普濟消毒飲抑制慢性化膿性中耳炎炎癥反應

李若曼，林錫澤，葉海驥，鄭慧珍

·藥物研究·

普濟消毒飲抑制慢性化膿性中耳炎炎癥反應

李若曼1，林錫澤2，葉海驥3，鄭慧珍2

1.溫州市第七人民醫院耳鼻咽喉科，浙江溫州 325000；2.溫州市人民醫院耳鼻咽喉科，浙江溫州 325006；3.文成縣人民醫院耳鼻咽喉科，浙江文成 325300

探討普濟消毒飲抑制慢性化膿性中耳炎炎癥反應的作用。采用經鼓膜穿刺途徑向鼓室注射銅綠假單胞菌的方法構建慢性化膿性中耳炎小鼠模型。建模成功后，左氧氟沙星組小鼠給予1mg/（kg·d）左氧氟沙星灌胃，普濟消毒飲低、中、高劑量組小鼠分別給予2.9g/（kg·d）、5.8g/（kg·d）、11.6g/（kg·d）普濟消毒飲濃縮液灌胃，模型組和對照組小鼠均予以等量生理鹽水灌胃，每日1次，持續14d。左氧氟沙星和普濟消毒飲低、中、高劑量均可減輕中耳黏膜組織病變；與模型組比較，左氧氟沙星組和普濟消毒飲低、中、高劑量組小鼠的血清腫瘤壞死因子-α、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、γ干擾素水平降低（<0.05），Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、髓樣分化蛋白88（myeloid differentiation protein 88，MYD88）、核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）基因表達和蛋白水平及磷酸化NF-κB p65降低（<0.05），上述指標均呈劑量依賴性。普濟消毒飲可抑制慢性化膿性中耳炎炎癥反應，可能與抑制TLR4/MYD88/NF-κB信號通路相關。

普濟消毒飲；慢性化膿性中耳炎；Toll樣受體4；炎癥反應

慢性化膿性中耳炎是指微生物感染中耳黏膜、骨膜、骨質后引起的慢性化膿性炎癥反應，是耳鼻喉科最常見的感染性疾病。慢性化膿性中耳炎多發于青少年，據統計該病在青少年中的發病率為0.2%[1]。目前，臨床常采用藥物抗感染治療和手術治療，盡管有一定療效，但多數患者病情遷延不愈[2]。中醫認為慢性化膿性中耳炎屬“膿耳”范疇[3]。普濟消毒飲出自《東垣試效方》，主要有清熱解毒、疏風散邪的功效，已有報道表明普濟消毒飲可改善慢性化膿性中耳炎機體炎癥反應[4]。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）能夠識別病原體相關分子模式，參與機體的炎癥反應過程，TLR4信號通路激活可參與慢性化膿性中耳炎的炎癥反應[5]。本研究探討普濟消毒飲介導TLR4信號通路調控慢性化膿性中耳炎炎癥反應的作用與機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與菌株 60只C57BL/6J健康小鼠，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，6～8周齡，雌雄各半，體質量18～22g，購自南方醫科大學[許可證號：SCXK（粵）2021-0041，使用許可證號：SYXK（粵）2021-0167]。銅綠假單胞菌菌株（編號BMZ134736）購自中國典型培養物保藏中心。接種前12h制備成濃度1×106CFU/ml菌液，4℃冰箱保存備用。本研究經溫州市第七人民醫院實驗動物倫理委員會批準（倫理審批號：202004-007）。

1.1.2 實驗藥材與試劑 中藥材（均購自錄建藥業）；鹽酸左氧氟沙星（購自浙江京新藥業股份有限公司，生產批號：14202451919）；蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，HE染色）試劑盒（購自上海懋康生物科技有限公司，生產批號：MM1013）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β和γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）檢測試劑盒（購自上海極威生物科技有限公司，生產批號：JW-E12364、JW-E12359、JW-E12353、JW-E12363）；TLR4、髓樣分化蛋白88（myeloid differentiation protein 88，MYD88）、核因子κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物（由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成）；兔抗鼠TLR4、MYD88、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（phosphorylation NF-κB p65，p-NF-κB p65）、GAPDH單克隆抗體（一抗）、羊抗兔TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65、GAPDH辣根過氧化物酶標記多克隆抗體（二抗）（購自賽默飛，生產批號：2219S、ab135693、69994、3033、2188；31462、A16124、A16116、A16096、A16104）。

