囊胚玻璃化冷凍預平衡時間對輔助生殖妊娠結局的影響

張留光，李寧，李玉虎，蔡雪想

·論 著·

囊胚玻璃化冷凍預平衡時間對輔助生殖妊娠結局的影響

張留光，李寧，李玉虎，蔡雪想

海口瑪麗醫(yī)院生殖中心，海南海口 570102

探討囊胚激光皺縮后縮短玻璃化冷凍預平衡時間對臨床妊娠及新生兒結局的影響。回顧性分析2018年1月至2021年12月于海口瑪麗醫(yī)院進行囊胚復蘇移植患者的臨床資料，從中篩選501例患者518個移植周期。根據實驗室囊胚玻璃化冷凍技術標準操作程序修訂前后的預平衡時間將其分為A組（9～10min）和B組（7～8min），比較兩組間的妊娠結局和新生兒結局。兩組患者的年齡、移植胚胎數、卵泡刺激素、體質量指數、不孕年限、原發(fā)不孕比例、移植日內膜厚度和內膜方案比較，差異均無統(tǒng)計學意義（>0.05）；兩組的囊胚存活率、著床率、臨床妊娠率、活產率、早期流產率、多胎妊娠率、母體并發(fā)癥比較，差異均無統(tǒng)計學意義（>0.05）。兩組的新生兒性別比、孕周、早產兒比例、出生體質量、低出生體重兒、巨大兒、剖宮產、出生缺陷比較，差異均無統(tǒng)計學意義（>0.05）。囊胚激光皺縮后，縮短玻璃化冷凍預平衡時間不影響囊胚復蘇移植的妊娠結局。

玻璃化冷凍；囊胚；時間；妊娠結局

近年來，國內囊胚復蘇移植的比例不斷擴大。囊胚移植有諸多優(yōu)點，如有助于胚胎質量自我篩選、提高成功率、有效降低多胎率、減少卵裂期胚胎保存數量、進行胚胎植入前遺傳學診斷等。玻璃化冷凍方法在輔助生殖領域的成功運用和快速發(fā)展，使得胚胎凍存更為簡便、高效和安全[1]。目前，國內多數中心采用商品化試劑盒進行囊胚玻璃化冷凍。然而，玻璃化冷凍試劑中通常含有乙二醇和二甲基亞砜，這些物質對胚胎的細胞毒性并未得到大家的足夠重視。眾所周知，冷凍保護劑的暴露時間和濃度是影響細胞內冰晶形成和細胞毒性的兩個重要因素。為降低冷凍保護劑對囊胚的細胞毒性，多數中心將胚胎暴露于高濃度冷凍液中的時間限制在40～60s，但在低濃度冷凍保護劑中的預平衡時間不盡相同[2-5]。在行囊胚玻璃化冷凍之前進行激光皺縮，可使囊胚在平衡液中的暴露時間更加靈活[6-10]。研究顯示，卵裂期胚胎不同的玻璃化冷凍預平衡時間可對臨床結局產生影響，而囊胚方面是否影響臨床及新生兒結局卻少有報道[11-12]。本研究擬評價人類囊胚激光皺縮后行玻璃化冷凍，其較短的預平衡時間是否對臨床妊娠及新生兒結局產生影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018年1月至2021年12月就診于海口瑪麗醫(yī)院生殖中心的501例患者518個囊胚復蘇移植周期的臨床資料。納入標準：①年齡<35歲；②內膜無明顯異常；③囊胚評分3BB以上。排除標準：①囊胚復蘇后2h囊胚腔未擴張者；②卵裂期胚胎和囊胚期胚胎序貫移植者。本研究進行胚胎冷凍的原因：①預防卵巢過度刺激；②促排卵方案不適宜移植；③孕酮升高；④子宮內膜薄或內膜有炎癥等內膜因素；⑤個人原因及其他。根據實驗室囊胚玻璃化冷凍技術標準操作程序修訂前后的預平衡時間將其分為兩組，即9～10min為A組（269例患者278個周期）；7～8min為B組（232例患者240個周期）。本研究獲得海口瑪麗醫(yī)院生殖醫(yī)學倫理委員會審批通過（倫理審批號：2021-10-02）。

