交替單胞菌屬細菌，但在成熟期海水中浮游細菌的多樣性更高。伴隨著海帶生長的不同階段，養殖區中的優勢浮游細菌群落也發生更替。

參考文獻

［1］ ?姚海芹，王飛久，劉福利，等.食用海帶品系營養成分分析與評價［J］.食品科學，2016，37（12）：95-98.

［2］ 金振輝，劉巖，張靜，等.中國海帶養殖現狀與發展趨勢［J］.海洋湖沼通報，2009（1）：141-150.

［3］ 薛長湖，陳磊，李兆杰，等.巖藻聚糖硫酸酯體外抗氧化特性的研究［J］.青島海洋大學學報（自然科學版），2000，30（4）：583-588.

［4］ 陳婉珠，芮漢明，張玲.海帶的工業化應用［J］.食品與藥品，2006，8（8）：70-72.

［5］ GAO G，GAO L，JIANG M J，et al.The potential of seaweed cultivation to achieve carbon neutrality and mitigate deoxygenation and eutrophication［J］.Environmental research letters，2022，17（1）：1-15.

［6］ FAO.Fishery and aquaculture statistics：Global aquaculture production 1950-2020［M］.Rome：FAO，2022.

［7］ 農業農村部漁業漁政管理局，全國水產技術推廣總站，中國水產學會.中國漁業統計年鑒（2016—2021）［M］.北京：中國農業出版社，2016-2021.

［8］ FOGG G E.The extracellular products of algae［J］.Oceanography and marine biology，1966，4：195-212.

［9］ LARSSON U，HAGSTRM .Fractionated phytoplankton primary production，exudate release and bacterial production in a Baltic eutrophication gradient［J］.Marine biology，1982，67（1）：57-70.

［10］ ?AMMERMAN J W，AZAM F.Bacterial 5-nucleotidase in aquatic ecosystems：A novel mechanism of phosphorus regeneration［J］.Science，1985，227（4692）：1338-1340.

［11］ FAUST M A，CORRELL D L.Comparison of bacterial and algal utilization of orthophosphate in an estuarine environment［J］.Marine biology，1976，34（2）：151-162.

［12］ WHEELER P A，KIRCHMAN D L.Utilization of inorganic and organic nitrogen by bacteria in marine systems［J］.Limnology oceanography，1986，31（5）：998-1009.

［13］ MARUYAMA A，MAEDA M，SIMIDU U.Occurrence of plant hormone（cytokinin）-producing bacteria in the sea［J］.Journal of applied bacteriology，1986，61（6）：569-574.

［14］ MARUYAMA A，YAMAGUCHI I，MAEDA M，et al.Evidence of cytokinin production by a marine bacterium and its taxonomic characteristics［J］.Canadian journal of microbiology，1988，34（6）：829-833.

［15］ SAWABE T，EZURA Y，KIMURA T.Characterization of an alginolytic marine bacterium from decaying Rishiri-kombu Laminaria japonica var.ochotensis［J］.Nippon suisan gakkaishi，1992，58（1）：141-145.

［16］ SAWABE T，MAKINO H，TATSUMI M，et al.Pseudoalteromonas bacteriolytica sp.nov.，a marine bacterium that is the causative agent of red spot disease of Laminaria japonica［J］.International journal of systematic bacteriology，1998，48：769-774.

［17］ 郭亞平.一株耐受高濃度銫海洋細菌的篩選鑒定及耐受機理研究［D］.廈門：廈門大學，2020.

［18］ 王飛久，孫修濤，高淳仁.海帶苗種培育及無公害養殖技術（一）［J］.科學養魚，2008（7）：14-16，85.

［19］ SOROKIN D Y，RAINEY F A，WEBB R I，et al.Sulfitobacter［M］//WHITMAN P W.Bergey’s manual of systematics of archaea and bacteria.New York：John Wiley & Sons，Ltd，2015：1-8.

［20］ PARTE A C，CARBASSE J S，MEIER-KOLTHOFF J P，et al.List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature（LPSN） moves to the DSMZ［J］.International journal of systematic and evolutionary microbiology，2020，70（11）：5607-5612.

［21］ ISNANSETYO A，KAMEI Y.Bioactive substances produced by marine isolates of Pseudomonas［J］.Journal of industrial microbiology & biotechnology，2009，36（10）：1239-1248.

［22］ LOGAN N A，VOS P D.Bacillus［M］//WHITMAN P W.Bergey’s manual of systematics of archaea and bacteria.New York：John Wiley & Sons，Ltd，2015：1-163.

［23］ HOLMSTRM C，KJELLEBERG S.Marine Pseudoalteromonas species are associated with higher organisms and produce biologically active extracellular agents［J］.FEMS microbiology ecology，1999，30（4）：285-293.

［24］ LI H M，ZHANG Z H，XIONG T Q，et al.Carbon sequestration in the form of recalcitrant dissolved organic carbon in a seaweed（kelp） farming environment［J］.Environmental science & technology，2022，56（12）：9112-9122.