1.1.3 實驗設備 JS-750T型光學顯微鏡（購自德國LIOO）；FC型酶標儀（購自賽默飛）；H1650R型高速冷凍離心機（購自上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；7500型PCR儀（購自美國ABI）；PowerPacUniversal型電泳儀（購自美國伯樂）。

1.2 方法

1.2.1 普濟消毒飲制備 普濟消毒飲組方藥材：黃芩15g、黃連15g、陳皮6g、生甘草6g、玄參6g、柴胡6g、桔梗6g、連翹3g、板藍根3g、馬勃3g、牛蒡子3g、薄荷3g、僵蠶2g、升麻2g，加水常規煎煮2次，去除藥物殘渣，濃縮為1g/ml生藥[6]。

1.2.2 構建模型及驗證 將60只C57BL/6J小鼠分為對照組（10只）和建模組（50只）。根據既往研究采用經鼓膜穿刺途徑[7]構建慢性化膿性中耳炎小鼠模型。建模組小鼠麻醉后，雙側外耳道消毒；使用無菌注射器接半腰椎穿刺針，經鼓膜緊張部后下象限穿刺，向小鼠雙側耳鼓室注射1×106CFU/ml銅綠假單胞菌菌液100μl，每3d注射1次，共注射3次。HE染色觀察小鼠中耳黏膜組織病理切片，取對照組和建模組小鼠雙側中耳黏膜組織，常規石蠟包埋切片（4μm）；脫蠟脫水及水化，蘇木精染色5min；伊紅染色1min，脫透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察建模組中耳黏膜組織較對照組增厚，且炎癥細胞大量浸潤，證明造模成功[8]。

1.2.3 分組及給藥方法 將造模成功小鼠根據隨機數字表法分組，左氧氟沙星組（10只）給予1mg/（kg·d）左氧氟沙星灌胃，普濟消毒飲低、中、高劑量組（各10只）分別給予2.9g/（kg·d）、5.8g/（kg·d）、11.6g/（kg·d）普濟消毒飲濃縮液灌胃；模型組（9只）和對照組（9只）均予以等量生理鹽水灌胃，每日1次，持續14d。

1.2.4 血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平檢測 給藥結束后24h，脫頸處死各組小鼠，取腹主動脈血1.5ml，靜置30min分離獲取血清，根據試劑盒操作說明檢測各組小鼠的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平。

1.2.5 中耳黏膜組織病理觀察 給藥結束后24h，取左耳中耳黏膜組織，常規石蠟包埋切片（4μm），HE染色同上；光學顯微鏡觀察各組中耳黏膜組織病理切片。

1.2.6 TLR4、MYD88、NF-κB p65基因表達檢測 給藥結束后24h，取各組小鼠右耳1/2中耳黏膜組織，提取總RNA，逆轉錄合成互補脫氧核糖核酸，PCR引物序列見表1。反應條件：95℃ 5min；94℃ 15s，55℃ 30s，70℃ 30s，40個循環。以2–ΔΔCt[9]表示目的基因的相對表達量。

1.2.7 TLR4、MYD88、NF-κB p65蛋白表達及p-NF-κB p65水平檢測 給藥結束后24h，取右耳剩余1/2中耳黏膜組織，加入裂解液，4℃ 12 000轉/min（有效離心半徑7.1cm）離心10min，收集上清即為總蛋白；BCA法檢測蛋白濃度，調整蛋白濃度為5μg/μl；上樣6μl，電泳，轉膜，封閉，加一抗（稀釋比例1∶500）4℃孵育過夜，洗滌，加辣根過氧化物酶標記二抗（稀釋比例1∶2000），室溫孵育1h，洗滌，顯色5min，使用Image J分析蛋白條帶灰度值。