1.2 方法

1.2.1 囊胚準備 當有2個以上卵泡的直徑≥18mm時，當晚肌內注射重組人絨促性素250μg，37h后經陰道超聲引導下取卵。胚胎培養(yǎng)體系：卵冠丘復合物在四孔皿授精液中培養(yǎng)并進行受精，在培養(yǎng)箱（37℃，6% CO2，5% O2）培養(yǎng)約18h后觀察卵子受精情況并轉移到卵裂液中，每隔24h觀察并記錄胚胎發(fā)育情況。胚胎發(fā)育到第3天將胚胎轉移到囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)[13]。第5天和第6天時，按照伊斯坦布爾共識標準對囊胚進行形態(tài)學觀察評估[14]。

1.2.2 激光皺縮 所有囊胚冷凍前進行激光打孔，使擴張囊胚皺縮。具體過程如下：采用激光破膜系統(tǒng)對擴張期囊胚行激光打孔，使用單束激光脈沖（200ms）在滋養(yǎng)層的細胞連接處（遠離內細胞團）發(fā)射激光進行打孔，囊腔迅速塌陷，腔內水分流出，見圖1。在培養(yǎng)箱中放置約10min后進行冷凍。

1.2.3 囊胚冷凍與復蘇 采用商品化試劑盒（Kitazato，日本）進行囊胚的玻璃化冷凍與復蘇，操作步驟參照說明書進行。在室溫條件下，將皺縮后的囊胚置于平衡液中，9～10min或7～8min后將其轉入VS液中，最后將胚胎轉移到玻璃化冷凍載桿上（Kitazato，日本）并迅速投入液氮中保存，胚胎從轉入玻璃化冷凍液到投入液氮中的時間間隔不超過1min（40～60s）。復蘇時，將TS液提前預熱至37℃，從液氮中迅速取出載體浸入其中，放置1 min，然后依次轉移至復蘇液（DS液、WS1液、WS2液）放置3min、5min、5min，最后轉入含10%人血清替代品的培養(yǎng)基中，在37℃、6% CO2及5% O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2h后觀察囊胚色澤及囊胚腔擴張情況，囊腔部分或全部擴張為存活，進行移植。

1.2.4 內膜準備 根據患者自身條件不同，內膜準備方案分為自然周期和人工周期兩種。自然周期適用于月經周期規(guī)律的患者，于月經周期第10天開始B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況及內膜厚度，綜合黃體生成素、雌二醇及孕酮水平確定排卵時間，排卵后第5天進行胚胎移植。人工周期適用于排卵障礙、月經不規(guī)律、自然周期內膜發(fā)育欠佳者，從月經周期第2～3天起口服戊酸雌二醇，根據B超監(jiān)測內膜厚度酌情調整戊酸雌二醇劑量，至內膜≥8mm時肌內注射黃體酮（40～60mg/d）轉化內膜，5d后在B超引導下進行胚胎移植。所有冷凍復蘇移植周期胚胎均為優(yōu)質囊胚。

圖1 囊胚激光皺縮示意圖

A.激光皺縮前；B.激光皺縮后

注：紅色為激光打孔位置；藍色為滋養(yǎng)層細胞；青色為內細胞團

1.3 妊娠判斷及觀察指標

胚胎移植后常規(guī)黃體支持，第14天測定血清人絨毛膜促性腺激素，>25U/L為生化妊娠；1個月后超聲檢查示宮內有孕囊者視為臨床妊娠。

妊娠及新生兒結局的評估：①著床：囊胚移植約5周行陰道B超檢查有無孕囊及數目。著床率=孕囊數/移植胚胎數×100%。②臨床妊娠：囊胚移植后14d查血人絨毛膜促性腺激素陽性，且移植后4～6周行陰道B超可見孕囊，包括宮外孕。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/總移植周期數×100%。③早期流產：妊娠后于3個月內終止為早期流產。早期流產率=早期流產周期數/臨床妊娠周期數×100%。④活產率=活產周期數/總移植周期數×100%。⑤多胎妊娠率=雙胎及以上妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%。⑥低出生體重兒：出生體質量<2.5kg。⑦巨大兒：出生體質量>4kg。⑧早產：20～37周分娩。⑨出生缺陷：在出生時或出生后表現出的結構、功能或發(fā)育異常，可能是由出生前遺傳或非遺傳因素造成。⑩母體并發(fā)癥：主要包括妊娠高血壓、妊娠糖尿病、胎膜早破、前置胎盤等。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 兩組患者的一般資料比較