表1 PCR所需引物序列

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 建模結果

對照組小鼠的中耳黏膜組織無炎癥細胞浸潤；建模組小鼠的中耳黏膜組織可見大量炎癥細胞浸潤，見圖1。

2.2 各組小鼠中耳黏膜組織病理切片

對照組小鼠中耳黏膜組織正常，無炎癥細胞浸潤；模型組小鼠中耳黏膜增厚，可見大量炎癥細胞浸潤；左氧氟沙星組和普濟消毒飲低劑量組小鼠中耳黏膜增厚程度減弱，炎癥細胞浸潤減少；普濟消毒飲中劑量組小鼠黏膜增厚程度進一步減弱，炎癥細胞浸潤進一步減少；普濟消毒飲高劑量組小鼠中耳黏膜增厚及炎癥細胞浸潤基本消失，見圖2。

2.3 各組小鼠的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平比較

與對照組比較，模型組小鼠的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平上升（<0.05）；與模型組比較，左氧氟沙星組和普濟消毒飲低、中、高劑量組小鼠的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平降低（<0.05），且呈劑量依賴性，見表2。

圖1 小鼠中耳黏膜組織HE染色結果（×200，刻度尺：30μm）

圖2 各組小鼠中耳黏膜組織HE染色結果（×20，刻度尺：20μm）

2.4 各組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65基因表達比較

與對照組比較，模型組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65基因表達上調（<0.05）；與模型組比較，左氧氟沙星組和普濟消毒飲低、中、高劑量組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65基因表達下調（<0.05），且呈劑量依賴性，見表3。

2.5 各組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65蛋白表達及p-NF-κB p65水平比較

與對照組比較，模型組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65蛋白表達及p-NF-κB p65水平增加（<0.05）；與模型組比較，左氧氟沙星組和普濟消毒飲低、中、高劑量組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65蛋白表達及p-NF-κB p65水平下降（<0.05），且呈劑量依賴性，見圖3、表4。

3 討論

慢性化膿性中耳炎屬中醫學“膿耳”范疇。《諸病源候論·卷四十八》云：“耳，宗脈之所聚，腎氣之所通。小兒腎臟盛，而有熱者，熱氣上沖于耳，津液壅結，即生膿汁。”耳為腎竅，腎之精氣虧虛，寒熱之氣循經上犯耳竅，津液困結而成膿耳。又如《丹溪心法·卷四》云：“熱氣乘虛隨脈入耳，聚熱不散，膿汁出，為之膿耳。”外感風熱，上壅清竅，可致耳中流膿；故治療上以祛除風熱邪毒、補益正氣、宣通臟腑為主要原則。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平（，pg/ml）

注：與對照組比較，*<0.05；與模型組比較，#<0.05；與左氧氟沙星組比較，△<0.05；與普濟消毒飲低劑量組比較，▲<0.05；與普濟消毒飲中劑量組比較，※<0.05

表3 各組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65基因表達比較（）

注：與對照組比較，*<0.05；與模型組比較，#<0.05；與左氧氟沙星組比較，△<0.05；與普濟消毒飲低劑量組比較，▲<0.05；與普濟消毒飲中劑量組比較，※<0.05

圖3 各組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65蛋白表達及p-NF-κB p65水平

表4 各組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65蛋白表達及p-NF-κB p65水平比較（）

注：與對照組比較，*<0.05；與模型組比較，#<0.05；與左氧氟沙星組比較，△<0.05；與普濟消毒飲低劑量組比較，▲<0.05；與普濟消毒飲中劑量組比較，※<0.05

本研究結果顯示建模組小鼠中耳黏膜組織存在大量炎癥細胞浸潤，與既往研究病理情況一致[10]，證明本研究成功構建慢性化膿性中耳炎模型。左氧氟沙星可有效治療慢性化膿性中耳炎[11]；因此本研究選取左氧氟沙星作為陽性藥物，與普濟消毒飲形成對照實驗，確保研究的準確性和嚴謹性。本研究結果表明，普濟消毒飲可抑制中耳黏膜組織增厚，減輕炎癥因子浸潤。普濟消毒飲中黃芩、黃連共為君藥，清熱瀉火、祛上焦頭面熱毒；牛蒡子、連翹、薄荷、僵蠶共為臣藥，辛涼疏散頭面風熱；玄參、馬勃、板藍根加強清熱解毒，配甘草、桔梗以清利咽喉，陳皮理氣疏壅，以散邪熱郁結，共為佐藥；升麻、柴胡疏散風熱，并引諸藥上達頭面，功兼佐使之用。諸藥配伍，共奏清熱解毒、疏散風熱之功。研究表明普濟消毒飲通過抗菌、抗炎作用發揮抑制慢性化膿性中耳炎炎癥反應的功能[12]。