兩組患者的年齡、移植胚胎數、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、體質量指數、移植日內膜厚度、不孕年限、原發(fā)不孕比例及內膜方案比較，差異均無統(tǒng)計學意義（>0.05），見表1。

2.2 兩組胚胎凍融周期的臨床結局比較

兩組的囊胚存活率、著床率、臨床妊娠率、活產率、早期流產率、多胎妊娠率、母體并發(fā)癥比較，差異均無統(tǒng)計學意義（>0.05)，見表2。

2.3 兩組的新生兒結局比較

本研究共有新生兒366人，兩組的新生兒性別比、孕周、早產兒比例、出生體質量、低出生體重兒、巨大兒、剖宮產、出生缺陷比較，差異均無統(tǒng)計學意義（>0.05），見表3。

表1 兩組患者的一般資料比較

表2 兩組胚胎凍融周期的臨床結局比較

表3 兩組的新生兒結局比較

3 討論

玻璃化冷凍保護劑對胚胎的細胞毒性影響主要由冷凍保護劑的濃度、預平衡時間和溫度等幾個關鍵因素決定[5]。本研究表明，較短的預平衡時間可達到較好的玻璃化冷凍效果，而延長預平衡時間至9～10min并未顯著提高冷凍效果且降低操作效率。

日本加藤商品化玻璃化冷凍試劑建議囊胚玻璃化冷凍第一步預平衡時間為12～15min。然而，已有研究表明不必要的長時間暴露于玻璃化預平衡液中可能對后期胚胎發(fā)育帶來不良影響[15-16]。早在1997年，Ishida等[16]就發(fā)現在玻璃化冷凍平衡液中暴露時間為5～40min不等的實驗組小鼠胚胎在冷凍和解凍后的發(fā)育情況相似。但是，暴露5min的實驗組小鼠的姐妹染色單體交換數量明顯減少，這表明5min是其玻璃化冷凍中最安全的平衡時間。Xiong等[11-12]研究表明，不同的預平衡時間會影響人類早期胚胎玻璃化冷凍的臨床結局，適當延長預平衡時間（9～10min）可能會改善臨床結局。然而，這幾項研究的對象都是卵裂期胚胎，并沒有提到預平衡時間對囊胚期胚胎玻璃化冷凍結局的影響。

近年來，隨著技術的發(fā)展，大量研究證實人工皺縮能改善囊胚玻璃化冷凍的臨床結局，但各中心人工皺縮后囊胚的冷凍預平衡時間差異較大（2～15min）[6-10]。研究人員使用冷凍環(huán)對第5天的囊胚進行玻璃化冷凍，獲得100%的復蘇存活率[7]。Levi-Setti等[8]用同樣的囊胚玻璃化冷凍方法，獲得存活率為97.5%。值得注意的是，在這兩項研究中，其囊胚預平衡時間均是37°C下2min。此外，Darwish等[17]報道使用Cryoleaf玻璃化冷凍第5天囊胚的存活率為97.3%，其囊胚在常溫下預平衡時間為6～10min。2011年，Zhu等[18]采用Crytop方法在室溫下對人工皺縮的囊胚進行12～15min的預平衡，其存活率為85.7%。然而，很少有專門的研究對比皺縮后人囊胚不同的玻璃化預平衡時間對臨床結局的影響，尤其是對新生兒的影響。因每個中心的冷凍方法、冷凍保護劑類型、載體類型、患者群體、胚胎師操作水平存在差異，因此很難通過對比不同中心的數據來評判不同預平衡時間對臨床結局和新生兒的影響。2010年的一項研究顯示，未經人工皺縮的囊胚隨著預平衡時間的延長其存活率升高，但人工皺縮后的囊胚在預平衡2、5、10、15min后的存活率無差異，建議皺縮后預平衡較短的時間[11]。本研究中人工皺縮后的囊胚復蘇存活率無顯著差異，且筆者發(fā)現妊娠結局和新生兒結局也無顯著差異。Mitsuhata等[19]研究結果表明，用未經人工皺縮的擴張期囊胚行玻璃化冷凍時，延長預平衡時間（12～15min）能顯著改善囊胚的存活率、種植率及出生率，而新生兒結局無顯著差異。這一結果和本研究結果部分相似，之所以其延長預平衡時間能顯著改善存活率、種植率及出生率，可能與未經人工皺縮有較大關系。2021年，李翔等[20]研究結果顯示，激光皺縮可增加D5優(yōu)質單囊胚復蘇移植周期的早期流產率，而本研究結果證實延長預平衡時間有增加早期流產率的風險，這從側面反映囊胚激光皺縮后縮短冷凍預平衡時間的必要性。眾所周知，伴隨著囊胚的不斷發(fā)育，其胚胎體積不斷變大，細胞數目也逐漸增多，冷凍保護劑在細胞內外達到平衡所需的時間也隨之延長。人工皺縮后的囊胚其體積塌陷縮小，囊泡液逐漸流出腔外，這樣有利于冷凍保護劑快速滲透到細胞內，從而縮短細胞脫水時間。2018年，Kova?i?等[10]在研究人工皺縮能改善囊胚復蘇移植周期臨床結局時，曾提出一個假設，即其預平衡時間是否可縮短至10min以內；其采用10min的玻璃化預平衡時間，獲得97.2%的復蘇存活率。本研究結果顯示，兩組預平衡時間均取得較高的復蘇存活率及較好的臨床結局和新生兒結局，這進一步證實Kova?i?等的假設。