本研究結果表明，普濟消毒飲可下調小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平，抑制中耳黏膜組織TLR4、MYD88、NF-κB p65 mRNA和蛋白表達，下調p-NF-κB p65水平。有報道指出慢性化膿性中耳炎患者的TNF-α、IL-6水平升高，對維持機體全身和局部炎癥反應發揮重要作用[13]。TLR4識別微生物病原體相關分子后，可激活依賴性MYD88通路，活化的MYD88進一步激活NF-κB，進而促進促炎細胞因子轉錄，故TLR4/MYD88/NF-κB信號通路激活在炎癥疾病發病過程中發揮重要作用[14]。羅倫才等[15]指出，通過抑制TLR4/MYD88/NF-κB信號通路，可下調IL-1β、IL-6、TNF-α水平，減弱中耳炎的炎癥反應；Li等[16]認為抑制TLR4信號通路的激活能抑制分泌型中耳炎大鼠的炎癥反應；Liu等[17]提出過表達TLR4后可促進中耳上皮細胞炎癥反應。本研究結果與上述結論一致，提示普濟消毒飲可通過抑制TLR4/MYD88/NF-κB信號通路，下調p-NF-κB p65、TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平，發揮抑制慢性化膿性中耳炎炎癥反應的作用。

綜上所述，普濟消毒飲可通過抑制TLR4/MYD88/ NF-κB信號通路，下調TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平，發揮抑制慢性化膿性中耳炎炎癥反應的作用。

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Pujixiaodu decoction inhibits inflammatory reaction of chronic suppurative otitis media

LI Ruoman, LIN Xize, YE Haiji, ZHENG Huizhen

1.Department of Otolaryngology, Wenzhou Seventh People’s Hospital, Wenzhou 325000, Zhejiang, China; 2.Department of Otolaryngology, Wenzhou People’s Hospital, Wenzhou 325006, Zhejiang, China; 3.Department of Otolaryngology, Wencheng County People’s Hospital, Wencheng 325300, Zhejiang, China

To investigate the effect of Pujixiaodu decoction on inhibiting inflammatory reaction of chronic suppurative otitis media.Models of chronic suppurative otitis media were established by injecting Pseudomonas aeruginosa into the tympanic cavity via tympanic membrane puncture. After successful modeling, levofloxacin group was given 1mg/ (kg·d) levofloxacin by gavage, the low, medium and high dose Pujixiaodu decoction groups were given 2.9g/ (kg·d), 5.8g/ (kg·d) and 11.6g/ (kg·d) concentrated Pujixiaodu decoction by gavage, respectively, model group and control group were given the same amount of normal saline by gavage, once a day for 14 days.Levofloxacin and low, medium and high dose Pujixiaodu decoction can reduce the pathological changes of middle ear mucosa. Compared with model group, serum tumor necrosis factor-α, interleukin (IL) -6, IL-1β and interferon-γ levels of mice in levofloxacin group and low, medium and high dose Pujixiaodu decoction groups decreased (<0.05), Toll-like receptor 4 (TLR4), myeloid differentiation protein 88 (MYD88), nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65) gene expression and protein level and phosphorylation NF-κB p65 decreased (<0.05). The above indexes were dose dependent.Pujixiaodu decoction can inhibit the inflammatory response of chronic suppurative otitis media, which may be related to inhibition TLR4/MYD88/NF-κB signaling pathway.

Pujixiaodu decoction; Chronic suppurative otitis media; Toll-like receptor 4; Inflammatory response

R289；R276.1

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.19.019

溫州市科研項目（Y20201007）

鄭慧珍，電子信箱：devil888999123@163.com

（2022–09–29）

（2023–06–19）