另外，在其他物種上，研究人員也比較了不同的預平衡時間對囊胚玻璃化冷凍所帶來的影響。Kader等[15]評估玻璃化冷凍預平衡時間對小鼠囊胚DNA完整性指數的影響，該指數與胚胎的發(fā)育潛力呈正相關。結果顯示，不同的預平衡時間對擴張期囊胚DNA完整性指數影響不同，其中8min組顯著高于4min組和15min組。玻璃化冷凍過程中較短的平衡時間（3min）相比較長的平衡時間（12min）可提高牛的D7和D8擴張囊胚的復蘇存活率和孵化率[21]。雖然這些動物和人類的囊胚細胞對冷凍保護劑的滲透速率各不相同，但實驗表明預平衡時間是玻璃化冷凍的一個重要因素，過長或過短的預平衡時間都將對囊胚玻璃化冷凍產生不利影響。

綜上所述，對于擴張期的囊胚，激光皺縮能縮短囊胚玻璃化冷凍的預平衡時間，且其對臨床結局和新生兒結局沒有顯著影響，這對臨床中提高玻璃化冷凍效率很有意義。但由于本研究規(guī)模小，還需更多數據來支持這一結論；同時是否還存在更短的玻璃化冷凍預平衡時間也需進一步研究。

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Effect of vitrification pre-balance time of blastula on pregnancy outcome in assisted reproduction

Center for Reproductive Medicine, Haikou Mary Hospital, Haikou 570102, Hainan, China

To investigate the effect of shortening vitrification pre-balance time after laser blastocyst shrinkage on clinical pregnancy and neonatal outcomes.The clinical data of blastocyst resuscitation and transplantation in Haikou Mary Hospital from January 2018 to December 2021 were retrospectively analyzed, and 501 patients for a total of 518 transplantation cycles were screened. The blastocysts were divided into two groups according to the pre-balance time before and after the revision of the standard operating procedure of laboratory vitrification freezing technology: group A (9-10 min) or group B (7-8 min). The pregnancy outcome and neonatal outcomes were compared between the two groups.There were no significant differences in age, number of transplanted embryos, follicle-stimulating hormone, body mass index, infertility years, proportion of primary infertility, intima thickness and intima regimen between the two groups (>0.05). There were no significant differences in blastocyst survival rate, implantation rate, clinical pregnancy rate, live birth rate, early abortion rate, multiple pregnancy rate and maternal complications between the two groups (>0.05). There were no significant differences in neonatal sex ratio, gestational age, preterm birth rate, birth weight, low birth weight, macrosomia, cesarean section and birth defects between the two groups (>0.05).Shortening the vitrification pre-balance time after laser blastocyst shrinkage did not affect the pregnancy outcome of blastocyst resuscitation transplantation.

Vitrification; Blastocyst; Time; Pregnancy outcome

R321

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.19.002

（2022–12–26）

（2023–06–19）

海南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項目（2101320319A2003）

張留光，電子信箱：xiaodaoivflab@163.com